Yavrunun cinsiyeti fekondasyonu oluşturan gametlerin taşıdığı cinsiyet kromozomlarının birleşmesiyle şekillenmektedir. Memelilerde, dişi cinsiyet kromozomları bakımından tek tip kromozom taşırken erkeklerde gametlerin %50 si X- dişilik cinsiyet kromozomu diğer %50 si de Y- erkeklik kromozomu taşımaktadır. Öyleyse, tek tip cinsiyet kromozomu taşıyan ovum X- spermle döllenirse yavru dişi, Y- spermle döllenirse yavru erkek olacaktır. Bu da demektir ki memelilerde cinsiyetin oluşumunu belirleyen erkektir. Bize kalan spermleri sağlıklı bir şekilde X- spermler ve Y- spermler olarak iki kısma ayırıp istediğimiz cinsiyetteki spermleri kullanarak doğacak yavrunun cinsiyetini belirlemektir.
Dünyanın kuruluşundan beri insanoğlu gerek insanlarda gerekse hayvanlarda istenilen cinsiyette yavru elde etmeyi arzulamıştır. Bu maksatla santrifüj, sedimentasyon, elektroforezis, seçici öldürme, basınç değişiklikleri, pH değişiklikleri, viskozite, filtrasyon gibi teknikler kullanılmış. Ama bu tekniklerin kullanılması bilim adamlarını hüsrana uğratmaktan öteye gitmemiştir.
Bu derlemenin amacı boğa spermlerinde uygulanan flov sitometre ile cinsiyeti belirlemenin en son gelişmeleri hakkında bilgi vermektir.
Spermatozoon DNA İçeriği
Fare sperminin DNA değişmezliği üzerine yapılan ilk çalışmalar ve diğer memelilerden elde edilen sonuçlar sperm başının düzleşmiş şeklinden dolayı açıklanamamaktadır{1,2. Pinkel ve ark.3'nın geliştirdiği spermi yönlendiren flov sitometrede, sperm başının düzleşmiş tarafı kullanılarak DNA içeriğinin kesin ölçümü başarılmıştır. Küçük, habloid kromozomlu olgun erkek gametleri DNA içeriği yönünden kesin olarak analiz edilebilir. Çünkü bu doğal özellik sağlıklı spermlerde sabittir. Spermlerin DNA muhteviyatının yüksek çözünürlükte ölçümü ilk defa sperm nukleusları veya membranları çıkarılmış spermatidlerin flov sitometrik analizi ile başarılmıştır3,4. Bu DNA ölçümünün kesinleşmesiyle bir memeli türünün X- ve Y- kromozomunu taşıyan spermleri arasındaki DNA içeriği farkı belirlenmektedir3,5. Spesifik bir bisbenzimidazole DNA-bağlayıcı boyası Hoechst 33342'nin kullanılmasıyla canlı spermlerde DNA ölçümü kesin olarak başarılmıştır6. Memelilerin X- ve Y- kromozomu taşıyan spermler arasındaki DNA içeriği farkının tam olarak ölçülmesi, ya X- ya da Y- kromozomlarını taşıyan canlı gametleri ayırmak için %85-95 doğruluk oranında etkili bir yöntem ortaya koymuştur7,8. Boğa spermlerinde X- kromozomunu taşıyan sperm, Y- kromozomunu taşıyan spermden %3.8 daha fazla DNA ihtiva ettiğinden spermin cinsiyeti flov sitometre ile belirlenebilmektedir. Söz konusu bu fark insanda %2.9, köpekte %3.9, atta %4.1, koyunda %4.2 dir9.
Flov sitometrik analiz metodu insan hariç birçok türde sperm cinsiyet oranını tayin etmek için etkili olarak kullanılmaktadır. İnsan spermleri daha çok köşeli ve yönlendirmeyi veya ortama alışmayı güçleştiren mermi şeklindeki başı ile tanımlanmaktadır. Aynı zamanda X- ve Y- kromozomları taşıyan bu spermler arasındaki DNA farkının % 3 den az olması analizdeki hassasiyetin artmasını gerekli kılmaktadır10.
