Bilgi taşıyıcısı olarak görev yapan DNA, RNA’ya göre daha önemli ve geniş ölçüde dikkati çekmektedir. Organizmalarda ve fajların çoğunda DNA karakteristik bir molekül oluşturur. Kalıtımda aktif olarak rol alan DNA her zaman çekirdeğin içinde ve bazen de hücrenin diğer bölümlerinde bulunmakta olup, gelişmiş canlılarda kalıtsal materyalin temelini oluşturur
1.
Amerikalı genetikçi James WATSON ve İngiliz Fizikçi Francis CRICK, 1953’lerde X ışını örneklerini ve karakteristik baz çifti özelliklerini dikkate alarak çift zincirden meydana gelen DNA’nın üç boyutlu bir eksen doğrultusunda sağ el çift sarmalı meydana getirdiğini tespit etmişlerdir. DNA’nın bu iki sarmalı birbirine paralel olmayan biçimde seyretmektedir. Yani zincirlerden birinin 31 ucu ve diğerinin 51 ucu aynı tarafta bulunmaktadır. DNA’nın omurgasını oluşturan ve hidrofilik özelliğe sahip olan şeker ve negatif yüklü fosfat üniteleri çift sarmalın dışa bakan yüzünde ve kendilerini saran su molekülüne dönüktür. Hidrofobik olan purin ve primidin bazları ise çift sarmalın içe bakan yüzünde ve ana eksene dikey olarak yer alırlar. Karşı karşıya duran bazlardan biri purin ise diğeri mutlaka primidin olmalıdır. İki purin bu yapı için büyük iki primidin ise küçüktür. DNA yapısındaki Adenin (A) daima iki hidrojen bağı ile Timin (T)’e ve Guanin (G) ise daima üç hidrojen bağı ile Sitozin (C)’e bağlanır 2.
Bu derlemede spermatozoonun DNA yapısı, spermatozoon DNA’sı hasarına neden olan durumlar, hasarların tespit metotları ve bu hasarların oluşmasını engelleyecek çeşitli önlemlerle ilgili veriler sunulmuştur.
Spermatozoon DNA’sı
Somatik hücrede DNA her dönüşünde 6 adet nükleosom içeren bobin spiralleri (selonoit) halinde sıkıştırılmış olup 60.000 baz çifti aralığında nükleer matrikse yapışık vaziyette bulunur. Aktif genler nükleer matriks ile ilgili olmaya meyillidir. Spermatozoon nükleusunda protaminler DNA ya bağlıdır, onun negatif yükünü nötralize eder ve sıkı halkalar şeklinde kangallanır 3. Memelilerde sperm nükleusu nükleer halka denilen tek tip bir yapı içerir. Spermatozoon çekirdeğinin DNA’sı bu halkaya demirlenmiş bir şekilde bulunur. DNA spermatogenezis sırasında spermatoozoona özel protaminler ile nükleer histonların bir araya gelmesiyle sıkılaştırılmaktadır. Sıkılaşmış DNA, protaminler üzerinde bulunan sülfidril gruplarının oksidasyonuyla şekillenen disülfid bağları sayesinde bir arada tutulan kangallaşmış, ortası delikli çörek benzeri olan kromatin, bir spiral şekildedir 4-6. Bu spiraller normal somatik hücrenin tipik bobin benzeri spiral DNA’sından çok daha dar bir yapıya sahiptir.
Spermatozoon DNA’sındaki Hasar ve Önemi
Çeşitli iç ve dış nedenlerden dolayı DNA’da farklı düzeyde hasarlar meydana gelmektedir 7. Spermatozoon DNA’sı hasarına insan 8,9,10 ve fare 11,12, at 13, domuz 8, balık 4,14,15 gibi pek çok hayvan türünde rastlanmaktadır. DNA da oluşan bu hasarların başlıcaları; kromatin yapısının bozulması, DNA bazlarının oksidasyonu, yanlış eşleşmesi ve tubulin polimerizasyonun baskılanması, bazların kimyasal olarak değişmesi 16 kromatin yapısındaki anomaliler 17, DNA zincirinin kırılması, DNA-DNA ve DNA-protein çaprazlaşmaları 4,16, DNA da mutasyonlar 18 gibi bir takım yapısal bozulmalardır.
