Gereç ve Yöntem: 4 hafta boyunca intraperitoneal nitrik oksit sentaz (NOS) inhibitörü, L-NAME ve içme suyuyla %1 tuz verilerek HT oluşturuldu. Perindopril (2 mg/kg/gün), losartan (2 mg/kg/gün), novokinin (0.1 mg/kg/gün) son 2 hafta boyunca intraperitoneal uygulandı. Renin, AT1, AT2, ADE1, ADE2, aldosteron düzeyleri böbrek dokusunda ELİSA ile ölçüldü.

Bulgular: Novokinin, perindopril ve losartan tedavisi alan gruplarda ADE2 ve AT2 reseptör seviyesinde böbrek dokusunda anlamlı artış gözlemlenirken aldosteron seviyesinde ise anlamlı azalma görüldü.

Sonuç: AT2 reseptör agonist novokinin'in böbrek dokusu da koruyucu etkilerinin olabileceği düşünülebilir. Hipertansiyonun tedavisinde ve hedef organ hasarını önlemede AT2 agonistlerinin potansiyel yararlarını sergileyebilmek için daha fazla çalışmalara ihtiyaç vardır.

Ang II'nin diğer bir reseptörü olan anjiotensin tip 2 (AT2) reseptörünün uyarılması vazodilatör, antiproliferatif, proapoptotik, antihipertrofik, antiaritmik, antitrombotik etkiler gösterir⁵

Aldosteronun AT1 reseptörü gibi tek başına NADPH oksidaz enzimi indükleyici ve organ patoloji gelişimini provake edici etkileri olduğu belirtilmiştir⁶. Yine aldosteronun NADPH oksidaz enzimini modüle ederek proinlamatuvar ve profibrotik etkiler gösterdiği direkt organ hasarına sebep olabildiği literatürde bildirilmektedir⁷.

Lokal Ang II sentezinin keşfi, yeni Ang II metabolit ve reseptörleri renal ve kardiyovasküler hastalıkların tedavisinde yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesinin mümkün olabileceğini ortaya koymaktadır. Örneğin ADE2/Ang(1-7)/Mas ve Anjiotensin tip 2 (AT2) reseptör ekseni, AT1 reseptör aktivasyonuyla meydana gelen etkilere zıt yönde etkiler gösterir⁸.

ADE2 AngII'yi Ang(1-7)'e çeviren bir monokarboksipeptidazdır. Ang II‘nin yıkımını sağlayarak bu mediatörün AT1 reseptörü aracılığıyla toksik etkilere sebep olmasını engelleyebilmektedir. Ayrıca ADE2 nin ürettiği Ang(1-7), Mas reseptörünü indükleyerek vazodilatatör, natriüretik, antiproliferatif, antihipertrofik, antifibrotik etkiler göstererek ve bradikinin NO sisteminin stimulasyonuna sebep olarak AT1 reseptörünün zararlı etkilerini antagonize edebilmektedir⁹. ADE2 vazokonstriktif, hipertrofik, proliferatif etkiler gösteren Ang II'nin Ang(1-7)'ye dönüşümünde esas rolü almasına bağlı olarak bu enzimin hipertansiyon, kardiyovasküler ve renal hastalıkların fizyopatolojisinde anahtar olabileceği ortaya atılmıştır¹⁰. Son deneysel ve klinik çalışmalar serum veya idrardaki ADE2 düzeyinin kardiorenal hastalıkların diagnoz ve prognozunun tayininde yeni biyomarker gibi kullanılabileceğini konusunda kanıtlar sağlamıştır.

Novokinin, AT2 reseptör agonisti, potent hipotansif bir peptiddir¹¹. Novokinin'in spontan hipertansif sıçanlarda 0.1 mg/kg dozda oral uygulanarak kan basıncını anlamlı şekilde düşürdüğü gözlenmiştir¹². AT2 reseptör antagonisti PD123319 verildiğinde hipotansif etkisi bloke olmuştur¹². Ayrıca AT2 reseptör defisit farelerde, novokinin hipotansif etki gösterememiştir. Novokinin spontan hipertansif sıçan mesenterik arterlerinde AT2 reseptörü aracılığıyla vazodilatör etki göstermiştir¹². Mesenterik arterlerdeki vazodilatör etkisi PD123319, siklooksijenaz inhibitörü indometazin ve prostaglandin reseptör antagonisti CAY10441 tarafından anlamlı şekilde bloke edilmiştir¹².

