Medikal kontraseptif yöntemler fiziksel ve kimyasal uygulamalar olarak iki ana başlıkta değerlendirilmektedir. Fiziksel yaklaşımda bariyer metotları uygulanmaktadır. Spermatoksik intravajinal aparatlar istenilen kontrasepsiyonu sağlasa da, östrus belirtilerini baskılamayacaktır ve lokal perforasyonlara neden olabilir. Örneğin intravajinal aparat yerleştirilen köpeklerin ancak %50’sinde aparatın vajina içinde kalabildiği ve bu hayvanların da %25’inde gebelik görüldüğü bildirilmiştir⁴. Kimyasal ise progestinler, androjenler, Gonadotropin Salgılatıcı Hormon (GnRH) agonist ve antagonistlerini içeren hormon sağaltımını içermektedir. Ancak bu tip hormon uygulamalarında çeşitli metabolik ve genital sistem patalojilerini uyarabilir. Örneğin kedi ve köpeklerde östrus belirtilerinin baskılanması için kullanılan progestinler pyometra ve meme neoplazilerinin görülme oranını arttırmaktadır³.

Medikal yöntemlerin içinde değerlendirilen kontraseptif aşı uygulamaları sterilizasyon için önemli bir alternatif olarak karşımıza çıkar. Kontraseptif aşılar immunokontrasepsiyon ve gen sessizleştirme/gen terapisi gibi yöntemleri barındıran geniş bir uygulama alanına sahiptir. İdeal bir kontraseptif aşıdan istenilen özellikler sterilitenin geri dönüşümlü olması ve herhangi bir koplikasyon geliştirmeksizin uzun vadede etki göstermesidir. Evcil ve vahşi hayvan türleri için bu tür aşıların kullanımında kızgınlığın baskılanıp baskılanmamasına göre değişen kullanım seçenekleri vardır. Örneğin seksüel kaynaklı saldırgan davranışların azaltılması hayvanat bahçesi, çiftlik ve pet hayvanları için istenilen bir durum olsa da, doğal yaşamdaki vahşi hayvanlarda sürü hiyerarşisinin korunması nedeniyle istenilen bir durum değildir ⁵.

Gen teknolojilerinin Hayvanlarda Kontraseptif Amaçlı Kullanımı
İnterferans RNA (iRNA) ya da mikro-RNA moleküllerinin keşfi ile gen ekspresyonlarının durdurulabileceği, bunun sayesinde pek çok sentez mekanizmasının engellenebileceği fikri doğmuştur. Bir hedef genin transkriptinin, sekans spesifik (diziye özgü) bir ilişki temelinde, çift zincirli RNA (dsRNA) ile durdurulması olayı, RNA interferansı olarak tanımlanmaktadır. RNA interferans, çift zincirli RNA’nın (dsRNA) hücreye girdiği zaman komplementer mRNA dizisinin parçalanmasına yol açması ile sonuçlanan transkripsiyon sonrası gen susturma mekanizmasıdır ⁶. Bu işlemin temeli, hedef mRNA zincirine komplementer bir çift zincirli iRNA’nın tek zincirini kullanmaktır. Bu işlemde dsRNA, aktarıldığı hücrelerde küçük interfere edici iRNA’lara parçalanır. Bunlara siRNA (small interfering RNA) denir. Olay hücre içi bir metot olup, hücrede oldukça komplike bir biyolojik regülatör makine olarak görev yapar. RNA interferans, istenmeyen yabancı genlerin elimine edilmesi ve aynı zamanda gen ekspresyonunun transkripsiyonel regülasyonunda hücrede kullanılan bir mekanizmadır. Bu mekanizma doğal bir işlem olup, canlı organizmadaki biyolojik fonksiyonu, virüs kalıtım materyali ve transpozonlar gibi hareketli genetik elementlerin istilasına karşı genomu koruyarak hücresel savunmada rol almaktır. Ayrıca ökaryotik organizmaların gelişimsel programlarının fonksiyonu için önemli olan transkripsiyon sonrası gen susturma ile gen regülasyonunda önemli rol oynamaktadır^7-9.