Spermatozoondaki DNA hasarı ile spermanın yoğunluğu, morfolojisi, motilitesi gibi parametreler arasında bir ilişki olup olmadığı pek çok araştırmacı tarafından araştırılmıştır 19-26. Bazı araştırmacılar spermatozoadaki DNA hasarı ile spermanın kalitesi arasında bir ilişki olduğunu 19,22,24,26, bazıları ise böyle bir ilişkinin olmadığını 20,21 ifade etmişlerdir. Saleh ve ark. 27 yaptıkları çalışmada spermatozoon DNA’sındaki hasarın üreme üzerine olumsuz etkisi olduğu sonucuna varmışlardır. ROS (reaktif oksijen türleri)’un sebep olduğu DNA hasarı hücrelerin apoptozisini (programlı hücre ölümü) hızlandırmaktadır. Bu da infertiliteye sebep olan spermatozoa sayısının azalması ile ilgili olarak, üreme üzerine olumsuz bir etki yapmaktadır 28. İnsanlar 26, istiridyeler 29, fareler 30 ve balıklarda 16 spermanın dondurularak saklanmasının DNA hasarına ve dolayısıyla anormal embriyo gelişimine ve infertiliteye neden olduğu belirtilmiştir. Hatta DNA’sı hasarlı olan spermatozoonlar embriyonik gelişimi olumsuz etkilemekle birlikte genetik hastalık riskini de artırmaktadır 31. Yine sigara içen babaların spermatozoonlarındaki DNA hasarına bağlı olarak çocuklarında doğmasal anomaliler, kusurlar ve çocukluk çağında kansere yakalanma oranı artmaktadır 32-34. Bununla birlikte Guerin ve Benchaib 35 ise spermatozoon DNA’sının kalitesi ile doğumdaki anomaliler arasında herhangi bir ilişkinin olmadığını bildirmektedirler.
Spermatozoon DNA’sında Hasara Neden Olan Faktörler
1. İn vivo faktörler: Spermatozoon özellikle genotoksikler olarak bilinen ve DNA’da hasara yol açan toksik maddeler başta olmak üzere pek çok in vivo faktör tarafından hasara uğratılmaktadır. Bu konuda yıllardan beri çeşitli araştırmalar yapan bilim adamları DNAdaki hasarın fiziksel veya kimyasal etkiler sonucunda meydana geldiğini bildirmektedirler. Bu faktörlerden bazıları şunlardır:
a) Sigara
Sigara DNA hasarını artıran mutajen veya karsinojen maddeler olarak bilinen veya varsayılan maddeleri (nitrozaminler ve polisiklik aromatik hidrokarbonlar-PAH) içermektedir 7. Sigara dumanındaki mutajenik etkiye bağlı olarak sperma kalitesinde özellikle spermatozoon sayısı, motilite oranı ve anormal spermatozoon oranında önemli düşüşler meydana gelmektedir 18,32-34. Sigara içmeye bağlı olarak insan spermasında anöploidi (kromozom anomalileri) seviyesi de artmaktadır 18. Ayrıca sigara içilmesine bağlı olarak seminal plazmadaki antioksidant seviyesinin düşmesi sonucunda da DNA hasarının arttığı bildirilmektedir 36,37. Yapılan araştırmalar sigara içme oranı ile spermatozoon DNA’sında meydana gelen hasar arasında önemli derecede pozitif bir ilişkinin olduğunu ortaya koymaktadır 38,39.
Bir babanın sigara içmesi, kendi androjen seviyesinde değişimlerle birlikte bu babadan doğan çocuklarda da doğmasal anomaliler ve hatta çocukluk çağında bile çeşitli kanserlere neden olabilmektedir 18. Genotoksik maddeler spermatozoon hücresinde mutasyonu indükleyebilir ve yavruya geçip onların gelişimini etkileyerek, kanser meydana getirebilir 40. Kimyasal karsinojenlerin DNA’yı etkileyen metabolitleri kan yoluyla diğer doku ve organlara taşınabilmektedir 41. Ancak Sertoli hücrelerindeki kan-testis bariyerinden dolayı gelişen cinsiyet hücreleri ile kan dolaşımı doğrudan temas içerisinde değildir. Bununla birlikte nikotin ve nikotin metabolitlerine sigara içen kişilerin spermasında rastlanması 38 DNA’yı etkileyen metabolitlerin bu engeli aşıp cinsiyet hücrelerini etkilediğini göstermektedir 7. Gaspari ve ark. 39 yaptıkları araştırma sonucunda tespit ettikleri PAH-DNA kompleksinin spermatozoa DNA’sındaki hasarın bir kanıtı olduğunu bildirmişlerdir. Aynı araştırmacılar sigara içmeksizin PAH bileşiklerine maruz kalan insanlarda da PAH-DNA kompleksinin yüksek bulunduğunu iddia etmektedirler. Erkek cinsiyet hücresinin DNA’sındaki hasar spermatogenezis esnasında tamir edilmezse, bu hasar birikerek artış gösterir 7. Olgun spermatozoon hücresinin bu hasara karşı küçük çaplı bir tamir mekanizmasına sahip olup olmadığı halen bir tartışma konusudur 18,42. Fraga ve ark. 43 spermatozoon DNA’sının hasara uğraması için oksidatif hasarın gerekli olmadığını ve DNA’sı hasarlı bir spermatozoonun da fertilizasyonu başarabildiğini, askorbik asitin de insan spermatozoasında oksidatif DNA hasarına karşı koruyucu bir etkiye sahip olduğunu ileri sürmektedir.
