Virüs : Bu çalışmada, sığır vebası virüsünün aşı suşu (RBOK) kullanıldı. Bu virüs Afrika Yeşil Maymun Böbrek (Vero) epitel hücresinde üretildi. Sitopatik etki %80’ne ulaştığı zaman enfekte hücre üst sıvısı toplandı. Virüsün hücre kültüründeki enfeksiyözite gücü DKID
50: 10
4.5/0,1 ml olarak belirlendi. Enfekte hücre üst sıvıdan polietilen glikol (PEG) presipitasyon metoduyla kısmi pürifiye virüs elde edildi
13.
Farelerin İmmunizasyonu : İmmunizasyonlarda 6-8 haftalık 5 tane dişi Balb/c fareleri (Gebze Marmara Araştırma Enstitüsü, Kocaeli) kullanıldı. Polietilen Glikol presipitasyon yöntemi ile elde edilen RPV antijeninin 200 µl ile Freund Complete Adjuvant’ın (Sigma Chemical Co., St. Louis MO., USA) 200 µl’si çift geçişli enjektör kullanılarak emülsifiye edildi 14. Bu karışım farelere intraperitonal (İP) yolla verildi. İlk immunizasyondan 15 gün sonra, aynı miktarda virüs bu kez Freund Incomplete Adjuvant (Sigma Chemical Co., St. Louis MO., USA) ile emülsifiye edilerek, İP yolla uygulandı. İmmünizasyondan bir hafta sonra farelerden intraorbital yolla kan alınarak serumları çıkarıldı. Elde edilen bu serumlar ELISA ile test edilerek en iyi immun yanıtı veren fare belirlendi. Bu fareye İP yolla 500 µl kısmi pürifiye RPV antijeni tekrar verildi. Bu farenin dalak hücreleri immunizasyondan üç gün sonra füzyonda kullanıldı.
Füzyon : En son immunizasyondan üç gün sonra füzyonda kullanılacak fare dislokasyon yöntemiyle öldürüldü. Bu farenin dalağı çıkartıldı ve dalak hücreleri hücre vasatı ile 3 kez yıkandı. Füzyondan bir hafta önce hücre üretme vasatında (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Nutrient Mixture F-12; Sigma Chemical Co., St. Louis MO., USA) üretilmeye başlayan myeloma hücreleri (FO; American Type Culture Collection, MD, USA) de eş zamanlı olarak hücre vasatında yıkandı. Füzyon amacıyla yaklaşık 20 milyon myeloma hücresi ve 80 milyon dalak hücresi PEG/DMSO ile füzyon işlemine tabi tutuldu. Hücreler %20 fötal calf serum (FCS) ve HAT (hipoksantin-aminopterin-timidin) içeren seçici vasatla süspanse edildi. Hücre süspansiyonları 24 kuyucuklu hücre kaplarının her kuyucuğuna 1 ml olarak dağıtıldı. Kaplar % 5 CO2 içeren etüve kaldırıldı 14.
Füzyonun beşinci gününde kontrol kuyucukları hariç tüm kuyucuklardan vasat alınarak alınan miktar kadar HAT’lı vasat bırakıldı. Takip eden günlerde üç gün arayla aynı işlem tekrar edildi. Füzyonun 14. gününden sonra, kuyucuklardan alınan HAT’lı vasat yerine aynı miktarda HT (hipoksantin-timidin) içeren vasat bırakıldı. Üremenin olduğu kuyucuklar belirlenerek bu kuyucuklardan üst sıvı alındı ve ELISA’da test edildi 14.
Enzime Bağlı İmmunosorbent Deneyi : Farelerin immunize edilmesinde PEG pürifiye RPV antijeni kullanılmasına rağmen, ELISA’da üst sıvıları test etmek için ELISA kaplarına tam pürifiye RPV antijeni (Hayvan Sağlığı Enstitüsü, Pirbright, UK) kaplandı. Hibridoma üst sıvıları ile immun fare, non-immun fare ve FO üst sıvıları tam pürifiye RPV antijeni bağlı kaplarda Doymaz ve ark. tarafından bildirilen yöntemle test edildi 14.
Limiting Dilüsyon : ELISA sonucu, RPV’a özgül antikor salgıladıkları belirlenen kuyucuklardaki hücreler 25 cm2’lik hücre üretme kabına alınarak çoğaltıldı. Çoğaltılan bu hücrelerin ¾ dondurulurken, geri kalan hücrelerle limiting dilüsyon işlemi yapıldı 15. Bu işlemde 1 ml vasata 10 tane hücre düşecek şekilde dilüsyonun yapılması ve böylelikle 96 kuyucuklu kapların her kuyucuğa bir hücre düşürülmesi amaçlandı. Bir ml vasat içinde sulandırılan hücreler 10 adet kuyucuğa aktarıldı ve tek hücre düşen kuyucuklar işaretlendi. Bu kuyucuklar yeterli hücre sayısına ulaştıklarında, üst sıvılarından ELISA işlemi tekrarlandı. ELISA’da pozitif olduğu belirlenen kuyucuklardaki hücreler 25 cm2’lik hücre üretme kaplarında çoğaltıldı. Bu kaplardaki üst sıvılar 10 gün sonra toplandı ve üst sıvılar SDS-PAGE ve immunblotting ile test edildi. Ayrıca, üst sıvılar SDS-PAGE ve immunblotting sonuçları alındıktan sonra alt tip tayininde kullanılmak için – 20 ºC’ye kaldırıldı.
Kaplarda kalan hücreler sırasıyla 75, 125 ve 250 cm2’lik hücre kültür kaplarında çoğaltıldı. Üst sıvılar saklanırken hücreler dondurularak azot tankında saklandı. Bu hücreler 2 ay sonra çözdürülerek antikor üretme yeteneği ELISA ile tekrar test edildi.
Antikorların alt tip tayinlari, ticari (Sigma Chemical Co., St. Louis MO., USA) bir fare IgG tiplendirme kiti (Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagent) kullanılarak belirlendi.
SDS-PAGE ve immunblotting : Bu amaçla, ilk olarak, PEG pürifiye RPV ve enfekte olmayan Vero proteinleri %5 yığımlayıcı ve % 10 çözücü jelde yürütüldü. Daha sonra yürütülen proteinler nitroselüloz membrana trasfer edildi. Transfer işlemini takiben nitroselüloz membran uzun şeritler halinde kesildi. Bu şeritler kullanılarak ELISA pozitifliği belirlenen ve 25 cm2’lik hücre üretme kaplarında çoğaltılan füzyon üst sıvıları Doymaz ve ark. tarafından bildirilen yöntemle test edildi 14. İmmunoblotting de belirlenen bantların yaklaşık büyüklüğü üretici firmanın belirtmiş olduğu metot kullanılarak (Sigma Chemical Co., St. Louis MO., USA) Relative mobility (Rf) hesaplamasına göre belirtildi.
Nötralizasyon : SDS-PAGE and immunblotting ile H proteinine karşı antikorların belirlendiği üst sıvıların nötralizan etkileri Vero hücreleri üzerinde test edildi 16.