Çalışmada 8-10 haftalık erişkin Wistar Albino cinsi erkek sıçanlar kullanıldı. Sıçanlar bulundukları ortamın sıcaklığı 22–25 ⁰C arasında sabit ortamda ve 12 saat ışık, 12 saat karanlıkta takip edildi. Sıçanlar havalandırma sistemi bulunan bir ortamda özel olarak hazırlanmış ve her gün altları temizlenen kafeslerde beslendi. Yemler özel çelik kaplarda, su ise paslanmaz çelik bilyeli biberonlarda normal çeşme suyu olarak verildi.
Çalışmada kullanılan 24 adet Wistar Albino cinsi erkek sıçanlar; Kontrol, Sham, I-R ve IR+NAS olmak üzere 4 gruba ayrıldı. Kontrol grubuna deney süresince herhangi bir işlem yapılmadı. Sham grubundaki sıçanlar supine pozisyonda sabitlenip servikal orta hatta basit bir insizyonla bilateral karotis kommunis arterler ortaya çıkarıldıktan sonra ciltleri 3/0 ipek ile kapatıldı ve deneyin 3. saatinde dekapite edildi.
I-R grubundaki sıçanlar supine pozisyonda sabitlenip servikal orta hattan basit bir insizyonla bilateral karotis kommunis arterler ortaya çıkarıldıktan sonra anevrizma klipsleri ile 60 dakika süre ile klemplendikten sonra klipsler açılarak 120 dakika reperfüzyon sağlandıkan sonra dekapite edildi. I-R+NAS grubundaki sıçanlar ise supine pozisyonda sabitlenip servikal orta hattan basit bir insizyonla bilateral karotis kommunis arterler ortaya çıkarıldıktan sonra anevrizma klipsleri ile 60 dakika süre ile klemplendikten sonra klipsler açıldı ve klipslerin açılmasıyla birlikte tek doz 50 mg/kg N-Asetilsistein intraperitoneal olarak uygulanıp 120 dakika reperfüzyon sağlandıktan sonra dekapite edildi.
Deney sonunda tüm gruplardaki sıçanlar dekapite edildikten sonra beyin dokuları çıkarılıp %10’luk formaldehit solüsyonunda tespit edilip histolojik takip serilerinden geçirildikten sonra parafin bloklara gömüldü. Serum TAS ve TOS çalışması için alınan serumlar çalışma gününe kadar –80 ⁰C saklandı.
Total Antioksidan Seviye (TAS) ve Total Oksidan Seviye (TOS) Ölçümleri: Serum TAS ve TOS düzeyleri Olympus AU2700 otoanalizöründe Rel Assay Total Antioksidan Status Test Kiti (Mega Tıp San. ve Tic. Ltd. Şti., Gaziantep, Türkiye) kullanılarak ölçüldü 18,19.
İmmünohistokimya: Parafin bloklardan 4–6 µm kalınlığında alınan kesitler polilizinli lamlara alındı. Deparafinize edilen dokular dereceli alkol serilerinden geçirilip antigen retrieval için sitrat tampon solüsyonunda pH:6’da mikrodalga fırında (750W) 7+5 dakika kaynatıldı. Kaynatma sonrası oda ısısında yaklaşık 20 dakika soğutmak için bekletilen dokular PBS (Phosphate Buffered Saline, P4417, Sigma-Aldrich, USA) ile 3x5 dakika yıkandıktan sonra endojen peroksidaz aktivitesini önlemek için hidrojen peroksid blok solusyonu ile 5 dakika inkübe edildi (Hydrogen Peroxide Block, TA-125-HP, Lab Vision Corporation, USA). PBS ile 3x5 dakika yıkanana dokulara zemin boyasını engellemek için 5 dakika Ultra V Block (TA–125-UB, Lab Vision Corporation, USA) solüsyonu uygulandıktan sonra 1/200 oranında dilue edilen adropin primer antikor (anti-adropin antibody, ab122800, Abcam, Cambridge, UK) ile 60 dakika nemli ortamda oda ısısında inkübe edildi. Dokular, primer antikor uygulanmasından sonra PBS ile 3x5 dakika yıkandıktan sonra sekonder antikor (biotinylated Goat Anti-Poliyvalent (anti-mouse / rabbit IgG), TP–125-BN, Lab Vision Corporation, USA) ile 30 dakika nemli ortamda oda ısısında inkübe edildi. Dokular, sekonder antikor uygulanmasından sonra PBS ile 3x5 dakika yıkanıp Streptavidin Peroxidase (TS–125-HR, Lab Vision Corporation, USA) ile 30 dakika nemli ortamda oda ısısında inkübe edildikten sonra PBS içerisine alındı. Dokulara 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) Substrate + AEC Chromogen (AEC Substrate, TA-015 ve HAS, AEC Chromogen, TA-002-HAC, Lab Vision Corporation, USA) solusyonu damlatılıp ışık mikroskobunda görüntü sinyali alındıktan sonra eş zamanlı olarak PBS ile yıkamaya alındı. Mayer’s hematoksilen ile zıt boyaması yapılan dokular PBS ve distile sudan geçirilerek uygun kapatma solusyonu (Large Volume VisionMount, TA-125-UG, Lab Vision Corporation, USA) ile kapatıldı. Hazırlanan preparatlar Leica DM500 mikroskobunda incelenerek değerlendirildi ve fotoğraflandı (Leica DFC295).
Boyamada immünreaktivitenin yaygınlığı (0.1: <%25, 0.4: %26-50, 0.6: %51-75, 0.9: %76-100) ve şiddeti (0: yok, +0.5: çok az, +1:az, +2: orta, +3:şiddetli) esas alınarak histoskor oluşturuldu (Histoskor= yaygınlık x şiddet).
İstatistiksel Analiz: %80 güç ve 0,05 anlamlılık seviyesinde güç analizi yapıldığında her bir grupta en az 6 denek olması gerektiği hesaplanmıştır. Elde edilen veriler ortalama standart sapma olarak belirlendi. İstatistiksel analiz için SPSS version 22 programı kullanıldı. Ölçülen değerlerin hassasiyet göstermesi ve örneklem hacminin büyütülmesi çalışma bütçesini aşacağından ve ayrıca ölçümlerin parametrik test varsayımlarını sağladığı da görüldüğünden dolayı gruplar arası karşılaştırmalar için One-way ANOVA ve post-hoc test olarak Tukey testi kullanıldı. p0.05 değerler istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
)
)
)