b) Varikosel
Varikoselin spermatozoondaki DNA hasarına nasıl yol açtığı henüz tam anlaşılmamasıyla birlikte Fujisawa ve ark. 44 varikoselli hastaların testis dokusunda DNA polimeraz seviyesinde önemli bir azalma olduğunu ve bu enzimin eksikliğinin spermatogenezis üzerine olumsuz bir etki yaparak DNA hasarı meydana getirebileceğini ileri sürmüşlerdir.
Varikoselli fertil veya infertil hastalarda yapılan araştırmalar seminal oksidatif strese bağlı yan ürün (ROS) düzeyinde artma ve toplam antioksidant kapasitede (TAK) azalmaların meydana geldiğini ortaya koymaktadır. Artan seminal oksidatif stres ürünleri spermatozoon DNA’sındaki hasarla birlikte spermatozoonun plazma membranında lipid peroksidasyona, spermatozoon motilitesi, metabolizması ve fertilizasyon kapasitesinde ise azalmalara neden olarak spermatozoonun fonksiyonunu engellemektedir 45. Ayrıca oksidatif stres spermatozoonun kromatin bütünlüğünü etkileyerek tek ve çift DNA sarmalı kırılmalarına sebep olmaktadır 46.
c) Yaş
Yaşlanma ile doğru orantılı olarak spermatozoon DNA’sında hasar meydana gelmektedir. DNA çift sarmalındaki hasar ile spermatozoondaki apoptozisin yaşlanmaya paralel olarak artmakta olup bu artış muhtemelen spermatogenezis esnasında ve sonrasında hücre seçim sistemindeki yetersizliğin bir sonucu olarak ortaya çıkmaktadır 47. Bazı araştırıcılar 22,48 normal ve infertil erkeklerde sperm motilitesi ile yaş arasında pozitif bir ilişkinin bulunduğunu, yaşa bağlı azalan spermatozoa motilitesi ve artan DNA hasarının muhtemelen sperma süspansiyonu içerisindeki lökositler tarafından üretilen reaktif oksijen moleküllerinden kaynaklandığını ileri sürmektedirler. Narendra ve ark. 47 ise yaş ile spermadaki lökosit sayısı ve reaktif oksijen türleri arasında bir ilişkinin olmadığını, yaşın ilerlemesiyle spermatozoon DNA’sında meydana gelen hasarlar arttığını ve bu hasarlı hücrelerin eliminasyonunun da güçleştiğini bildirmektedirler.
d) Genotoksikantlar
Genotoksikler yani hücre DNA’sında hasara yol açan maddeler DNA’da mutasyona ve kötü huylu kansere yol açmaktadır. Genotoksikant maddelerin spermatozoa DNA’sına verdiği hasarlarla ilgi pek çok araştırma yapılmıştır. Bu maddelerden biri olan vanadium, özelikle volkanik bölgelerdeki yeraltı sularında bulunmakta olup 49 spermatozoon DNA’sında hasara neden olduğu tespit edilmiştir 17. Prooksidant özelliğe sahip olan demir elementi ile oluşturulan oksidatif strese bağlı DNA hasarı ve spermatogenetik fonksiyon bozukluğu meydana gelmektedir. Daha da önemlisi uzun süreli demir verilmesini takiben canlı vücudunda oksidatif strese bağlı olarak mayoz sonrası testis hücrelerinde meydana gelen DNA hasarının yanısıra spermatozoonun fizyolojisi ve fonksiyonunda bozukluklar oluşmaktadır 11.
Kemoterapotik ajan olan cisplatin de spermatozoonun baş kısmında anomalilere 50 ve spermatozoon DNA’sında hasara sebep olan genotoksik bir maddedir 12. Genotoksik maddelerin spermatozoon DNA’sına verdiği zararlarla ilgili yapılan diğer çalışmalar acrylonitrile 51, tamoxifen 52, cyclophosphamide 53,54, styrene 54 ve acrylamide 55 gibi pek çok maddenin genotoksik etkiye ve spermatozoon DNA’sında hasara neden olduğunu ortaya çıkarmıştır.