Sperm ayırmadaki ilerlemeler iki esas alanda oluşmuştur. Birincisi birim zamanda tam olarak elde edilen cinsiyeti belli sperm sayısını arttırma, ikincisi spermlere daha az zarar veren yöntemlerin elde edilmesidir.
Flov Sitometre ile Sperm Cinsiyetinin Belirlenmesi Tekniği
Spermlerde DNA ölçümü için modifiye edilmiş flov sitometre ve spermleri ayırma sisteminin şematik çizimi Şekil 1'de gösterilmiştir. Erkek damızlıktan alınan sperma spesifik bir bisbenzimidazole DNA-bağlayıcı boyası Hoechst 33342 (Calbiochem, La Jolla, CA) ile bir saat süresince boyanır. Bu boyanmış spermler sıvı bir süspansiyon içerisinde basınçlı olarak flov sitometrenin tüpü içerisine yönlendirilir. Tüp içerisine giren spermler tüpün eğim verilmiş ucundan dışarı çıkarken kaplama sıvısı içerisine yönlendirilir. Sperm süspansiyonu ve kaplama sıvısı ikisi birlikte tüpün 76 µ'luk çıkış ucundan ayrılırken bu yöntem spermlerin laminar akış istikametini korur. Boyanmış spermler kısa dalga boylu bir lazer ışınına (Innova 90-5 Argon-ion laser. Coherent, Palo Alto, CA) maruz bırakıldığı zaman parlak mavi floresan ışığı yayar. Daha büyük DNA içeriği nedeniyle boyanmış X- spermler, Y-spermlerden daha parlak bir floresan gösterir. Bu yayılan floresandaki fark bir fotomultiplikatör (ışıl çoğaltıcı) tüp tarafından ölçülür ve anolog formattan dijital yani sayısal formata dönüştürülüp bir frekans dağılımı olarak bilgisayardan alınır. En fazla DNA içeriğini ölçmek için sisteme güçlü bir bilgisayar entegre edilir. Fakat, bütün spermler fotomultiplikatör tüpü içerisinden sıvı akışı ile birlikte geçerken kesin olarak belirlenemez. Spermleri ihtiva eden akıntı cihazın boşalma deliğinden dışarı çıkarken ayrı damlacıklar oluşturmak için yüksek frekansta, yaklaşık saniyede 90.000 defa titreştirilir. Bütün damlacıklar sperm ihtiva etmemesine rağmen dedektör tarafından temin edilen DNA içeriği bilgisine bağlı olarak pozitif veya negatif bir yükle yüklenirler. Birden daha fazla sperm ihtiva eden damlacıklara yük uygulanmaz. Daha sonra aksi yüklü saptırıcı levhalar tek akıntıyı 3 akıntıya ayırır. Pozitif olarak yüklenmiş X-spermleri taşıyan damlacıklar negatif yüklü saptırma levhası tarafına, negatif olarak yüklenmiş Y-spermleri taşıyan damlacıklar ise pozitif yüklü saptırma levhası tarafına yönlendirilir. Birden fazla sperm taşıyan veya cinsiyeti belirlenmemiş spermleri taşıyan yüklenmemiş damlacıklar ise hiç bir tarafa sapmadan dosdoğru çöpe gider9,10.
Büyütmek İçin Tıklayın |
Şekil 1: Spermlerde DNA ölçümü için modifiye edilmiş flov sitometre ve spermleri ayırma sisteminin şematik çizimi9,10. |
Sonuç olarak saniyede toplam 20.000 sperm cihazdan geçer ve her bir cinsiyet için saniyede takriben 4.000 canlı sperm eşzamanlı olarak ayrılabilir. Bugünkü geçerli sistem yaklaşık olarak her bir cinsiyet için saatte 10-13x106 canlı sperm üretebilir9.
