T hücrelerinin geçmişte antijen ile karşılaşıp karşılaşmadığı (antijen-deneyimli T hücre) hem pre-klinik hem de klinik çalışmalarda ilgi duyulan ve merak uyandıran konulardan birisidir. T hücre yanıtlarını değerlendirmek için uygulanabilecek farklı flow sitometrik analiz yöntemleri bulunmaktadır. Bu teknikler sayesinde immün sistemin yapı ve işleyişi, virüse ve virüs kaynaklı enfeksiyona karşı vücut tepkimesi ayrıntılı biçimde analiz edilebilmiş ve konağa yabancı protein-peptid üzerindeki immün-epitopların da belirlenebilmesi ile etkin aşı çalışmalarının yapılmasına olanak sağlamıştır.

Bu derlemede, viral enfeksiyonlarda önemli rol alan CD8+ ve CD4+ T hücre yanıtlarının immün-fenotipini, fonksiyonunu ve antijen-spesifik miktarını değerlendirmek için kullanılan bazı flow sitometri tabanlı analiz yöntemleri hakkında bilgi verme amaçlanmıştır.

İmmün yanıtın niteliksel ve niceliksel durumu hakkında veri elde edilmesinde çeşitli metotlar geliştirilmiştir. Bu metotlar, immünitenin altında yatan temel mekanizmaları ve klinik teşhislerin tasarımı ile uygulanacak tedavinin geliştirilmesine yardımcı olmaktadır. Standart metotlar heterojen hücre popülasyonlardaki ortalama cevabı ölçmektedir. Hücre proliferasyonu, sitolitik aktivite ve sitokin ekspresyonunu saptayan yaygın deneyler; virüsler, tümör hücreleri ve çeşitli mikroorganizmalara karşı hastalık patogenezi ve bağışıklığı hakkında önemli bilgiler vermektedir ⁷. T hücre belleğinin devamlılığı viral enfeksiyonlarda önem arz etmektedir. Bu amaçla, vaccinia virüs (VV), measles virüs (MV) ve yellow fever virüs (YFV) dahil olmak üzere çeşitli akut viral enfeksiyonlarda T hücre belleği araştırılmıştır ⁴.

Akım (Flow) Sitometri / Hücre Fenotiplemesine Dayalı Testler
Sitometri, hücrelerin veya biyolojik partiküllerin fiziksel yada kimyasal özelliklerinin ölçülmesidir. Flow sitometri ise, akan bir sıvının içerisindeki hücrelerin özelliklerinin incelenmesidir. Flow sitometrinin temel prensibi; hücrelerin boyut, şekil, DNA ve RNA içeriği, sitoplazmik granüleritesi açısından değerlendirilmesidir. Flow sitometrinin çalışma prensipleri 1870’li yıllara kadar gitse de 1969 yıllında argon lazerinin kullanılmaya başlanması ve 1980’li yıllarda ayırma işleminin bulunması ile önemli bir ivme kazanmış ve daha sonra sürekli olarak meydana gelen gelişmelerle günümüze kadar gelmiştir ⁸.

Flow sitometri ışık mikroskobuna göre çok daha fazla hücreyi daha kısa bir süre içerisinde inceleme imkanı sağlar. Bu teknik ile 1 saniyede 500 hücre sayılır ve ortalama 10000 hücre 20 saniyede analiz edilebilir ⁹. Floresansla aktive edilen flow sitometri, immünolojide rutin olarak kullanılan en güçlü teknolojilerden biridir. Tek hücre bazında, hücrelerin hem hızlı ve çok parametreli analizi için hem de yüksek oranda saflaştırılmış hücre popülasyonlarının ayrımında olanak sağlar. Bu hücre tipleri arasında ayrım yapma yeteneği, hücresel bağışıklık ve hastalık patogenezini anlamamız açısından çok önemlidir ¹⁰.