e) Çevre
Çevresel şartlar spermatozoon DNA’sında meydana gelen hasarın artmasında rol oynamaktadır. Bu şartlar DNA’nın bozulmasına sebep olabilir, spermatogenezis boyunca DNA tamirini engelleyebilir veya azaltabilir ya da hücrede apoptozis oluşturabilir. Bu yüzden ideal çevrede genç bir bireyin sperematozoasında minimal DNA hasarı ve daha az apoptozis görülür. Seminal plazmada antioksidan seviyesinin yüksek olması sperma-tozoonu çevresel DNA hasarına karşı korur. Bu nedenle antioksidanca zengin bir çevre hem testisteki hem de fertilizasyon için ovuma doğru giden spermatozoon DNA’sının bütünlüğünün sağlanması için taşınma süresince en uygun şartları sağlamaya yardımcı olabilir. Bunun tersine genç bir bireyde spermatozoanın antioksidanca yetersiz bir çevrede bulunması DNA hasarı ve apoptoziste artmaya yol açar 47. Alkol tüketimi 56 ve kafein alınması 57 da sperma kalitesini etkilemekle birlikte yavrularda doğmasal bozukluklara 58, kanser 59,60 ve mental hastalıklar 61 gibi üreme ile ilgili önemli problemlere yol açabilmektedir. Diğer taraftan Horak ve ark. 7 ile Gaspari ve ark. 39 ise kahve ve alkol tüketimi ile DNA hasarı arasında bir ilişkinin olmadığını ileri sürmektedir. Sperma kalitesi üzerine zararlı etkisi olan diğer çevresel faktörlerden phthalates [phthalik asit esterleri içeren plastik sanayisinde ve diğer endüstriyel alanlarda kullanılan organik bileşikler (C6H42)] gibi endüstriyel kimyasallar 62 ve tanı amacıyla yapılan radyasyonların (röntgen ışınları) da 59 sperma-tozoon DNA’sı üzerine zararlı etkileri bulunmaktadır.
2. İn vitro faktörler: Spermatozoon DNA’sında hasara neden olan in vitro faktörler genellikle spermanın işlenmesi aşamalarında kullanılan tekniklere bağlı olarak ortaya çıkmaktadır. Spermanın alınmasından dişinin tohumlanmasına kadar geçen bu süre içerisinde uygun tekniklerle alınan sperma uygun şekillerde işlemlere tabi tutulur. Bu süreçte spermatozoa DNA’sında hasar meydana gelebilmektedir.
a) Spermanın kısa süreli saklanması
Kısa süreli saklama ile damızlıktan alınan sperma uygun sulandırıcılarla ve uygun tekniklerle sulandırılarak buzdolabında (+4 ºC) 3-5 gün saklanabilmektedir. Bu işlem, kısa süre içerisinde tohumlanacak hayvanların varlığında başvurulabilecek bir uygulamadır. Kısa süreli saklamanın spermatozoon DNA’sında hasar oluşturduğuna dair çok fazla bilgi olmamasıyla birlikte Boe-Hansen ve ark. 63 domuz spermasını sulandırdıktan sonra 18 ºC de 5 gün saklamışlar ve 3. günün sonunda spermatozoa DNA hasarı indeksinde önemli artışların olduğunu bildirmişlerdir. Fraser ve Strzezek 42 de domuz spermasını farklı sulandırıcılar kullanarak 5 ve 16 ºC’de kısa süreli olarak sakladıklarında sulandırıcıların niteliğine göre DNA hasarı düzeyinin değişiklik gösterdiğini tespit etmişlerdir. Spermanın kısa süreli saklanması esnasında sulandırıcıya antioksidan maddelerin katılmasıyla serbest radikal oluşumunun azalmasına bağlı olarak DNA’da şekillenebilecek hasar minimize edilebilir 64.
b) Spermanın uzun süreli saklanması
Spermanın uzun süreli saklanması; kullanılan damızlık hayvanın spermasından daha uzun süre istifade edilmesi hatta damızlık ölse bile spermasının kullanılabilirliğinin sağlanması açısından oldukça önemlidir. İnsanlarda testiste hasara veya ejakülasyonda bozukluklara yol açan bazı sitotoksik kemoterapotiklerin kullanımı, ışın tedavisi ve cerrahi müdahalelerden önce spermanın daha sonra kullanılmak üzere alınıp dondurulması sık sık başvurulan bir yöntemdir 65,66.
İnsan 8,65 dâhil olmak üzere geyik 67, aygır 13, domuz 8 ve balık 4,15 gibi pek çok hayvan türünde spermanın uzun süreli saklanması için yapılan işlemler esnasında spermatozooanda DNA hasarının oluşup oluşmadığı ile ilgili bir takım araştırmalar yapılmıştır. Yapılan çalışmalar spermanın dondurulup çözdürülmesi sırasında spermatozoa DNA’sında hasarın oluştuğunu ortaya koymaktadır.