Gen ekspresyonlarını baskılamak için kullanılacak siRNA molekülü viral vektörler aracılığı ile hedef hücreye taşınmaktadır. Genetik mühendislik çalışmaları sonucu virüs üretmek ve bu virüsün hedef hücreye gen taşıyabilmesi mümkündür. Yapılan ilk çalışmalar yaklaşık 10 yıl önce başlamış olsa da siRNA moleküllerini hedef hücreye ulaşmasına engelleyecek çok fazla sorun vardır. İnsan sağlığında bu yaklaşımın kullanılması şu anda klinik test aşamasındadır. Alnylam® gibi şirketler amiloidozis ve porfirya hastalıklarında kullanılmak üzere siRNA ilaçları üretmektedirler. Hayvan sağlığı alanında ise hemofili hastalığı bulunan köpeklerin tedavisinde kullanılmıştır ve sonuç olarak pıhtılaşma fonksiyonu normal sınırlara geldiği bildirilmiştir^10,11.

Reprodüktif sistemde önemli genlerin baskılanması amacıyla iRNA yöntemi kullanılarak fertilitenin engellenmesi sağlanabilir. Gen sessizleştirme yani iRNA müdahalesinin etkili olabilmesi için üç önemli koşul vardır: baskılanacak spesifik genin tanımlanması, siRNA molekülünü hedef hücreye taşıyabilecek viral vektörün identifiye edilmesi ve son olarak hedef hücredeki bilinen geni baskılamak amacıyla siRNA molekülünün hücre içine girebilmesi gerekmektedir¹².

Gen sessizleştirme amacı için kullanılacak viral vektörler arasında patojenik olmayan Adeno-associated virüs (AAV) tercih edilmektedir. Rekombinant Adeno-associated virüs (rAAV) vektörlerinin güvenlik profilleri, çok sayıda insan klinik deneylerinde gösterilmiştir¹³. Geniş bir çeşitlilik gösteren AAV suşları spesifik dokulara tropizim gösterebilmektedirler. Ayrıca AAV kapsitleri klinik kullanım için biyolojik özelliklerini değiştirmek amacı ile genetik manipülasyonlara uygunluk sağlamaktadır¹⁴. Recombinant Adeno-associated virüsün (rAAV) hücre içine giriş mekanizmalarından bazıları Şekil 1’de gösterilmiştir¹⁵. Önemli olarak, hayvan modellerinde yapılan çalışmalarda, yüksek doz intravenöz rAAV enjeksiyonu uygulandığında merkezi sinir sistemi hücrelerinin (yani kan-beyin bariyerinin ötesinde) transdüksiyonuna yol açtığını göstermiştir^16-23. Yapılan bir çalışmada AAV serotip 9’un modifikasyonu olan rAAV’nin yetişkin fare beynine gen transferi sağlayabileceği ortaya konmuştur²⁴.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: Recombinant Adeno-associated virüsün (rAAV) hücre içine girişi ve ilerleyişi15

Fertilizasyonun gerçekleşmesi için çeşitli hormonlar, gamet üretimi, folikül maturasyonu, sperm motilitesi ve aktivasyonunun yanı sıra ovulasyon, sperm ve yumurtanın füzyonu ve embriyonun implantasyonu ve gelişimine bağlıdır. Bu fizyolojik olayların her biri için gerekli olan moleküller, fertilitenin inhibe edilebileceği olası noktalar olarak Şekil 2’de belirtilmiştir ²⁵.

Şekil 2: Viral vektör kullanılarak yapılan kontraseptif yöntemlerin çeşitli hedefleri²⁵

Günümüzde yapılan çalışmalar reprodüktif sistemde GnRH’nın salgı mekanizmasını kontrol eden kisspeptin molekülü üzerine yoğunlaşmıştır. Kisspeptin hipotalamustaki KNDy sinir hücreleri tarafından salgılanmaktadır^26,27. Kisspeptin, pubertal geçiş ve erişkin reprodüktif fonksiyonun devamlılığı için gereklidir ²⁸. Kisspeptin’in yanı sıra Neurokinin B’de kisspeptin ekspresyonu için gereklidir ve normal bir fertilite için her iki molekülün bulunması gerektiği bildirilmiştir²⁹. Kisspeptin ve Neurokinin B’nin üretimlerinden sorumlu genlere bakıldığında sırasıyla Kiss1 ve Tac3 geninin sorumlu olduğu bulunmuştur ^29-31. Kisspeptin ve Neurokinin B molekülleriden herhangi birisinin veya etkilediği reseptörlerin eksikliği sterilite ile sonuçlanmaktadır^28,32-36.

Dissen ve ark.^37, Kiss1 ve Tac3 gibi reprodüksiyonun merkezi kontrolünde yer alan genleri susturmak için Adeno-associated virüs (AAV) kullanarak bir yöntem geliştirmişlerdir. Kedilerin hipotalamusuna iletilebilen siRNA molekülünü ulaştırmayı amaçlamışlardır. Üretilen bu yapının erkek farelere enjeksiyonu sonrası 5 aylık (Çalışmanın sonu) bir sterilite gözlemlenmiştir. Daha uzun süreli baskılamayı değerlendirildiği çalışmalar da mevcuttur^38-39.