Tüm hücrelerin yüzeyinde veya hücre içerisinde hücreye spesifik antijenler mevcuttur. Flow sitometride hücrenin büyüklüğü, hücrenin iç yapısı (granüleritesi), ve hücrede incelenmek istenilen antijene ait monoklonal antikorun floresansı ölçülmektedir. Hücreler öncelikle monoklonal antikorlarla inkübe edilerek antijenlere bağlanmaları sağlanır. Her spesifik antikor FITC (Fluorescein isothiocyanate), PE (Phycoerythrin), PerCP (Peridinin chlorophyll protein complex) gibi floresan boyalarla işaretlendiği için belirli antijene sahip hücrelerin lazer ışını ile karşılaştığında verdiği floresan sinyalleri değerlendirerek o hücrenin hangi spesifik antijeni taşıdığı belirlenebilmektedir ¹¹. Flow sitometri analizleri için hücrelerin sıvı içinde süspansiyon halinde bulunması gerekir. Bu amaçla kan hücreleri flow sitometride en çok incelenen hücreler olmuşlardır. Solid dokular için ise hücreler ayrıştırılıp hücre süspansiyonu haline getirilerek analizde kullanılmaktadır. Flow sitometri tekniği ile daha çok rutin laboratuvarlarda lökosit süspansiyonlarında analizler yapılmaktadır. Lökositlerin ayrılması ise hücre büyüklüğü ve granül yapısına göre yapılmaktadır ^{9, 11}.

Aşağıda flow sitometri yöntemleri kullanılarak CD4+ ve CD8+ T hücre analizlerine yönelik yapılan bazı tekniklerden bahsedilmiştir.

1. Sitokin Akım Sitometrisi (Cytokine Flow Cytometry-CFC)/ İntrasellüler Sitokin Boyama (Intracellular Cytokine Staining-ICS)/ Yöntemi
Kan veya periferal kan mononükleer hücrelerin (Peripheral blood mononuclear cells-PBMC) antijen spesifik stimülasyonunun ardından protein salgılanmasının inhibisyonu ve birikmiş hücre içi sitokinlerin çok renkli akım sitometrisi ile ölçülmesi, sitokin flow sitometrisi (CFC) veya intrasellüler sitokin boyama (ICS) olarak adlandırılır. Uygulanan stimülasyona bağlı olarak, CD4+ veya CD8+ T hücre cevaplarını tespit etmek için kullanılabilen ve iyi çalışan yöntemlerden birisidir. ICS tekniği ile çoklu sitokinler (veya kemokinler) ölçülebilir. IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-17 ve TNF-α yaygın olarak ölçülen sitokinler arasındadır ^12,13 (Şekil 1).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: Sitokin flow sitometri deneylerinin metodolojik şeması 14

CFC gibi teknikler kullanılarak kronik viral enfeksiyonların (HIV, HCV ve CMV gibi) akut enfeksiyon sırasında CD4+ ve CD8+ T hücre yanıtlarını indüklediği açıkça görülmüştür. Fonksiyonel antijen-spesifik T hücrelerinin frekanslarının belirlenmesi, birçok hastalık modelinde araştırmacıların CD4+ ve CD8+ T hücre yanıtlarının gücü ile immün koruma arasındaki ilişkiyi değerlendirmesine olanak sağlamıştır. Örneğin, farelerin LCMV (lymphocytic choriomeningitis virus) enfeksiyonuna karşı güçlü immün yanıtı uzun süreli hafıza ile ilişkili olan güçlü CD4+ T hücre sitokin yanıtları ile ilişkilidir ¹⁵.

Günümüzde ICS tekniği aşılama denemeleri sırasında immünojenite ölçüsü olarak T hücre reaktivitesini ölçmede en sık kullanılan yöntemlerden biridir. ICS’nin en büyük avantajı hücrelerin tekli olarak çeşitli özelliklerinin tespit edilebilmesidir. Yöntem hücre popülasyonlarının önceden zenginleştirilmesine gerek kalmaksızın tam kan veya PBMC’ler üzerinde gerçekleştirilir. Ayrıca yöntem hızlı ve az maliyetlidir. Kan alımından sonra yaklaşık 8 saat gibi kısa sürede sonuç verebilir. ICS, HIV aşı klinik çalışmalarında hem CD4+ hem de CD8+ T hücresi yanıtlarını izlemek için kullanılmıştır ¹⁶. Sirivichayakul ve ark. ¹⁷ Tayland’da yaptıkları bir faz I çalışmasında anti-HIV aşısının değerlendirilmesinde ICS testinin HIV aşısı immünojenitesini araştırmak için sınırlı kaynaklara sahip ülkelerde güvenilir bir şekilde kullanılabileceğini göstermişlerdir.