Spermanın dondurularak saklanması işlemleri sırasında herhangi bir uygulama basamağında uygun olmayan bir işlemin yapılması, bu uygulamalar esnasında spermatozoon DNA’sında meydana gelebilecek muhtemel hasarın düzeyinde artışa sebep olacaktır.
c) Seminal plazma
Seminal plazmada antioksidan seviyesi azaldığında oksidatif strese bağlı olarak DNA hasarı düzeyinde artış görülmektedir 68. Alkan ve ark.69 seminal plazmada antioksidan seviyesinin azalması sonucu reaktif oksijen moleküllerinin artmasından dolayı DNA hasarından kaynaklanan infertilite meydana geldiğini bildirmektedir.
d) Sulandırma oranı
Bu konuyla ilgili hemen hemen hiç bilgi bulunmamakla birlikte Cabrita ve ark. 4 alabalık ve çipuralarda yaptıkları çalışmada spermayı dondurmadan önce 1: 6 ve 1: 20 oranında sulandırdıklarında; oluşan DNA hasarı sırasıyla %28.2 ve %41.4 olarak tespit etmişlerdir. Sonuçta spermaya yüksek düzeyde sulandırıcı katılmasının DNA hasarını arttırdığı kanısına varmışlardır.
e) Reaktif oksijen moleküllerine maruz kalma
Aslında reaktif oksijen molekülleri sınırlı seviyede olduğunda spermatozoanın kapasitasyonu sırasında fizyolojik role sahiptir 70-72. Ancak yüksek düzeyde reaktif oksijen moleküllerine maruz kalma spermatozoa DNA’sında hasara ve lipit peroksidasyona neden olmaktadır 68,73. Baumber ve ark. 13 Aygır spermasındaki reaktif oksijen moleküllerinin ve spermayı dondurarak saklamanın DNA hasarı üzerine etkisi ile ilgili yaptıkları çalışmada hidrojen peroksitin bu hasarda rolü olduğunu fakat süperoksit dismutazın herhangi bir etkisinin olmadığını belirtmişlerdir. Yine bu çalışmada antioksidan olarak alfa-tokoferol (0. 1 mM) kullanıldığında dondurmayı takiben oluşan DNA hasarının azaldığını tespit etmişlerdir.
f) Kryoprotektanlar
Spermayı dondurarak saklama esnasında spermatozoonda oluşabilecek zararlı etkiler kryoprotektan maddeler kullanılarak azaltılabilmektedir. Hemen hemen her türün sperması farklı özelliklere sahip olduğu için dondurma işleminden önce spermaya katılacak olan kryoprotektanın çeşidi, yoğunluğu ve spermanın kryoprotektana maruz bırakılma süresi türe göre ayarlanması gerekir 74. Farklı türlerin spermasının kryopreservasyonunda dimetil sülfoksit (DMSO), gliserol, propilen glikol, metanol, butandiol asetamid ve 1,2- propandiol gibi kryoprotektanlar yaygın olarak kullanılmaktadır 75,76. Kryoprotektanlar dondurma esnasında spermatozoonun baş kısmındaki intrasellüler kompartmana geçerek sıvının donmasını ve buz kristallerinin oluşmasını seçici olarak engeller. Yapılan araştırmalar dondurma amacıyla spermaya kryoprotektanların katılmasının spermatozoon DNA’sında herhangi bir hasara neden olmadığını göstermektedir. Diğer bir ifadeyle spermaya kryoprotektan katılıp katılmaması spermatozoon DNA’sını etkilememektedir 21,77.
Spermatozon DNA’sındaki Hasarın Ölçülmesinde Kullanılan Yöntemler
I. Basit hücre jel elektroforezi (Comet): Spermatozoon DNA’sındaki hasarın düzeyinin ölçülmesinde kullanılan en yaygın ölçme yöntemlerinden birisi basit hücre jel elektroforez yöntemi ya da kısa adıyla Comettir. Bu yöntem pek çok çalışmada kullanılan görsel floresan bir tekniktir 9,15,29,78. Bu ölçüm yönteminde yapılan işlemler laboratuardan laboratuara farklılık göstermekle beraber prensip olarak; sperma süspansiyonunun hazırlanması, jel yerleştirilmesi, hücre lizisi, DNA sarmalının çözülmesi, elektroforez, nötralizasyon, DNA boyama ve Comet şekil analizi şeklinde tanımlanabilir. Kısaca yapılan işlemler şöyledir;
1. Spermatozoa yıkama: sperma fosfat buffer solüsyonu ile iki kez yıkanır ve bu solüsyon ile 2 milyon sperm/ml olacak şekilde yeniden sulandırılır.