AT2 reseptör agonisti olan novokinin'in renin, ADE1, ADE2, AT1, AT2, aldosteron gibi RAAS komponentleri üzerine etkisini inceleyen yeterince araştırma bulunmamaktadır. Bu çalışmada novokinin'in L-NAME ve tuz uygulanan NO blokajı ve tuz yüklemesi ile HT oluşturulan. sıçanlarda renal dokuda RAAS komponentleri üzerine etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. AT1R antagonisti losartanın, ADE inhibitörü perindoprilin ve AT2R agonisti novokinin'in bu parametrelere etkisi karşılaştırmalı olarak incelendi.

Her bir grupta 7 sıçan olacak şekilde 5 gruba ayrıldı (n=35).

1. Grup: Kontrol; serum fizyolojik (0.5 cc/gün i.p. 4 hafta boyunca)

2. Grup: Hipertansiyon (HT); Sıçanlara 4 hafta boyunca içme suyunda %1 tuz ve 40 mg/kg/gün dozda L-NAME i.p. verildi.

3. Grup: HT + perindopril; Sıçanlara 4 hafta boyunca içme suyunda %1 tuz ve 40 mg/kg/gün dozda L-NAME i.p. verildi. İkinci haftadan sonra perindopril 2 mg/kg/gün i.p. 2 hafta verildi^13,14.

4. Grup HT + Losartan; Sıçanlara 4 hafta boyunca içme suyunda %1 tuz ve 40 mg/kg/gün dozda L-NAME i.p. verildi. İkinci haftadan sonra losartan 2 mg/kg/gün i.p. 2 hafta boyunca uygulandı^14-15.

5. Grup HT + Novokinin; Sıçanlara 4 hafta boyunca içme suyunda %1 tuz ve 40 mg/kg/gün dozda L-NAME i.p. verildi. İkinci haftadan sonra novokinin 0.1 mg/kg/gün i.p. 2 hafta boyunca uygulandı¹¹.

Biyokimyasal Analizler: Renin (Eastbiopharm Katolog No: CK-E30226), ADE1 (Eastbiopharm Katolog No: CK-E30669), ADE2 (Sun Red Katolog No: 201-11-0814), Aldosteron (Cusabio Katolog No: CSB-607025), AT1 (Sunred Katolog No: 201-11-1635), AT2 (Eastbiophram Katolog No: E90206) düzeyleri böbrek dokusunda ELİSA ile ölçüldü.

Kullanılan Kimyasallar: L-NAME, Perindopril, Losartan, novokinin (Sigma Aldrich Inc.St. Louis, MO. A.B.D) firmasından satın alındı.

İstatistiksel Analiz: Elde edilen veriler ortalama (ort) ± standart hata (SH) olarak belirtildi. Ortalamalar arasındaki farkların istatistiksel anlamlılık düzeylerini belirlemek için paket istatistik programı kullanıldı. İstatistiksel farklar bağımsız gruplarda “one-way ANOVA” ve “independent-t” testleri ile hesaplandı. Aynı grubun farklı zaman noktalarındaki değerleri arasındaki fark değerlendirmek için “paired t test” kullanıldı. Elde edilen sonuçların yorumlanmasında P<0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: Böbrek dokusunda AT2 reseptör düzeyleri a, Kontrol grubuna göre anlamlı; P<0.05

ADE2 enzim düzeyleri perindopril, novokinin ve losartan tedavisi alan gruplarda hipertansiyona göre anlamlı yüksekti (Şekil 2).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 2: Böbrek dokusunda ADE2 düzeyleri a, Hipertansiyon grubuna göre anlamlı; P<0.05

Hipertansiyon grubunda aldosteron düzeyi kontrole göre artış göstermekle birlikte istatistiksel anlamlılığa ulaşamadı. Aldosteron düzeyleri novokinin perindopril ve losartan uygulanan gruplarda hipertansiyona göre anlamlı düşüktü (Şekil 3).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 3: Böbrek dokusunda aldosteron düzeyleri a, Hipertansiyon grubuna göre anlamlı; P<0.05

ADE1, renin ve AT1 reseptör düzeylerinde gruplar arası anlamlı fark görülmedi.