2. Tetramer Boyama (Tetramer Staining)
Antijen-spesifik T hücrelerinin kantitifikasyonu için kullanılan bir yöntem de tetramer boyamadır. “MHC tetramer boyama” olarak bilinen bu teknik, MHC-peptid komplekslerinin floresan oligomerleri kullanılarak flow sitometri ile antijen-spesifik T hücrelerinin analizine dayanmaktadır. İlk olarak 1996 yılında Altman ve ark. tarafından kullanılmıştır. Tetramerler T-hücre reseptörlerini güçlü bir avidite ile bağlayarak, yapısına konjuge edilmiş floresan molekülleri aracılığıyla etiketli hücrelerin tespit edilmesini sağlar ^{18, 19}.

2.1. MHC Sınıf I Tetramerleri
MHC moleküllerinin tetramerik kompleksleri, özellikle viral enfeksiyonlarda ve aşılama sonrası in vitro olarak antijene spesifik T hücrelerinin belirlenmesinde önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. T hücre fenotiplemesi, önceden toplam CD8 + T hücre havuzuna göre gerçekleştirilebilmiş bir metot iken daha sonraları MHC sınıf I tetramerlerinin geliştirilmesiyle birlikte rutin olarak antijen-spesifik T hücrelerin durumunu incelemek için kullanılmıştır. Bu tekniğin dayandığı temel prensip, antijen-spesifik T hücrelerin, MHC-peptid kompleksi içeren tetramerik molekül ile direkt olarak boyanmasıdır ^{20, 21}.

Sınıf I moleküllerinin ağır ve hafif zincirlerini oluşturan proteinler, peptid-MHC kompleksi oluşturmak üzere epitop peptitlerle kaynaştırılır, ardından oluşan kompleks saflaştırılarak bir enzim ile biyotinleme yapılır. Biyotin ile işaretlenen peptid-MHC kompleksi 4:1 oranında avidin ile karıştırılarak tetramerik yapı elde edilir. Avidin molekülü bir florokrom ile konjuge edilir, böylece tetramerler ile etiketlenmiş spesifik T hücreleri flow sitometri ile kolayca tespit edilebilir ²² (Şekil 2).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 2: Peptid-MHC tetramerlerinin yapısı 22

2.2. MHC Sınıf II Tetramerleri
Antijen-spesifik CD4 hücrelerini tanımlamak için MHC-II tetramerlerinin sentezi ve kullanımı ile ilgili ilk rapor 1999'da Novak ve ark. ⁴ tarafından verilmiştir. Sınıf II tetramerlerin geliştirilmesi, çözünür sınıf II-peptid komplekslerinin hazırlanmasındaki zorluklar, antijen-spesifik CD4+ T hücrelerinin düşük frekansta olması ve MHC-peptid kompleks molekülleri arasındaki düşük afiniteler nedeniyle sınıf I tetramerlerden daha zor olmuştur, bu nedenle problemlerin üstesinden gelmek için farklı stratejiler kullanılmıştır. Birçok MHC sınıf II multimeri, insekt hücrelerinde üretilen rekombinant proteinler kullanılarak yapılmıştır. Bazı araştırmacılar biotin-avidin bağlanmasına dayanan tetramerlere ek olarak, dimerler oluşturmak için sınıf II moleküllerini immünoglobulin ağır zincirine veya Fc kısmına bağlamışlardır. Bazı araştırmacılar ise peptid-MHC kompleksi oluşturmak için α ve β zincirlerinin kombinasyonunda lösin fermuarı kullanmışlardır. Bu stratejiler, antijene spesifik CD4+ T hücrelerini tespit etmek için kullanılan sınıf II tetramerlerinin başarılı bir şekilde üretilmesine yol açmıştır ^{4, 22}.

İnsan tetramerleri, çeşitli hastalık modellerindede hem CD8+ hem de CD4+ antijene spesifik T hücrelerini tanımlamak için başarıyla kullanılmıştır. İnfluenza aşısı ile ilgili yapılan bir çalışmada aşılama öncesi ve sonrasında spesifik CD8+ T hücreleri ölçmek için M1 peptidi ile HLA-A2 tetrameri kullanılmıştır. Yine kronik olarak Hepatit C virüsü (HCV) ile enfekte olmuş ve iyileşmiş hasta bireylerde HCV'ye özgü CD8+ T hücrelerinin tek hücre seviyesindeki efektör fonksiyonu ve fenotipini araştırmak için HCV NS3 epitopuna özgü HLA-A2 tetrameri kullanılmıştır ^{18, 23}.

