Yapılan literatür taramasında birçok bakteride spesifik fajların varlığı ve tedavide kullanılabilirlikleri ile ilgili araştırmaların yapıldığı ancak Arkobakter türlerine spesifik fajların varlığını ortaya koyan bir çalışmanın olmadığı görülmüştür. Bu amaçla yapılan bu çalışmada Bingöl ve çevresindeki mevcut tavuk kümesleri ve sığır çiftliklerinin bulunduğu yerlerden toplanan toprak, atık su, altlık, dışkı gibi çevresel örneklerden A. butzleri türüne spesifik litik etkili fajların varlığı araştırıldı.

Bakteriyofaj İzolasyon Kaynakları: Bingöl ve çevresindeki mevcut tavuk kümesleri ve sığır çiftliklerinin bulunduğu yerler belirli periyotlarla üç kez ziyaret edilerek toprak, altlık, atık su ve dışkı örnekleri toplandı. Toprak, altlık ve dışkı örnekleri steril örnek toplama kaplarına, atık sular ise steril şişelere aktarılarak en kısa sürede aseptik şartlarda ve soğuk zincir altında laboratuvara taşındı. Çalışmada her bir numuneden 200 adet olmak üzere toplam 800 örnek, A. butzleri’ye spesifik fajlar yönünden incelendi.

Bakteriyofaj İzolasyonu: Toplanan örneklerden bakteriyofaj izolasyonu için aşağıda açıklanan protokol uygulandı ^12,13.

1. Laboratuvara getirilen atık su örneklerinin her birinden 200 ml alınarak 3600 rpm’de 20 dk süreyle santrifüj edildi. Altlık ve dışkı örnekleri ise 10 g/mL olacak şekilde önce Tryptic Soya Broth (TSB) besi yerinde (Merck 1.054559) ön zenginleştirmeye tabi tutularak 37 °C’de 24 saat inkübasyona bırakıldı. İnkubasyon takiben örnekler 3600 rpm’de 20 dk santrifüj edilerek süpernatant elde edildi.

2. Elde edilen süpernatant, sırasıyla 0.45 μL ve 0.22 μL’lik steril şırıngalı filtrelerden (Whatman) geçirilerek süzüldü.

3. Süzülen sıvı üzerine 8 mL %50 polietilen glikol (PEG) 8000, 4 mL 5M NaCI ve 1 mL distile su ilave edildi.

4. Hazırlanan karışım 1 dk süreyle vortekslendikten sonra 24 saat boyunca +4 °C’de bekletildi.

5. Bir gecelik inkübasyonun ardından karışım 5800 rpm‘de 90 dk santrifüj edildi. Santrifüj sonrası üstteki süpernatantlar atılarak tüplerin dibindeki peletler 1 mL steril Tris-EDTA (TE) buffer ile sulandırıldı.

Arcobacter butzleri Konakçı Kültürünün Hazırlanması: Bu çalışmada ATCC (American Type Culture Collection) 49616 A. butzleri referens suşu kullanıldı. A. butzleri konakçı kültürü için 50 mL’lik falcon tüplere 20’şer mL TSB besi yeri hazırlanarak taksim edildi. Sterilite kontrolü için sıvı besi yerleri bir gece 37 °C’de 24 saat inkübasyona bırakıldı. İnkübasyonu takiben steril TSB’ye A. butzleri bakteri stoğundan 1 mL ilave edilerek 37 °C 250 rpm’de çalkalamalı etüvde inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonrası çoğaltılan konak bakteriden 5 mL alınarak yeni bir steril TSB sıvı besi yerine ekim yapıldı. Çalkalamalı etüvde 37 °C’de 4 saat inkübe edildikten sonra konakçı bakteri, faj ile birlikte besi yerine ekilmeye hazır hale getirildi.