Yapılan çalışmanın önemli bir bulgusu; L-NAME ve tuz alan grupta böbrek dokusunda ADE2 düzeyininin azalma eğiliminde olduğu gözlemlenirken, novokinin, perindopril ve losartan uygulamasının ADE2 düzeyini yükseltmesiydi. Önceki araştırmalar ADE2 enziminin böbrek dokusunda yüksek seviyede eksprese olduğunu, özellikle tubuler epitelyal hücrelerde, glomeruler epitelyal hücrelerde ve renal damarlarda lokalize olduğunu ortaya çıkarmıştır¹⁶. ADE2 aktivitesinin diabetik böbrek hastalıkları, hipertansif böbrek hastalıklarında ve farklı renal hasar modellerinde değiştiği gösterilmiştir. Spontan hipertansif sıçanlarda yapılan bir çalışmada böbrek ADE2 ekspresyonun düşük olduğu belirlenmiştir¹⁷. Başka bir araştırmada ADE2 nin böbrek düzeyinin hipertansiyon başlangıcından önce değiştiği rapor edilmiştir¹⁸. Deneysel hipertansiyon modelinde ARB'lerin ve ADE inhibitörlerinin herikisinde renal kortikal dokuda ADE2 ekspresyon düzeyini artırdığı gözlemlenmiştir¹⁹. 2 böbrek 1 klip modelliyle oluşturulan hipertansif sıçanlarda, renal ADE2 mRNA düzeyinin ve aktivitesinin düştüğü, buna karşın ADE ekspresyonun arttığı, bu artışın ise Ang II yapımını yükselterek ADE2 düzeyinde düşüşe sebep olduğu belirtilmiştir²⁰. Yüksek tuz diyeti alan obez sıçanlarda yapılan bir çalışmada ise ADE2/AT2R/MasR ekspresyonunun renal kortikal dokuda düştüğü buna karşın Ang II seviyesinin ise arttığı bildirilmiştir²¹. ADE2 ekspresyonundaki düşüşün belirgin AngII/AT1 düzeyindeki artışa bağlı olabileceği sonucuna varılmıştır. Bernardi ve ark.²⁰ tarafından yapılan bir çalışmada ise yüksek tuz diyetinin glomeruler ADE/ADE2 mRNA ve protein düzeyini arttığı, bu artışın ise tuz diyetinin sebep olduğu oksidatif stresle ilişkili olabileceği ayrıca ADE/ADE2 oranının tuza bağlı renal hasarların değerlendirilmesinde kullanılabileceği kabul edilmiştir. Bu çalışmada da hipertansif grupta ADE2 düzeyinin azalması L-NAME ve tuzun neden olduğu oksidatif stres artışının sonucuna bağlı olduğu önceki çalışmalar ışığında önesürülebilir.

ADE2 AngII'yi Ang(1-7)'e çeviren bir monokarboksipeptidazdır. Ang II‘nin yıkımını sağlayarak bu mediatörün AT1 reseptörü aracılığıyla toksik etkilere sebep olmasını engelleyebilmektedir. Ayrıca ADE2 nin ürettiği Ang(1-7) Mas reseptörünü indükleyerek vazodilatatör, natriüretik, antiproliferatif, antihipertrofik, antifibrotik etkiler göstererek ve bradikinin NO sisteminin stimulasyonuna sebep olarak AT1 reseptörünün zararlı etkilerini antagonize edebilmektedir⁹. Bu bağlamda ADE2 enzimi organ koruyucu etkide kritik role sahiptir²². Bizim çalışmamızda perindopril ve losartan RAAS'ı baskılayarak bu sistemin zararlı komponentlerinin ADE2 düzeyini azaltmasını engellemiş olduğu söylenebilir. İlaveten perindopril ve losartanın oksidatif stresi azaltmasınında ADE2 seviyesinin yükselmesinde bir etken olduğu kabul edilebilir. Perindopril ve losartanın ADE2 seviyesini artırması bu ilaçların organ koruyucu efektivitesinde önemli rol oynayabileceğini önceki çalışmalarla bizim bulgularımızı birleştirerek ortaya koyabiliriz. Ayrıca novokinin de renal ADE2 enzim seviyesini anlamlı artırmıştır. Bu bulgununda yapılan araştırmanın ortaya koyduğu yeni ve farklı sonuçlardan biri olduğu söylenebilir. AT2 reseptör agonisti novokinin'in antioksidan etkisinin bulunması renal ADE2 düzeyini artırması için bir neden olduğu öne sürülebilir. Novokinin ADE2/Ang(1-7)/Mas reseptör yolağını yani RAAS'ın faydalı kısmını indükleyerek AT1 reseptör aracılığıyla meydana gelen toksik etkileri bozabilir ve böylece organ koruyucu etki sağlayabilir.