Antijen-spesifik CD8+ T hücrelerinin tetramer boyaması, ICS’ye kıyasla hassasiyet açısından daha fazla avantaj sağlamıştır. Tetramer kullanımının dezavantajı, sadece spesifik bir MHC-peptid çiftini tanıyan T hücrelerinin, tek bir tetramer tarafından tespit edilebilmesi ve dolayısıyla antijen epitopa spesifik olmasıdır ¹⁸.

3. Aktivasyonla İndüklenmiş Markır Testi (Activation-İnduced Marker Assay-AIM)
Sınıf II multimerlerinin sentezi ve kullanımı ile ilgili zorluklara ve dolayısıyla epitopa özel CD4+ T hücrelerini tanımlama ve izole etme zorluğuna bağlı olarak, CD4+ T hücre fonksiyonunun moleküler temelinin anlaşılması CD8+ T hücrelerinin gerisinde kalmıştır. Dolayısıyla antijene spesifik T hücrelerinin canlı izolasyonuna izin veren bu yöntem gerekli görülmüştür ⁷.

Bu teknik, ICS'ye benzer bir şekilde uygulanabilir fakat, hücre içi sitokinleri boyamadan ziyade, PDL1, CD25 ve OX40 dahil olmak üzere T hücre reseptörüyle indüklenen hücre yüzeyi markırları için boyama yapılır. Bu markırların farklı kombinasyonları AIM+ T hücre popülasyonlarını tanımlamada kullanılmıştır. Bu yöntemin avantajı, tüm Th1, Th2, Th17, Tfh ve Treg gibi belirli bir sitokin veya efektör molekülleri saptaması ve daha geniş antijen-spesifik hücre popülasyonunu tespit edebilmesidir. Deney başlangıçta ICS ile saptanması zor olan T-foliküler helper hücrelerini saptamak için geliştirilmiştir, daha sonra ise aşılama ile veya enfeksiyonla antijene maruz bırakıldıktan sonra CD4+ T hücre değerlendirmesi için de kullanılmıştır. Yöntem ICS’den daha yüksek antijen-spesifik T hücre seviyelerini göstermiştir ^{7, 24, 25}. Yapılan bir çalışmada ^6, AIM analizlerinin hem CD4+ hem de CD8+ T hücrelerini tespit etmek için kullanılabileceği gösterilmiştir. Çalışmada CD8+ AIM yanıtları ICS’ye benzer sonuç verirken, CD4+ AIM yanıtları ise saptanmamıştır. Bu durumun nedeni, ICS ile karşılaştırıldığında AIM deneylerinin daha fazla CD4+ alt popülasyonu saptaması olarak düşünülmüştür. Yapılan bu çalışma AIM deneylerinin, tek başına ICS ile tespit edilmesi zor olan yeni bellek T hücre yanıtlarını saptamak için aşı çalışmalarında da kullanılabileceğini göstermiştir ²⁴. Zaunders ve ark. ²⁶ tarafından geliştirilen başka bir flow sitometri çalışmasında ise antijen-spesifik CD4+ T hücrelerini analiz etmek için CD25 (IL-2Ra) ve CD134/OX40 (bir TNF reseptörü aile üyesi) reseptörlerinin ortak ekspresyonu uygulanmıştır. COVID-19 enfeksiyonu geçirmiş hastalarda SARS-CoV-2'ye spesifik CD8+ T hücrelerini ölçmek için AIM ve ICS metodolojileri kullanılmıştır. CD8+ T hücre yanıtları AIM tarafından vakaların %70'inde saptanmıştır ²⁷.

4. Boncuk Temelli Akım Sitometri Yöntemi (Bead-Based Flow Cytometric Assay-Luminex ve LegendPlex^TM )
Yöntem yüksek doğruluk oranı, sensitivite, tekrarlanabilirlik, yüksek verim ve az miktarda numune (25-50μL gibi) kullanarak birden fazla analiti ölçme yeteneği nedeniyle sitokin testlerinde en çok kullanılan analiz yöntemlerinden biri olmuştur. Bu tür çalışmalar, mikrobeadlar üzerinde hareketsiz hale getirilen yakalama antikorlarını kullandığından sandviç ELISA prensibi üzerine inşa edilmiştir ²⁸.