Çift Tabakalı Agar Yöntemiyle Bakteriyofaj Tespiti: Bakteriyofaj plaklarının görüntülenebilmesi için çift tabakalı agar yöntemi kullanıldı. Öncelikle konak bakteri ve şüpheli faj solüsyonunun gömüleceği yumuşak agar hazırlandı. Bu amaçla 100 mL yumuşak agar için; 1 g Tryptone (Lab M), 1 g NaCl (Merck), 1 g Yeast Extract (Biolife) ve 0.6 g agar (Difco-Bacto agar) tartıldı ve 250 μL MgSO4 ile 150 μL CaCl2 ilave edilerek kaynatıldı. Hazırlanan agar cam tüplere 3’er mL ilave edilerek otoklavda steril edildi. Yumuşak agar, bakteri kültürü ilave edilene kadar katılaşmaması için 50 °C’de benmaride (Memmert) bekletildi. Ardından yumuşak agarlı tüplerin içerisine 100 μL şüpheli faj solüsyonundan ve 100 μL’de bakteri süspansiyonundan ilave edilerek hafifçe pipetaj yapıldı. Bakteri-faj adsorbsiyonunun gerçekleşmesi için cam tüpler 39 °C’de 15 dk benmaride bekletildi. Süre sonunda daha önceden hazırlanıp petrilere dökülmüş Tryptic Soya Agar (Oxoid CM0131) üzerine, faj ve bakteri süspansiyonunu içeren yumuşak agar yayılarak 45 dk kadar donması için bekletildi. Besi yerleri katılaştıktan sonra 37 °C’de 24 saat inkübe edildi ve takip eden gün faj plaklarının oluşup oluşmadığı kontrol edildi.

Bakteriyofajların Tek Plak İzolasyon Yöntemiyle Saflaştırılması: Bakteriyofajların saflaştırılması için tek plak yöntemi uygulandı. Bu amaçla kapaklı steril tüp içerisine, çift agar yöntemiyle oluşan faj plakları steril bir bistüri ile tek düştükleri bölgelerden kesilerek bırakıldı. Üzerlerine 3 mL TSB besi yeri ilave edilerek, fajların besi yerine geçişini kolaylaştırmak için hafifçe çalkalandı. Önceden çalkalayıcı etüvde hazırlanan 4 saatlik A. butzleri kültüründen 100 μL alınarak aynı tüp içerisine eklendi. Ardından faj-bakteri adsorbsiyonu için 30 dk beklenerek 5 mL TSB besi yeri daha ilave edildi. Hazırlanan faj-bakteri karışımı 37 °C’de 24 saat inkübe edildi. İnkübasyon sonrası 8000 rpm’de 15 dk santrifüj edilerek hücre ve besi yeri artıklarının uzaklaştırılması sağlandı. Santifüj sonrası üstte kalan sıvı önce 0.45 μL’lik sonra 0.22 μL’lik steril şırınga uçlu filtrelerden geçirilerek steril bir tüpte toplandı. Elde edilen sıvı, faj titresinin yükseltilmesi için yapılacak analizlerde kullanılıncaya kadar +4 °C’de muhafaza edildi.

Bakteriyofaj Titresinin Yükseltilmesi: Bakteriyofaj titresini artırmak amacıyla, öncelikle 1 mL faj lizatı ve 0.1 mL 4 saatlik konakçı bakteriden alınarak steril bir eppendorf içerisinde oda sıcaklığında 30 dk inkübasyona bırakıldı. İnkübasyonu takiben faj-bakteri süspansiyonu TSB sıvı besi yerine ilave edilerek 37 °C’de 24 saat inkübe edildi. Bu aşamayı takiben TSB sıvı besi yerindeki bakteri ve faj solüsyonu 5000 rpm’de 10 dk santrifüj edildi. Üstte kalan sıvı önce 0.45 μL’lik sonra 0.22 μL’lik filtreden geçirilerek hücre artıkları ortamdan uzaklaştırıldı. Bu işlem altı kez tekrar edildi. Filtre edilen bakteriyofaj solüsyonu üzerine 5 mL NaCl, 12 mL PEG 8000, 1 mL distile su ilave edildi ve 1 dk vortekslenerek +4 °C’de bir gece bekletildi. Ardından saf faj filtratının çöktürülerek yoğunlaştırılması için 5800 rpm’de 90 dk santrifüj edildi. Santrifüj sonrası elde edilen pelet 500 μl TE buffer ile süspanse edildi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: Çift tabakalı agar yöntemiyle A. butzleri spesifik fajların meydana getirdiği lizis zonları, A ve B; Dışkıdan ilk izole edilen fajların meydana getirdiği lizis zonları