2. Slayt hazırlama ve jel yerleştirme:
2.1. %0.75’lik normal erime noktasındaki agarozdan 100 µl tamamen dondurulmuş slaytın üzerine bırakılır ve jel oda ısısında en az 5 dakika bekletilerek katılaştırılır.
2.2. 72 µl %0.75’lik düşük erime noktasına sahip agaroz ile 8 µl sperma süspansiyonu karıştırılır ve ilk tabakanın en üstüne karışım ilave edilir.
2.3 Jel 4 ºC’de 8 dakika katılaştırıldıktan sonra üçüncü tabaka olan 100 µl %0.75’lik düşük erime noktasındaki agaroz ilave edilir ve 4 ºC’de 8 dakika bekletilir.
3. Hücre lizisi ve DNA dekondenzasyonu:
3.1. 4 ºC’deki slayt soğuk lizis solüsyonu (2.5 M NaCl, 100 mM Na2 EDTA, 10 mM Tris, %1 sodium lauryl sarcosine, %1 Triton X-100, pH: 10) içine daldırılırak bir saat bekletilir.
3.2. Slayt, RNase uygulaması için 37 ºC’de 4 saatliğine 10 µg/ml RNase ihtiva eden bir solüsyona ( 2.5 M NaCl, 5 mM Tris, %0.05 sodium lauryl sarcosine, pH 7.4) nakledilir.
3.3. Slayt 200 µg/ml proteinase K içeren pH: 7.4’teki 2.5 M NaCl, 5 mM Tris, %0.05 sodium lauryl sarcosine solüsyonu içinde 15 saat süreyle protein kinaza tabi tutulur.
4.Elektroforez: Slaytlar 300 mM sodium acetate ve 100 mM Tris, pH: 10 içinde 4 ºC’de elektroforez tankında ekuilibre edildikten sonra 4 ºC’de 12 V (0.46V/cm) ve 100 mA elektroforezde bir saat yürütülür.
5. Nötralizasyon: Slaytlar 0.4 M Tris-HCl (pH: 7.4) içerisinde en az 5 dakika nötralize edilirler.
6.Boyama: Her bir slayta 45 µl ethidium bromide (15 µg/ml) ilave edilir.
7. Mikroskobik şekil analizi: Burada kullanılan en yaygın parametreler; kuyruklu hücrelerin yüzdesi, kuyruktaki DNA yüzdesi, kuyruk uzunluğu ve kuyruk momentidir. Comet ölçümü için özel bir şekil analizi yazılımı olan Komet sistem (Kinetic Imaging, UK) kullanılarak bu parametreler başarılı ve objektif olarak ölçülür 78.
II. Tunel (Flow cytometric terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated fluorescein dUTP nick-end labeling) ölçüm kiti: Tunel yöntemi asıl olarak apoptozis sırasında meydana gelen DNA parçalanmasını ölçmek için tasarlanmıştır 79. Kısaca yapılan işlemler şöyledir;
1. Sperma örnekleri iki kez PBS ile yıkanır ve sperma süspansiyonu hazırlanır.
2. Sperma süspansiyonu (1-2 × 106 sperma-tozoa/ml) %1’lik paraformaldehitte yeniden süspanse edilir.
3. Bu süspansiyon bir buz kalıbı üzerine konularak 30-60 dakika bekletilir.
4. Süspansiyondan sonra tekrar PBS ile yıkanır ve %70 buz-soğuk etanol karışımında yeniden süspanse edilir. Bu son süspansiyon 300 g’de 5 dak. santrifüj edilerek üstte kalan etanol süpernatantı alınır.
5. Etanolün uzaklaştırılmasından sonra kalan hücre pelletleri PBS’de iki kez yıkanır ve 37 ºC’de 50 µl boyama solüsyonunda [Terminal deoksi-transferaz (TdT) enzimi, TdT reaksiyon tamponu, fluorescein etiketli deoxyuridine triphosphate nükleotidleri (FITC-dUTP) ve distile su] içeren 60 dakika bekletilerek yeniden sulandırılır.
6. Bütün hücreler Rinse buffer solüsyonunda yeniden yıkanır ve 0.5 ml propidium iodide/RNase solüsyonunda yeniden yeniden sulandırılarak karanlık bir odada 30 dakika inkubasyona tabi tutulur (Oda sıcaklığı).
7. Histogram çıkarmak ve TUNEL-pozitif yüzdesini hesaplamak için elde edilen veriler FlowJo v 4.4.4 yazılım programında flow sitometri kullanılarak analiz edilir.
III. Spermatozoon kromotin yapısının ölçülmesi: Bu yöntem ile tek sarmallı DNA’ların (tek sarmallı DNA’lar ≥ 630 nm’de kırmızı floresan renk verir) çift sarmallı (çift sarmallı DNA’lar 515-530 nm’de yeşil floresan renk verir) olanlara oranı ölçülür. Tek sarmallı DNA / çift sarmallı DNA oranında artış daha fazla denatürasyon ve kromatin yapısında daha fazla kırılganlık olduğunu gösterir 80.