Böbrek dokusunda AT2 reseptör düzeyleri perindoril ve losartan uygulanan gruplarda artış gösterdi. ADE/AngII/AT1 reseptör ekseniyle ADE2/Ang(1-7/Mas ve AT2 reseptör ekseni arasında negatif korelasyon olduğu bilinmektedir. Perindopril ve losartan ADE/AngII/AT1 reseptör eksenini yani RAAS'ın zararlı tarafını baskılayarak ADE2/Ang(1-7/Mas ve AT2 reseptör eksenini yani RAAS'ın faydalı kısmının düzeyini artırmış olabilir. Novokinin oksidatif stres ve RAAS'ın toksik bileşenlerin yerel aktivasyonunu azaltabilir, böylece novokinin böbrek dokusunda AT2 reseptör düzeyini artırabilir. Bu bulgu, kardiyak ve böbrek hastalıklarında novokinin terapötik değeri olup olmadığının tespiti için önemli olabilir.

Mevcut çalışmanın diğer bulgusu L-NAME ve tuz alan grupta, böbrekte aldosteron seviyesi yükselmesi, perindopril, novokinin ve losartan tedavisi alan grupta bu artış önlenmesidir. L-NAME ve tuz indüklü hipertansiyon modeliyle RAAS aktivasyonu arasındaki pozitif korelasyon ele alındığında, aldosteron seviyesindeki yükselme literatürdeki diğer araştırmalarla paralel bir sonuç olarak görülmektedir. AT2 reseptörünün antioksidan etkisi^23,24 dolayısıyla novokinin RAAS'ın yerel aktivasyonunu engellemiş ve böbrek dokusundaki aldosteron seviyesini düşürmüş olabilir. Bu sonuç mevcut çalışmanın bir diğer önemli bulgusu olabilir. Çünkü aldosteron reaktif oksijen ürünleri (ROS) üretimi için gerekli olan NADPH oksidaz enziminin büyük altbirim olan p22phox seviyelerinde artışı indüklediği, oksidatif stres üzerine doğrudan etkisi olduğu tespit edilmiştir⁶. Aldosteron pro-enflamatuar ve pro-fibrotik etki gösterir; NADPH oksidaz aktivasyonu ile aldosteronun neden olduğu oksidatif stres hedef hücre ve organ hasarına sebep olabilmektedir⁷. Novokinin aldosteron seviyesini azaltma yeteneği sayesinde oksidatif stresi ve böbrek hasarı gelişimini azaltabilir. Benzer şekilde perindopril ve losartanın aldosteron seviyesini düşürmesi de bu ilaçların organ koruyucu etkisindeki diğer bir faktör olduğu söylenebilir.

Hipertansiyon kaynaklı kardiyovasküler ve böbrek hastalıkları tüm dünyada en yaygın ölüm nedenidir. RAAS bu hastalıkların tedavisinde önemli bir hedef olmuştur. Bununla birlikte, ADE inhibitörleri veya ARB'ler ile RAAS blokajı yapılmakta ancak karşıt düzenleyici mekanizmalar nedeniyle yeterli başarı sağlanamamaktadır. Bu nedenle RAAS ile ilişkili yeni farmakolojik yaklaşımlar denenmektedir. Örneğin novokinin gibi AT2 reseptör agonistleri böbrek gibi hedef organlarda koruma sağlayabilir. AT2 reseptör agonistleri ADE inhibisyonu veya AT1 reseptör blokörleri ile kombine edilebilir; Ang II ve aldosteron üretimini, AT1 reseptör aracılı toksik etkileri bozabilirler.

AT2 reseptör agonisti olan novokinin'in L-NAME ve tuz uygulanan sıçanlarda renin, ADE1, ADE2, AT1, AT2, aldosteron seviyelerine böbrek dokusundaki etkisi bu çalışmada araştırılmıştır. Çalışma sonuçlarına göre novokinin ADE2 ve AT2 seviyesini artırırken aldosteron düzeyini ise düşürmüştür. Bu sonuçlar yeni çalışmalara ihtiyaç olmakla birlikte novokinin'in böbrek dokusu da koruyucu etkilerinin olabileceğini düşündürmektedir.

1) Jenum AK, Anderssen SA, Birkeland KI, et al. Promoting physical activity in a low-income multiethnic district: Effects of a community intervention study to reduce risk factors for type 2 diabetes and cardiovascular disease: A community intervention reducing inactivity. Diabetes Care 2006; 29: 1605-1612.

2) Lizakowski S, Tylicki L, Rutkowski B. Direct renin inhibition--a promising strategy for renal protection? Med Sci Monit 2013; 19: 451-457.

3) Escobar C, Echarri R, Barrios V. Emerging drug combinations to optimize renovascular protection and blood pressure goals. Int J Nephrol Renovasc Dis 2012; 5: 69-80.