Luminex deneyleri, farklı floresan (kırmızı ve kızılötesi) boyalarla boyanmış mikrometre ölçekli boncuklar (mikrosfer) kullanılarak çoklu sitokin analizlerinin yapılmasına yöneliktir. Boncuklar polistiren veya manyetik yapıda olabilir. Flow sitometride bu mikrosferlerin her birinin bir lazerle uyarılması sonucu farklı dalga boylarında ışık yayılmaktadır. Öncelikle her bir boncuk, yüzeyi bir yakalama antikoru (sitokin, kemokin veya bir enfeksiyon biyo-markırına spesifik) ile konjuge edilir. Daha sonra ilgilenilen biyolojik numune (serum veya hücre süpernatantı) her biri farklı bir sitokin için spesifik olan mikrosfer karışımı ile birleştirilir ve 96 kuyucuklu bir plaka içerisinde inkübe edilir. Biyolojik numune-mikrosfer karışımı daha sonra yıkanır ve istenen sitokinlere özgü bir tespit antikoru ilave edilir. Bu tespit antikorları ayrıca farklı floresan özellikteki bir raportör boya ile konjüge edilir. Bir kez daha yıkandıktan sonra mikrosfer-sitokin-raportör karışımı bir akış haznesinden geçirilerek tekli boncuklar bir süspansiyon halinde analiz edilir. Çeşitli mikrosfer setleri kullanarak 96 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğunda aynı anda 100'e kadar analit ölçülebilmektedir ^{24, 28, 29}.

Luminex, fizyolojik ve patolojik hastalık süreçlerinde sitokinlerin değerlendirilmesi ve analiz edilmesinde önemli bir araçtır ²⁹. Alhetheel ve ark. ³⁰ luminex yardımıyla MERS-CoV ile enfekte 49 hastada Th1/Th2 düzeylerini ortaya koymak için IFN-γ, IL-12, IL-2, IL-10, IL-13, IL-4 ve IL-5 plazma sitokin seviyelerini ölçmüştür. Hepatit B ile kronik olarak enfekte hastalarda serum HBV pregenomik RNA’nın Th1 ve Th2 ile korelasyonunu araştıran bir çalışmada ³¹ sitokin analizlerinin yapılmasında, Rubbo ve ark. ³² tarafından yapılan bir çalışmada HIV-1 ve HSV (Herpes Simplex Virus) ile ko-enfekte bireyler ile HIV-1 ile enfekte olmayıp HSV ile enfekte bireyler arasındaki T hücre yanıtlarının karşılaştırılmasında, Ebola virüs enfeksiyonunun (EBOV) patofizyolojisini anlamak ve hastalık mekanizması hakkında önemli biyobelirteçleri (T hücre, sitokin vb.) ortaya koymak için yapılan başka bir çalışmada ³³ luminex metodu kullanılmıştır.

Luminex teknolojisi, klinik öncesi ve klinik çalışmalarında aşılama ile indüklenen sitokin proteinlerinin araştırılmasında da kullanılmıştır. Groot ve ark. ³⁴ VZV aşılama sonrası Th1, Th2, Th17, Treg ve sitotoksik T hücre yanıtları (IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, IP-10, Granzyme B) için kullanmıştır. H5N1 ^5, HIV-1 ^35, EBOV ³⁶ gibi viral aşı çalışmalarında da kullanılmıştır.

BioLegend'in LegendPlex^TM testi ^37, iki temel antikor arasında bir analitin yakalandığı sandviç temelli immunoassay ile aynı temel prensipleri kullanan boncuk temelli bir immüno-assay yöntemidir.

