Kardiyomiyositlerin Elde Edilmesi: Çalışmada 3 aylık erkek Wistar sıçanlar kullanılmıştır (Akdeniz Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu; Protokol No: 2013.05.03). Hayvanlar sodyum pento barbital kullanılarak (30 mg/kg vücut ağırlığı) hafif anestezi altına alınıp Langendorff sistemine aortadan bağlanmıştır. Perfüzyon çözeltisinin içeriği (mM olarak): 145 NaCl; 5 KCl; 1.2 MgSO
4; 1.4 Na
2HPO
4; 0.4 NaH
2PO
4; 5 HEPES; 10 glukoz (pH:7.4) olarak ayarlanmıştır. Kalpler perfüzyon ile yıkandıktan sonra 30–35 dakika süre ile içerisinde kollajenaz bulunan çözelti (Collagenase A type) (0.8–1 mg/ml) ile perfüze edilmiştir. Ardından doku makasla parçalanıp filtreden geçirilerek tek hücreler elde edilmiştir. Ca
2+ derişimi final derişimi 1mM olacak şekilde aşamalı olarak arttırılmıştır. Ölçümlerin alınması sırasında 100 nM konsantrasyonunda 20-HETE perfüzyonu gerçekleştirilmiştir.
Kısalma Parametrelerinin Ölçülmesi: Hücreler elektrot yerleştirilmiş küvet içine alınarak uyarılabilir olanlar 0.5, 1, 2 ve 4 Hz frekanslı 5 V ve 4 ms’lik elektrik alan ile uyarılmıştır. Inverted mikroskoba bağlı hızlı bir kamera yardımıyla (MyoCam, IonOptix Inc., ABD) kayıtlar alınarak dinlenim boyu, kısalma genliği, kısalma ve gevşeme sürelerinin değişimleri değerlendirilmiştir.
Aksiyon Potansiyeli Ölçümü (Akım Kenetleme Yöntemi): Kardiyomiyositler 1 Hz frekansında uyarılarak kayıt edilmiştir. Deneyde ekstraselüler ortam için içeriği (mM): NaCl 137, KCl 5.4, MgCl2 0.5, CaCl2 1.8, Hepes 11.8, glukoz 10 ve pH 7.40 olan Tyrode solüsyonu kullanılmıştır. Ayrıca, 1,5-2 MΩ dirence sahip pipetler içeriği (mM): K-aspartate 120, NaCl 10, KCl 20, K-Hepes 10, MgATP 5 ve pH 7.2 doldurulmuştur. Kaydedilen aksiyon potansiyellerinin (AP) dinlenim zar potansiyeli, genliği, depolarizasyon hızı ve repolarizasyon süresi hesaplanarak ortalama değerleri verilmiştir.
Voltaj Kenetleme Yöntemi: Bütün akımlar voltaj kenetleme yönteminin tüm-hücre konfigürasyonunda kaydedilmiştir. Bunun için, hücrenin gigaohm düzeyinde bir direnç oluşturacak şekilde elektrot ucuna yapışması sağlandıktan sonra (gigaseal), 900 mV’luk bir puls uygulanarak hücre zarı kırılmıştır. Her potansiyel için elde edilen akım değerleri hücreler arası büyüklük değişiminden kaynaklanabilecek sapmaları önlemek amacıyla ölçüm yapılan hücrenin sığasına bölünerek değerlendirilmiş ve tüm akım değerleri akım yoğunluğunun (pA/pF) voltaja göre değişimi olarak verilmiştir. Akımların zamansal değişimler üssel fonksiyona uydurulmuştur (I/Imax=[1-exp(-t/Tau)]). Kanalların inaktivasyon değerleri Boltzmann denklemine uydurulmuştur (I/Imax=[1+exp(Vm–V1/2)/k]-1). Patch-clamp amplifikatörünün (Axon 200B, Digidata 1440, Axon Inc., ABD) voltaj kenetleme modunda 3 kHz’lik filtreden geçirilen akımlar, 20 kHz’lik örnekleme hızında bilgisayar yazılımı (pClamp 10) ile kaydedilmiştir. Kayıtlar için 2-3 MΩ’luk elektrodlar kullanılırken, kenetleme sonrası giriş direncinin 5 MΩ ve altında olması sağlanmıştır.