Bir bakteriye spesifik ilk faj izolasyonunda yukarıda ifade edilen problemlerin yaşandığını gösteren çok sayıda çalışma mevcuttur^22-24. Arkobakter benzeri bir patojen olan Kampilobakterlerde ilk faj izolasyonları yapılırken benzer sorunlar yaşandığı, bu sorunların fajla ilgili olduğu gibi bakteri türünün yapısıyla da ilgili olabileceği bildirilmiştir. Bununla birlikte, geçmişte karşılaşılan birçok sorun, bu fajlar üzerine yapılan yoğun çalışmalar ile çözülebilmiştir. Böylece, Kampilobakter fajlarının hızlı bir şekilde saptanmasına, izolasyonuna ve karakterizasyonuna izin veren protokoller geliştirilmiş ve başarıyla kullanılmıştır^12-13.

Sonuç olarak; toplanan çevresel örneklerde A. butzleri’ye spesifik litik etkili fajların varlığı ile ilgili önemli ipuçları elde edilmesine rağmen bununla ilgili kesin bir veriye ulaşılamadı. Fajların en önemli özelliklerinden biriside tür spesifik, hatta suş spesifik özellik gösterebilmesidir. Bu nedenle izole edilen fajların varlığını kesin kanıtlamak için mümkün olduğu kadar fazla saha suşunda bu denemelerin yapılmasına ihtiyaç bulunmaktadır. Ayrıca rutin olarak kullanılan faj izolasyon metodunun yetersiz olabileceği ve bu nedenle Arkobakterlere spesifik yeni bir metodolojinin geliştirmesine ihtiyaç olduğu düşünülmektedir. Dolayısıyla gelecek çalışmalarda Arkobakterlere özgü standart bir metot geliştirilmesi ve elde edilen faj stoklarının profaj olma ihtimalinin dikkate alınarak bu yönde araştırmaların sürdürülmesinin uygun olacağı kanaatine varıldı.

Teşekkür
Katkılarından dolayı TÜBİTAK’a, A. butzleri saha izolatlarını temin ettiğimiz Dr. Elif ÇELİK’e ve uygulanan metotların yorumlanmasında iletişime geçtiğimiz Dr. Y. Emre GENCAY’a teşekkür ederiz.

1) Van den Abeele AM, Vogelaers D, Van Hende J, et al. Prevalence of Arcobacter Species among Humans, Belgium, 2008–2013. Emerg Infect Dis 2014; 20: 1731-1734.

2) Logan EF, Neill SD, Mackie DP. Mastitis in dairy cows associated with an aerotolerant Campylobacter. Vet Rec 1982; 110: 229-230.

3) Schroeder-Tucker L, Wesley IV, Kiehlbauch JA, et al. Phenotypic and ribosomal RNA characterization of Arcobacter species isolated from porcine aborted fetuses. J Vet Diagn Invest 1996; 8: 186-195.

4) Collado L, Figueras MJ. Taxonomy, epidemiology, and clinical relevance of the genus Arcobacter. Clin Microbiol Rev 2011; 24: 174-192.

5) Açik MN, Yüksel H, Ulucan A, et al. The first experimental research on the pathogenicity of Arcobacter butzleri in zebrafish. Vet Microbiol 2016; 189: 32-38.

6) Clark NM, Zhanel GG, Lynch III JP. Emergence of antimicrobial resistance among Acinetobacter species: a global threat. Curr Opin Crit Care 2016; 22: 491-499.