Bu işlem kısaca şu şekilde yapılmaktadır;
200 mikrolitre’lik sperma (1-2 milyon/ml) 0.40 ml %0.1 Triton X-100, 0.15 M NaCl ve 0.08 N HCl, (pH: 1.4) ile karıştırılır. 30 sn sonra sperm süspansiyonundaki pH yükseltilir ve hücreler 6 µg/ml acridine orange, 370 ml 0.1 M citric acid, 630 ml 0.2 M Na2HPO4, 1 mM disodium EDTA ve 0.15 M NaCl, (pH: 6.0) içeren 1.2 ml acridine turuncu buffer ilave edilerek boyanır. Hücreler 488 nm lazer uyarımı ile flow sitometri kullanılarak analiz edilir.
IV. 8-hidroksi 2-deoksiguanozin’in ölçümü: 8-hidroksi 2-deoksiguanozin (8-OHdG) en yaygın oksidatif DNA hasarı biyoişaretleyicisidir. Genomik DNA’da 8-OHdG tayini için kullanılan en yaygın metod elektrokimyasal belirlemeli yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC-EC)’dir. Spermada 8 OHdG’nin ölçümü kısaca şu şekilde yapılmaktadır 78;
a) DNA ekstraksiyonu
Sperma örneği ilk önce sperm yıkama solüsyonu (SWB 10mM Tris-HCl, 10mM ethylenediaminetetra-acetate[EDTA], 1M NaCl, pH 7.4) ile yıkanır. Daha sonra dithiothreitol (DTT), proteinaz K ve SDS ile inkube edilir. Akabinde spermatozoa DNA’sı kloroform/izoamil alkol ile ekstrakte edilir ve ribonükleaz A ile sindirilir. Daha sonra DNA 10 mM Tris-HCl içinde bir sonraki enzimatik DNA sindirimi için çözdürülür. DNA ürünü spermatozoa sayısına bağlı olarak 40 ile 300 µg arasında (1 milyon hücrede ortalama 1.63 µg olmak üzere) değişim gösterir 78.
b) Enzimatik DNA sindirimi
Bu aşama 8-OHdG için kritik bir basamaktır. Bazı araştırıcılar 43,81 nükleaz P1 ve alkalin fosfataz gibi enzimlerle kombine olarak kullanmalarına rağmen Shen ve Ong 78 DNA sindiriminin bakteriyel kaynaklı alkalin fosfataz (AP) kullanıldığında daha iyi sonuç verdiğini ve diğer kaynaklardan elde edilen AP ile daha az sindirim sağlandığını bildirmektedirler. Her bir örnekte %90’ın üzerinde olan DNA sindirimi dönüşüm faktörü ile deoksiguanozin (dG) yoğunluğu hesaplanabilir. (1µg DNA= 0.62nmol dG)
c) HPLC-EC analizi
Bu analiz sistemi bir Gilson pompası, bir Whatman partisphere 5 C 18 kolon, bir elektrokimyasal dedektör (Ag/AgCl elektrot, camsı karbon elektrot, 0,7 V, 50 nA), ultraviole dedektör (254 nm) bir otoörnekleyici ve bir toplayıcıdan meydana gelmektedir. 8-OHdG ve dG düzeylerinin belirlenmesi için sırasıyla 13 ve 9 dakikalık bir zaman gereklidir. Sonuçlar 8-OHdG/105 olarak verilir. Spermatozoon DNA’sındaki hasarın tespiti için spermada 8-OHdG’nin düzeyinin belirlenmesi duyarlı ve nitelikli bir yöntem olarak gözükmesine rağmen bu yöntemle ilgili problemler şöyle sıralanabilir;
a) DNA ekstraksiyonu ve sindirimini kapsayan analitik işlemler suni DNA oksidasyonu ile ortaya çıkabilir.
b) Standart işlemlerin eksikliği farklı laboratuarlar arasında önemli varyasyonlara sebep olabilir.
c) Nispeten büyük miktarda (50 µg) DNA gerektirmesi klinik örneklerde yaygın olarak kullanımını engeller.
Yukarıda belirtilen durumlar dikkate alındığında spermada 8-OHdG düzeyinin güvenilir bir şekilde tespit edilebilmesi için şu önlemleri almak gereklidir 78.
1- DTT ve proteinaz K ile inkubasyon sperm DNA’sını dekondense ve ekstrakte etmek için esastır.