4) Bohm M. Angiotensin receptor blockers versus angiotensin-converting enzyme inhibitors: Where do we stand now? Am J Cardiol 2007; 100: 38-44.

5) Probstfield JL, O'Brien KD. Progression of cardiovascular damage: The role of renin-angiotensin system blockade. Am J Cardiol 2010; 105: 10-20.

6) Park YM, Lim BH, Touyz RM, Park JB. Expression of NAD(P)H oxidase subunits and their contribution to cardiovascular damage in aldosterone/salt-induced hypertensive rat. J Korean Med Sci 2008; 23: 1039-1045.

7) Oberleithner H. Aldosterone makes human endothelium stiff and vulnerable. Kidney Int 2005; 67: 1680-1682.

8) Kanda T, Itoh H. The ACE2/Ang(1-7)/Mas receptor axis in cardiovascular and renal diseases. Nihon Rinsho 2012; 70: 1487-1491.

9) Iwai M, Horiuchi M. Devil and angel in the renin-angiotensin system: ACE-angiotensin II-AT1 receptor axis vs. ACE2-angiotensin-(1-7)-Mas receptor axis. Hypertens Res 2009; 32: 533-536.

10) Varagic J, Ahmad S, Nagata S, Ferrario CM. ACE2: angiotensin II/angiotensin-(1-7) balance in cardiac and renal injury. Curr Hypertens Rep 2014; 16: 420.

11) Yamada Y, Yamauchi D, Usui H, et al. Hypotensive activity of novokinin, a potent analogue of ovokinin(2-7), is mediated by angiotensin AT(2) receptor and prostaglandin IP receptor. Peptides 2008; 29: 412-418.

12) Yamada Y, Yamauchi D, Yokoo M, et al. A potent hypotensive peptide, novokinin, induces relaxation by AT2- and IP-receptor-dependent mechanism in the mesenteric artery from SHRs. Biosci Biotechnol Biochem 2008; 72: 257-259.

13) Cousin M, Custaud MA, Baron-Menguy C, et al. Role of angiotensin II in the remodeling induced by a chronic increase in flow in rat mesenteric resistance arteries. Hypertension 2010; 55: 109-115.

14) Griffiths CD, Morgan TO, Delbridge LM. Effects of combined administration of ACE inhibitor and angiotensin II receptor antagonist are prevented by a high NaCl intake. J Hypertens 2001; 19: 2087-2095.

15) Murali B, Goyal RK. Effect of chronic treatment with losartan on streptozotocin induced diabetic nephropathy. Clin Exp Hypertens 2001; 23: 513-520.

16) Soler MJ, Wysocki J, Batlle D. ACE2 alterations in kidney disease. Nephrol Dial Transplant 2013; 28: 2687-2697.

17) Zhong JC, Huang DY, Yang YM, et al. Upregulation of angiotensin-converting enzyme 2 by all-trans retinoic acid in spontaneously hypertensive rats. Hypertension 2004; 44: 907-912.

18) Tikellis C, Cooper ME, Bialkowski K, et al. Developmental expression of ACE2 in the SHR kidney: A role in hypertension? Kidney Int 2006; 70: 34-41.

19) Jessup JA, Gallagher PE, Averill DB, et al. Effect of angiotensin II blockade on a new congenic model of hypertension derived from transgenic Ren-2 rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2006; 291: 2166-2172.

20) Bernardi S, Toffoli B, Zennaro C, et al. High-salt diet increases glomerular ACE/ACE2 ratio leading to oxidative stress and kidney damage. Nephrol Dial Transplant 2012; 27: 1793-800.

21) Samuel P, Ali Q, Sabuhi R, Wu Y, Hussain T. High Na intake increases renal angiotensin II levels and reduces expression of the ACE2-AT(2)R-MasR axis in obese Zucker rats. Am J Physiol Renal Physiol 2012; 303: 412-419.

22) Ma C, Xin H, Jiang XY, Wang YX, Zhang YS. Relationship between renal injury and the antagonistic roles of angiotensin-converting enzyme (ACE) and ACE2. Genet Mol Res 2014; 13: 2333-2342.

23) Rehman A, Leibowitz A, Yamamoto N, et al. Angiotensin type 2 receptor agonist compound 21 reduces vascular injury and myocardial fibrosis in stroke-prone spontaneously hypertensive rats. Hypertension 2012; 59: 291-299.

24) Sabuhi R, Ali Q, Asghar M, Al-Zamily NR, Hussain T. Role of the angiotensin II AT2 receptor in inflammation and oxidative stress: Opposing effects in lean and obese Zucker rats. Am J Physiol Renal Physiol 2011; 300: 700-706.