LegendPlex testinin prensibi Luminex’e benzerdir. Bir analit-spesifik antikora konjuge edilmiş farklı düzeylerde APC floresan içeren boncuk kullanılır. Aynı zamanda bir numunenin saptanması için biyotin yakalama antikoru ve strepdavidin-PE reaktifi kullanılır. İki farklı büyüklükte boncuk kullanılarak farklı analitler renk ve boyut bazında ayırt edilebilir. Luminex platformuna kıyasla daha az sayıda analit tespit edilebilmektedir ²⁴ (Şekil 3).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 3: LEGENDplexTM prensibi 37

Dengue virüs enfeksiyonu sırasında Toll-like receptor 2’nin bir rol oynayıp oynamadığını araştıran bir çalışmada enflamatuar sitokin ekspresyonu LEGENDplex^TM ile analiz edilmiştir ³⁸. Farklılaşmış epitel hücrelerinin Respiratory Syncytial Virus enfeksiyonuna karşı antiviral yanıtını değerlendiren bir çalışmada ^39, enfeksiyondan sonraki 1, 2 ve 3. günlerde bazı sitokin seviyeleri LegendPlex antivirüs yanıt paneli kullanılarak ölçülmüştür. Başka bir çalışmada ^40, Batı Nil Virüsü enfeksiyonunda kapsamlı bir antiviral sitokin panelini (özellikle T lenfosit yanıtı ile ilgili olanlar) oluşturmak için bu yöntem kullanılmıştır.

1) Diker KS. İmmunoloji. 2. Baskı, Ankara: Medisan, 2005.

2) Doan T, Melvold R, Viselli S, Waltenbaugh C. İmmünoloji. Deniz G, Erten G, Camcıoğlu Y (Çevirenler). 1. Baskı, İstanbul: Nobel, 2013.

3) Vella LA, Herati RS, Wherry EJ. CD4 + T cell differentiation in chronic viral infections: The Tfh perspective. Trends Mol Med 2018; 23: 1072-1087.

4) Novak EJ, Liu AW, Nepom GT, Kwok WW. MHC class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen. J Clin Invest 1999; 104: 63-67.

5) Pedersen GK, Sjursen H, Nostbakken JK, et al. Matrix M (TM) adjuvanted virosomal H5N1 vaccine induces balanced Th1/Th2 CD4+T cell responses in man. Hum Vaccin Immunother 2014;10: 2408-2416.

6) Bowyer G, Rampling T, Powlson J, et al. Activation-induced markers detect vaccine-specific CD4⁺ T cell responses not measured by assays conventionally used in clinical trials. Vaccines (Basel) 2018; 6: 50.

7) Phetsouphanh C, Zaunders JJ, Kelleher AD. Detecting antigen-specific T cell responses: From bulk populations to single cells. Int J Mol Sci 2015; 16: 18878-18893.

8) Brown M, Wittwer C. Flow Cytometry: Principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 2000; 46: 1221-1229.

9) Taneli F. Flow sitometri tekniği ve klinik laboratuvarlarda kullanımı. Türk Klinik Biyokimya Dergisi 2007; 5: 75-82.

10) Perfetto SP, Chattopadhyay PK, Roederer M. Seventeen-colour flow cytometry: Unravelling the immune system. Nat Rev Immunol 2004; 4: 648-655.

11) Dalva K, Gülbaş Z. “Akım sitometri uygulamaları”. https://studylibtr.com/doc/1189994/akım-sitometri-uygulamaları/2006/ 10.02.2022.

12) Shacklett BL. Beyond 51Cr release: New methods for assessing HIV-1-specific CD8+ T cell responses in peripheral blood and mucosal tissues. Clin Exp Immunol 2002; 130: 172-182.

13) De Rosa SC. Vaccine applications of flow cytometry. Methods 2012; 57: 383-391.

14) Maecker HT, Maino VC. Analyzing T-cell responses to cytomegalovirus by cytokine flow cytometry. Hum Immunol 2004; 65: 493-499.

15) Maino VC, Maecker HT. Cytokine flow cytometry: A multiparametric approach for assessing cellular immune responses to viral antigens. Hum Immunol 2004; 110: 222-231.

16) Freer G, Rindi L. Intracellular cytokine detection by fluorescence-activated flow cytometry: Basic principles and recent advances. Methods 2013; 61: 30-38.

17) Sirivichayakul S, Thantiworasit P, Chatkulkawin P, et al. Immunogenicity assay validation for an HIV vaccine trial: High IFNγ+/IL-2+ CD8+ T cells background in healthy Thais. Vaccine 2011; 29: 6002-6007.

18) Saade F, Gorski SA, Petrovsky N. Pushing the frontiers of T-cell vaccines: Accurate measurement of human T-cell responses. Expert Rev Vaccines 2012; 11: 1459-1470.