Araştırmacılar ayrıca, gonadotropin inhibe edici hormon (GnIH) ve Anti-Müller hormonunun (AMH) ekspresyonunu sağlayan genlerin daha fazla üretim için etkilenebilirliğini çalışmaktadırlar. GnIH’ın varlığı potansiyel olarak GnRH'nın sentezini azaltabilmektedir⁴⁰. Anti-Müller hormonu, Transforming Growth Faktor Beta ailesinin bir üyesidir, erkek ve dişi üreme sistemlerinde kritik bir rol oynamaktadır^41-44. Erkek fetüs gelişimi sırasında Sertoli hücreleri tarafından üretilir ve başlangıçta bipotential üreme yolunda dişi Müllerian kanallarının oluşumunu bloke etmektedir. Erkeklerde AMH seviyeleri pubertaya kadar yüksek kalmakta ve daha sonra dramatik olarak azalmaktadır. Dişilerde ise AMH seviyeleri pubertaya kadar düşüktür, bu noktada erkeklerin puberta dönemi sonrasıyla karşılaştırılabilir düzeylere yükselmektedir⁴². Dişilerde AMH, folikül gelişmesi ve büyümesini düzenlemede kritik rol oynar. Postnatal dönemde ovaryumlardaki AMH ve buna bağlı reseptörü granüloza hücrelerinde eksprese edilmektedir. Hem işlev kaybından hem de işlev kazanma deneylerinden elde edilen kanıtlar, AMH'nın follikülogenesizde, primordial foliküllerin büyümekte olan folikül havuzuna girmesini engellediğini göstermektedir. AMH ayrıca, FSH'ya bağlı folikül büyümesini de inhibe edebilmektedir^43,44. Bu gözlemler eşliğinde, AMH’nın dişilerde kontraseptif amaçla kullanımı ilginç bir seçim olarak karşımıza çıkmaktadır²⁵. Memeli hayvanların yaşam süresi boyunca yeterince yüksek AMH ifade edebilecek bir genin dişilerde foliküler gelişimi baskılayabileceğini ve sterilitesine neden olarabileceği varsayılmaktadır¹². Kemoterapi gören kadınlarda folikül rezervlerini korumak adına AMH aracılı kontrasepsiyon yapılabileceği fikri araştırılmaktadır, deney hayvanları üzerinde yapılan ilk çalışmalar bunu destekler niteliktedir³⁹.Gen terapisi ayrıca anti-GnRH monoklonal antikorların ve anti-Zona Pellucida (ZP) monoklonal antikorlarının sürekli salgılanmasına neden olabilecek bir genin üretilmesi ve uygulanması için kullanılabilir. GnRH’ya karşı pasif bağışıklık yanıtı için GnRH'yı inaktive edebilecek şekilde yeterince yüksek antikor titresi ve afiniteye sahip bir antikorun üretilmesini gerektirmektedir. Benzer durum anti-ZP antikorları için de gerekmektedir. Araştırmacılar³⁸ fareler üzerinde yaptıkları çalışmada AAV vektörlü aşıların hem erkek hemde dişi hayvanlarda anti-GnRH antikorlarının aşırı ekspresyonuna sebep olduğu görülmüştür. Dişi ve erkek farelerin gonadları atrofiye uğramış ve erkek farelerde testosteron ölçülemeyecek düzeye gelmiştir. Aynı çalışmada anti-ZP antikorlarının aşırı ekspresyonları sağlanmış ve dişi hayvanlarda 6 ay süren bir sterilite gözlemlenmiştir.

Güncel çalışmalar içerisinde GnRH reseptör ekspresyonunu inhibe edebilen gen sessizleştirme teknolojileri de vardır. Bu bağlamda Hipotalamustan GnRH salınımı gerçekleşse bile hipofizdeki reseptör eksikliğinde bağlı FSH ve LH salınım mekanizmasında bozulma görülebilir. Labaratuvar çalışmalarında kitosan ile konjuge edilmiş GnRH molekülünün iRNA için yeni bir taşıyıcı molekül olduğu ve hücrelerdeki GnRH reseptör ekspresyonlarını inhibe edebildiği bildirilmiştir⁴⁵.