7) Ryu S, Head MG, Kim BI, et al. Are we investing wisely? A systematic analysis of nationally funded antimicrobial resistance projects in Republic of Korea, 2003-2013. J Glob Antimicrob Resist 2016; 7: 90-94.

8) Abay S, Kayman T, Hizlisoy H, et al. In vitro antibacterial susceptibility of Arcobacter butzleri isolated from different sources. J Vet Med Sci 2012; 74: 613-616.

9) Kayman T, Abay S, Hizlisoy H, et al. Emerging pathogen Arcobacter spp. in acute gastroenteritis: Molecular identification, antibiotic susceptibilities and genotyping of the isolated Arcobacters. J Med Microbiol 212; 61: 1439-1444.

10) Rahimi E. Prevalence and antimicrobial resistance of Arcobacter species isolated from poultry meat in Iran. British Poult Sci 2014; 55: 174-180.

11) Loc Carrillo CM, Connerton PL, Pearson T, et al. Free-range layer chickens as a source of Campylobcter bacteriophage. Antonie Van Leeuwenhoe 2007; 92: 275-284.

12) Gencay YE, Birk T, Bronsted L, et al. Campylobacter jejuni Methods and Protocols. In: Butcher J, Stintzi A. (Editors). Methods for isolation, purification, and propagation of bacteriophages of Campylobacter jejuni. Chapter 3. Humana Press, New York: 2017: 19-28.

13) Hockett KL, Baltrus DA. Use of the soft-agar overlay technique to screen for bacterially produced inhibitory compounds. JoVE 2017; 119: e55064.

14) Smith HW, Huggins MB. Successful treatment of experimental Escherichia coli infections in mice using phage: Its general superiority over antibiotics. J Gen Microbiol 1982; 128: 307-318.

15) Spricigo DA, Bardina C, Cortés P, et al. Use of a bacteriophage cocktail to control Salmonella in food and the food industry. Int J Food Microbiol 2013; 165: 169-174.

16) Chan BK, Sistrom M, Wertz JE et al. Phage selection restores antibiotic sensitivity in MDR Pseudomonas aeruginosa. Sci Rep 2016; 6: 26717.

17) Wang Z, Zheng P, Ji W, et al. SLPW: A virulent bacteriophage targeting methicillin-resistant Staphylococcus aureus in vitro and in vivo. Front Microbiol 2016; 15: 934.

18) Jansen M, Wahida A, Latz S, et al. Enhanced antibacterial effect of the novel T4-like bacteriophage KARL-1 in combination with antibiotics against multi-drug resistant Acinetobacter baumannii. Sci Rep 2018; 8: 14140.

19) Tan D, Zhang Y, Cheng M, et al. Characterization of Klebsiella pneumoniae ST11 isolates and their interactions with lytic phages. Viruses 2019; 11: 1080.

20) Carvalho CM, Gannon BW, Halfhide DE, et al. The in vivo efficacy of two administration routes of a phage cocktail to reduce numbers of Campylobacter coli and Campylobacter jejuni in chickens. BMC Microbiol 2010; 10: 232.

21) Fischer S, Kittler S, Klein G, et al. Impact of a single phage and a phage cocktail application in broilers on reduction of Campylobacter jejuni and development of resistance. PLoS One 2013; 8: e78543.

22) Jäckel C, Hammerl JA, Hertwig S. campylobacter phage ısolation and characterization: What we have learned so far. Methods Protoc 2019; 2: 18.

23) Makino K, Yokoyama K, Kubota Y, et al. Complete nucleotide sequence of the prophage VT2-Sakai carrying the verotoxin 2 genes of the enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 derived from the Sakai outbreak. Genes Genet Syst 1999; 74: 227-239.

24) Yokoyama K, Makino K, Kubota Y, et al. Complete nucleotide sequence of the prophage VT1-Sakai carrying the Shiga toxin 1 genes of the enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 strain derived from the Sakai outbreak. Gene 2000; 258:127-139.