Genellikle cinsiyeti belirlenmiş spermlerden 0.25 cm3/2-6 milyon sperm konularak hazırlanmış payetler kullanılarak yapılan tohumlamalardan yeterli dölverimi alınmaktadır. Cinsiyeti belli dondurulmuş sperma suni tohumlamada kullanılarak ilk yavru 1999 yılında elde edilmiştir11,12.
Cinsiyeti Belli Sperma Kullanmanın Faydaları
1- Cinsiyeti belli sperma kullanıldığı zaman sonucu %93 civarında tahmin edilebildiğinden düve veya boğa sayısını artırmak için uygun bir seçim olabilir.
2- Dişi buzağılar erkeklere göre genellikle daha küçük olduğundan cinsiyetin önceden belirlenmesi, düvelerin ilk doğumunda doğum güçlüklerini azaltmak dolayısıyla ana ve yavru ölümlerini engellemek için faydalı bulunmaktadır.
3- Sürüyü büyütmek veya yenilemek için dışarıdan inek alınmayacak ise çok sayıda üretilecek düveler arasından sürüye katılacak olanların seçilmesi şansını doğurur.
4- Sahip olunan çok sayıdaki bütün düvelerden en üstün %10-15 düzeyindekilerin seçilmesiyle inek sürüsünü geliştirme, daha iyi dişileri elde tutma ve daha hızlı bir genetik ilerleme imkanı sağlar.
5- Dışarıdan herhangi bir dişi getirmeden kapalı tutulan sürülerde istenmediği halde ortaya çıkan bir kısım sağlık problemleri azaltılabilir.
6- Bu teknoloji üreticilere seçim yapma şansını tanır ve ilerde oluşacak potansiyel bir pazar için bir strateji geliştirme imkanı sağlar. Yetiştirici damızlık düveleri, sürüde pedigri özelliklerine göre seçtikleri en iyi ineklerinden, etlik yapılacak veya öküz olarak kullanılacak boğaları ise sürünün geriye kalan ineklerinden elde edebilir.
7- Bazı yetiştiriciler dişi cinsiyetli sperma ile tohumlattıkları inek ve düvelerinin dişi buzağıya sahip olduğunu garanti ederek ve daha az doğum güçlükleri görüleceğini bildirilerek değerinden fazla fiyata satabilirler.
Cinsiyeti Belli Sperma Üretiminde ve Yaygınlaşmasında Karşılaşılan Olumsuzluklar
Cinsiyeti belli sperma, iyi yönetilen suni tohumlama programlarında ve embriyo transferi çalışmalarında en yüksek başarı oranıyla oldukça etkindir. Fakat, cinsiyeti belli bir payet sperma hazırlamanın payet içerisindeki sperm sayısına bağlı olarak 35-60 dolara mal olması fazla kar sağlamamaktadır. Farklı boğaların spermaları ayırma cihazlarından farklı şekilde geçmekte olup bazı boğalar diğerine göre cinsiyeti belli sperma için daha iyi adaydırlar11.
Başarılı sperma ayırma işlemlerinde gametlerle ilgili hassasiyet dikkate alındığında; DNA boyama boyası Hoechst 33342'nin kromozom saptırmalarına yönelik etkisi, spermlerin lazer ışınına maruz kalması, yüksek sulandırma oranı, santrifüj edilmesi, medyumdaki değişikliklere maruz kalması, flov sitometrenin çıkış deliğinden yüksek hızla çıkması, ayırma işleminin uzun sürmesi ve spermlere yüksek basınç uygulanması gibi birtakım faktörler göz ardı edilmemelidir12.
Cinsiyeti belirlenmiş spermanın kullanılması son zamanlarda birçok yetiştirici için bir gerçek olmuştur. Böylesi bir çalışmanın ülkemizde de uygulamaya konulmasıyla yetiştiricilerin amaçları doğrultusunda istediği cinsiyette yavru elde etme arzusunun gerçekleşmesi sağlanacaktır.
)