Başka bir yaklaşım ise testislerde androjen reseptörlerinin ekspresyonunu inhibe etmek için mikro-RNA teknolojisi kullanımıdır, çünkü sperm üretimi de dahil olmak üzere normal testiküler fonksiyon için androjen uyarımı gerekmektedir. Benzer bir şekilde AAV gibi viral vektörler aracılığı ile susturucu genin taşınması sağlanabilir. Sertoli hücrelerinde bulunuan androjen reseptörlerinin inhibisyonunun sağlanması ile erkek hayvanlarda sterilitenin sağlanabileceği düşünülmektedir⁴⁶.

1) Maenhoudt C, Santos N, Fontbonne A, Suppression of fertility in adult dogs. Reprod Domest Anim 2014; 49: 58-63.

2) Howe L. Surgical methods of contraception and sterilization. Theriogenology 2006; 66: 500-509.

3) Kutzler M, Wood A. Non-surgical methods of contraception and sterilization. Theriogenology 2006; 66: 514-525.

4) Wildt DE, Seager S. Reproduction control in dogs. Vet Clin North Am 1977; 7: 775-787.

5) Naz RK, Saver AE. Immunocontraception for animals: Current status and future perspective. Am J Reprod Immunol 2016; 75: 426-439.

6) Fire A, Xu S, Montgomery MK, et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 1998; 391: 806-811.

7) Zeng Y, Cullen BR. RNA interference in human cells is restricted to the cytoplasm. RNA 2002; 8: 855-860.

8) Agrawal N, Dasaradhi PVN, Mohammed A, et al. RNA interference: Biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev 2003; 67: 657-685.

9) Reddy LS, Sarojamma V, Ramakrishna V. Future of RNAi in medicine: A review. World J Med Sci 2007; 2: 01-14.

10) Herzog RW, Mount JD, Arruda VR, et al. Muscle-directed gene transfer and transient immune suppression result in sustained partial correction of canine hemophilia B caused by a null mutation. Mol Ther 2001; 4: 192-200.

11) Niemeyer GP, Herzog RW, Mount J, et al. Long-term correction of inhibitor-prone hemophilia B dogs treated with liver-directed AAV2-mediated factor IX gene therapy. Blood, J Am Soc Hematol 2009; 113: 797-806.

12) Rhodes L. New approaches to non‐surgical sterilization for dogs and cats: Opportunities and challenges. Reprod Domest Anim 2017; 52: 327-331.

13) High KA, Aubourg P. rAAV Human Trial Experience. In: Snyder R, Moullier P. (Editors). Adeno-Associated Virus. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1st Edition, Philadelphia: Saunders 2012: 429-457.

14) Asokan A, Conway JC, Phillips JL, et al. Reengineering a receptor footprint of adeno-associated virus enables selective and systemic gene transfer to muscle. Nat Biotechnol 2010; 28: 79-82.

15) Schultz BR, Chamberlain JS. Recombinant adeno-associated virus transduction and integration. Mol Ther 2008; 16: 1189-1199.

16) Duque S, Joussemet B, Riviere C, et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther 2009; 17: 1187-1196.

17) Foust KD, Nurre E, Montgomery CL, et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol 2009; 27: 59.

18) Foust KD, Wang X, McGovern VL, et al. Rescue of the spinal muscular atrophy phenotype in a mouse model by early postnatal delivery of SMN. Nat Biotechnol 2010; 28: 271-274.

19) Dominguez E, Marais T, Chatauret N, et al. Intravenous scAAV9 delivery of a codon-optimized SMN1 sequence rescues SMA mice. Hum Mol Genet 2011; 20: 681-693.

20) Bevan AK, Duque S, Foust KD, et al. Systemic gene delivery in large species for targeting spinal cord, brain, and peripheral tissues for pediatric disorders. Mol Ther 2011; 19: 1971-1980.

21) Fu H, DiRosario J, Killedar S, et al. Correction of neurological disease of mucopolysaccharidosis IIIB in adult mice by rAAV9 trans-blood–brain barrier gene delivery. Mol Ther 2011; 19: 1025-1033.

22) Gray SJ, Matagne V, Bachaboina L, et al. Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery to neurons and glia: A comparative study of adult mice and nonhuman primates. Mol Ther 2011; 19: 1058-1069.

23) Dayton RD, Wang DB, Klein RL. The advent of AAV9 expands applications for brain and spinal cord gene delivery. Expert Opin Biol Ther 2012; 12: 757-766. 24. Deverman BE, Pravdo PL, Simpson BP, et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat Biotechnol 2016; 34: 204.

25) Hay BA, Li J, Guo M. Vectored gene delivery for lifetime animal contraception: Overview and hurdles to implementation. Theriogenology 2018; 112: 63-74.