19) Vollers SS, Stern LJ. Class II major histocompatibility complex tetramer staining: Progress, problems, and prospects. Immunology 2008; 123: 305-313.

20) Gillespie GMA, Appay V, Rowland-Jones SL, McMichael AJ. The use of tetramers in the quantitative analysis of T-cell responses. Methods in Microbiology 2002; 125-156.

21) Male D, Brostoff J, Roth D, Roitt IM. İmmünoloji. İmir T (Çeviri Editörü). 7. Baskı, Ankara: Palme, 2008.

22) Kita H, He XS, Gershwin ME. Application of tetramer technology in studies on autoimmune diseases. Autoimmun Rev 2003; 2: 43-49.

23) Wedemeyer H, He XS, Nascimbeni M, et al. Impaired effector function of hepatitis C virus-specific CD8+ T cells in chronic hepatitis C virus infection. J Immunol 2002; 169: 3447-3458.

24) Flaxman A, Ewer K. Methods for measuring T-Cell memory to vaccination: From mouse to man. vaccines 2018; 6: 43.

25) Reiss S, Baxter AE, Cirelli KM, et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One 2017; 12: e0186998.

26) Zaunders JJ, Munier ML, Seddiki N, et al. High levels of human antigen-specific CD4+ T cells in peripheral blood revealed by stimulated coexpression of CD25 and CD134 (OX40). J Immunol 2009 ; 183: 2827-2836.

27) Grifoni A, Weiskopf D, Ramirez SI, et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell 2020; 181: 1489-1501.

28) Kupcova-Skalnikova H, Cizkova J, Cervenka J, Vodicka P. Advances in Proteomic Techniques for Cytokine Analysis: Focus on Melanoma Research. Int J Mol Sci 2017;18: 2697.

29) Khalifian S, Raimondi G, Brandacher G. The use of luminex assays to measure cytokines. J Invest Dermatol 2015; 135: 1-5.

30) Alhetheel A, Albarrag A, Shakoor Z, et al. Assessment of Th1/Th2 cytokines among patients with Middle East respiratory syndrome coronavirus infection. Int Immunol 2020; 32: 799-804.

31) Gu Y, Chen L, Lian Y, et al. Serum HBV pregenomic RNA is correlated with Th1/Th2 immunity in treatment-naive chronic hepatitis B patients. J Med Virol 2020; 92: 317-328.

32) Rubbo PA, Tuaillon E, Nagot N, et al. HIV-1 infection impairs HSV-specific CD4(+) and CD8(+) T-cell response by reducing Th1 cytokines and CCR5 ligand secretion. J Acquir Immune Defic Syndr 2011; 58: 9-17.

33) Kerber R, Krumkamp R, Korva M, et al. Kinetics of soluble mediators of the host response in ebola virus Disease. J Infect Dis 2018; 218: 496-503.

34) Groot N, Pileggi G, Sandoval CB, et al. Varicella vaccination elicits a humoral and cellular response in children with rheumatic diseases using immune suppressive treatment. Vaccine. 2017; 35: 2818-2822.

35) Moyo N, Borthwick NJ, Wee EG, et al. Long-term follow up of human T-cell responses to conserved HIV-1 regions elicited by DNA/simian adenovirus/MVA vaccine regimens. PLoS One 2017; 12: e0181382.

36) Dahlke C, Kasonta R, Lunemann S, et al. Dose-dependent T-cell dynamics and cytokine cascade following rVSV-ZEBOV immunization. Ebio Medicine 2017; 19: 107-118.

37) Anonymous. “Legendplex”. https://www.biolegend. com/legendplex/14.06.2018.

38) Aguilar-Briseño JA, Upasani V, Ellen BMT, et al. TLR2 on blood monocytes senses dengue virus infection and its expression correlates with disease pathogenesis. Nat Commun 2020; 11: 3177.

39) Rijsbergen LC, Lamers MM, Comvalius AD, et al. Human respiratory syncytial virus subgroup A and B infections in nasal, bronchial, small-airway, and organoid-derived respiratory cultures. mSphere 2021; 6: e00237-21.

40) Zidovec-Lepej S, Vilibic-Cavlek T, Barbic L, et al. Antiviral cytokine response in neuroinvasive and non-neuroinvasive west nile virus infection. Viruses 2021; 13: 342.