Voltaja bağlı Na+ Kanal Akımnın Kaydedilmesi: Na+ kanal akımı (INa) ölçümleri için kullanılan pipet solüsyonu (mM): 120 CsCl2, 5 Na-ATP, 5 MgCl2, 10 TEA, 10 EGTA, 10 HEPES, 1 CaCl2 ve 0.3 LiCl2 (pH:7.2, CsOH) içeriğine sahiptir. Banyo solüsyonu olarak (mM): 120 NaCl, 10 TEA, 5 CsCl, 1 MgCl2, 10 glukoz, 10 HEPES, 1.5 CaCl2 ve 0.5 CdCl2 (pH:7.4, CsOH) içeriğe sahip solüsyon perfüzyon sistemi aracılığıyla hücrenin üzerine uygulanmıştır. Kayıt protokolünde tüm kanalların aktivasyonunu sağlamak için –120 mV değerinde 200 ms süreyle tutulmuştur. Sonra –100 mV’tan 5 mV’luk artışlarla +40 mV’a 200 ms’lik depolarize edici pulslar uygulanmıştır. Tepe değerleri ölçülüp 300 ms’den sonraki kuyruk akımları çıkarılmıştır. Akım reaktivasyon protokolu –30 mV’luk prepuls uygulandıktan sonra aynı potansiyele sahip ikinci puls uygulanmıştır. Pulslar arası zaman 1 ms’den başlayarak 2 ms’lik adımlarla 20 ms’ye kadar arttırılmıştır. Kanalların deaktivasyon kinetiğini incelemek için –120 ile +50 mV arasında 5 mV’luk adımlarla prepuls uygulanarak ve her adımı takiben, –30 mV’a kenetlenmiştir.
L-tipi Ca2+ Kanal Akımının Kaydedilmesi: Voltaja bağlı L-tipi Ca2+ kanal akımları (ICaL) ölçümleri için kullanılan pipet solüsyonu (mM): 110 Cs-aspartat; 20 CsCl; 1 MgCl2; 5 fosfokreatin-Na2; 5 ATP-Na2; 10 EGTA ve 5 HEPES (pH:7,4, CsOH). Kayıt için, hücreler eğimli bir voltaj uygulaması ile zar potansiyeli –45 mV’a kenetlenmiş, bu seviyede bir süre beklenerek INa akımları inaktif hale getirilmiştir. Sonrasında –50 mV’tan 10 mV’luk artışlarla +60 mV’a 300 ms’lik depolarize edici pulslara cevaplar analiz edilmiştir. Kanalların inaktivasyon durumunu gözlemek için –80 mV ile +20 mV arasında 10 mV adımlarla 200 ms süreli prepuls uyguladıktan sonra zar her defasında yine 200 ms süreyle 0 mV’a kenetlenmiştir. Reaktivasyon ise; 200 ms süreyle 0 mV’a kenetlendikten sonra aynı potansiyelde ikinci puls uygulanarak kaydedilmiştir. Pulslar arası süre, 50 ms adımlarla, 50 ile 500 ms arasında değiştirilerek uygulanmıştır. Kanalların inaktivasyon kinetiğini incelemek için –70 ile +60 mV’lar arasında 10 mV’luk adımlarla prepuls uygulanarak 0 mV’luk ve 500 ms süreli ikinci bir puls uygulanmıştır. Akımların reaktivasyonları da iki aşamalı bir protokole göre kaydedilmiştir: 400 ms süreyle 0 mV’a kenetlemenin ardından 20 ms bekleyip aynı şekildeki ikinci puls uygulanmıştır. Δt=20 ms olmak üzere aynı protokol 300 ms’ye kadar uygulanarak ve her adımda ölçülen akımın tepe değeri maksimum akım değerine oranlanmıştır.
K+ Akımlarının Ölçümü: Akım-voltaj karakteristiği 600 ms’lik pulslar 1 s’lik aralıklarla ve 10 mV’luk basamaklar şeklinde –120 mV’tan +70 mV’a kadar 14 defa uygulanmıştır. Bu akımlar için kullanılan çözeltiler banyo için (mM): 117 NaCl; 5.4 KCl; 1.8 CaCl2; 1.7 MgCl2; 10 Glukoz; 10 HEPES (pH:7.4, NaOH), pipet için ise (mM): 120 KCl; 6.8 MgCl2; 5 Na2ATP; 5 Na-phosphocreatine; 0.4 Na2GTP; 11 EGTA; 4.7 CaCl2; 20 HEPES ve CdCl2 (250 μM) (pH:7.2, KOH) olacak şekilde hazırlanmıştır. Akımların tepe değerinden 600 ms’lik pulsun son bölümündeki akım değerleri (Iss) çıkarılarak dışa doğru geçici potasyum akımı (Ito) hesaplanmıştır. Kanalların inaktivasyon kinetiğini incelemek için–70 ile +60 mV’lar arasında 10 mV’luk adımlarla prepuls uygulanarak +70 mV’luk ve 500 ms süreli ikinci bir puls uygulanmıştır. Akımların reaktivasyonları da iki aşamalı bir protokole göre kaydedilmiştir: -80 mV’taki zar potansiyeli 400 ms süreyle +70 mV’a kenetlenip tekrar başlangıç potansiyeline dönüldükten sonra 20 ms bekleyip aynı şekildeki ikinci puls uygulanmıştır. Δt =20 ms olmak üzere aynı protokol 300 ms’ye kadar uygulanmıştır. İlk pulsun akım değerine oranlanarak değerlendirilmiştir.
İstatistiksel Analiz: Bu çalışmada, istatiksel karşılaştırma tekrarlı ölçüm Student’s t-test analizi ile değerlendirilmiştir.