26) Lehman MN, Coolen LM, Goodman RL. Minireview: Kisspeptin/neurokinin B/dynorphin (KNDy) cells of the arcuate nucleus: A central node in the control of gonadotropin-releasing hormone secretion. Endocrinology 2010; 151: 3479-3489.

27) Navarro VM, Gottsch ML, Wu M, et al. Regulation of NKB pathways and their roles in the control of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the male mouse. Endocrinology 2011; 152: 4265-4275.

28) de Tassigny XDA, Fagg LA, Dixon JP, et al. Hypogonadotropic hypogonadism in mice lacking a functional Kiss1 gene. Proc Natl Acad Sci 2007; 104: 10714-10719.

29) Navarro VM. Interactions between kisspeptins and neurokinin B. In: Kauffman AS, Smith JT. (Editors). Kisspeptin Signaling in Reproductive Biology. 1st Edition, New York: Springer 2013: 325-347.

30) Kotani M, Detheux M, Vandenbogaerde A, et al. The metastasis suppressor gene KiSS-1 encodes kisspeptins, the natural ligands of the orphan G protein-coupled receptor GPR54. J Biol Chem 2001; 276: 34631-34636.

31) Ohtaki T, Shintani Y, Honda S, et al. Metastasis suppressor gene KiSS-1 encodes peptide ligand of a G-protein-coupled receptor. Nature 2001; 411: 613-617.

32) Funes S, Hedrick JA, Vassileva G, et al. The KiSS-1 receptor GPR54 is essential for the development of the murine reproductive system. Biochem Biophys Res Commun 2003; 312: 1357-1363.

33) Semple RK, Achermann JC, Ellery J, et al. Two novel missense mutations in g protein-coupled receptor 54 in a patient with hypogonadotropic hypogonadism. J Clin Endocrinol Metab 2005; 90: 1849-1855.

34) Clarkson J, de Tassigny XDA, Moreno AS, et al. Kisspeptin–GPR54 signaling is essential for preovulatory gonadotropin-releasing hormone neuron activation and the luteinizing hormone surge. J Neurosci 2008; 28: 8691-8697.

35) Topaloglu AK, Reimann F, Guclu M, et al. TAC3 and TACR3 mutations in familial hypogonadotropic hypogonadism reveal a key role for Neurokinin B in the central control of reproduction. Nat Genet 2009; 41: 354.

36) Silveira LG, Tusset C, Latronico AC. Impact of mutations in kisspeptin and neurokinin B signaling pathways on human reproduction. Brain Res 2010; 1364: 72-80.

37) Dissen GA, Adachi K, Lomniczi A, et al. Engineering a gene silencing viral construct that targets the cat hypothalamus to induce permanent sterility: An update. Reprod Domest Anim 2017; 52: 354-358.

38) Li J, Olvera AI, Akbari OS, et al. Vectored antibody gene delivery mediates long-term contraception. Curr Biol 2015; 25: R820-R822.

39) Kano M, Sosulski AE, Zhang L, et al. AMH/MIS as a contraceptive that protects the ovarian reserve during chemotherapy. Proc Natl Acad Sci 2017; 114: E1688-E1697.

40) Tsutsui K, Bentley GE, Bedecarrats G, et al. Gonadotropin-inhibitory hormone (GnIH) and its control of central and peripheral reproductive function. Front Neuroendocrinol 2010; 31: 284-295.

41) Durlinger A, Visser J, Themmen A. Regulation of ovarian function: The role of anti-Mullerian hormone. Reproduction 2002; 124: 601-609.

42) Kim JH, MacLaughlin DT, Donahoe PK, Müllerian inhibiting substance/anti-Müllerian hormone: A novel treatment for gynecologic tumors. Obstet Gynecol Sci 2014; 57: 343-357.

43) Monniaux D, Clément F, Dalbiès-Tran R, et al. The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link? Biol Reprod 2014; 90: 85-91.

44) McLennan IS, Pankhurst MW. Anti-Mullerian hormone is a gonadal cytokine with two circulating forms and cryptic actions. J Endocrinol 2015; 226: R45-R57.

45) Boonthum C, Namdee K, Boonrungsiman S, et al. Chitosan-based DNA delivery vector targeted to gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor. Carbohydr Polym 2017; 157: 311-320.

46) Roesl C, Jeffery N, Smith S. Single injection steriltity via lentiviral-mediated suppression of androgen receptors in Sertoli cells. in Abstract presented at the ISCFR-EVSSAR Congress, Paris, France. 2016.