2- İnsan eliyle yapılan hataları en aza indirgemek için DNA ekstraksiyonunda fenol kullanımından sakınılmalıdır.
3- Sistemin belirleme sınırına bağlı olarak 30 µg’ dan daha az DNA ekstraktları kabul edilmemelidir.
4- Bütün çalışma boyunca 8-OHdG standartlarında aynı kimyasalları ve ajanları kullanmak gerekir.
5- Her grubun analizinde kaliteli kontrol için az miktarda karıştırılmış örnek kullanılmalıdır.
6- Sindirimden sonra mümkün olduğu kadar (genellikle birkaç gün içinde) çabuk analiz edilmelidir.
Spermatozoon DNA’sında Oluşan Hasara Karşı Alınabilecek Önlemler
Pek çok faktör hücrenin genetik materyalinde hasara sebep olmaktadır. Bu hasarların onarılması için gerekli mekanizma henüz tam olarak bilinmemektedir. Bununla birlikte spermatozoon genomundaki hasarın, fertilizasyondan sonra oosit içinde tamir mekanizması tarafından düzeltildiği bazı araştırıcılar tarafından iddia edilmektedir 82,83.
Spermatozoon DNA’sında hasara yol açabilen etkenlerin bir kısmı yapılan çalışmalarda belirtilmektedir. Yardımcı üreme teknolojileri için başvurulacak işlemlerde yapılan hataların en aza indirgenmesi ve yeni stratejilerin belirlenmesi yanında aşağıda belirtilen in vivo ve in vitro tedbirlerin alınması ile spermatozoon DNA’sında oluşabilecek muhtemel hasarların en aza indirgenmesi sağlanabilir.
1. İn vivo önlemler
a) Özellikle insanlar için geçerli olan sigara ile ilgili olumsuz yan etkilerin giderilmesi için halkın bilgilendirilmesi gerekir. Bununla ilgili çalışmalarda askorbik asitin insan spermatozoasında oksidatif DNA hasarına karşı koruyucu bir etkiye sahip olduğu belirtilmiştir 36,43.
b) İnsan ve hayvanlarda görülen varikosel için cerrahi tedavi önerilebilir veya özellikle hayvan yetiştiriciliğinde kalıtsal olduğu düşünülen vakalarda bu hayvanlar damızlık yetiştiriciliğinde kullanılmamalıdır.
c) Yaşla ilgili olarak yine yetiştiricilikte kullanılan damızlıklar zamanı geldiğinde genç nesillerle yer değiştirilmelidir.
d) Acrylonitrile (ACN), tamoxifen, cyclo-phosphamide (CP), styrene, acrylamide, demir intoksikasyonu ve cisplatin gibi genotoksik maddelerin kullanımının engellenmesi veya sınırlandırılması önerilebilir.
e) Özellikle kanser hastası olan insanlarda kematerapotiklerin yan etkilerini azaltacak sağaltım çalışmalarına önem verilmelidir.
f) İnsan veya kaliteli damızlıklarda kemoterapiye başlamadan önce spermanın gerekirse daha sonra kullanmak için alınıp dondurulması tavsiye edilebilir.
g) Seminal plazma içerisinde antioksidan madde düzeyi azaldığında oksidatif strese bağlı olarak DNA hasarı artmaktadır. Dolayısıyla antioksidan maddelerin alınması bu hasarın oluşumunu azaltabilir 43.
h) Yine fertilizasyondan sonra ovum içerisindeki tamir mekanizmaları sayesinde DNA hasarları nispeten tamir edilebilmektedir. Özellikle dişilerde ovumdaki tamir mekanizmasını bozabilecek maddelerin kullanılmasının sınırlandırılması faydalı olabilir.
2. İn vitro önlemler
a) Spermayı kısa veya uzun süreli saklama sırasında yapılan işlemlerdeki hataları en aza indirgemek için hayvan türüne uygun olan yöntemler geliştirilmelidir. Örneğin aygırlarda spermayı dondurmadan önce seminal plazmanın ayrılması faydalı bulunmuştur 84.
b) Kısa süreli saklama esnasında sperma içerisine antioksidan madde katılması muhtemel oksidatif stresi en aza indirgemesine bağlı olarak DNA hasarının azaltılmasına yardımcı olacaktır 64.
c) Spermayı saklama sırasında kullanılan sulandırıcılar hayvan türünün spermasına zarar vermeyecek veya oluşabilen zararı en aza indirgeyecek nitelikte olmalıdır.
d) Sperma sulandırma oranı da hasarda etkili olduğu 4 için türe uygun şekilde sulandırma yapılmalıdır.
e) Spermayı dondurma işlemi esnasında sperması dondurulacak hayvanın türüne bağlı olarak uygun miktarda kryoprotektan madde konulmalıdır 74,76.
f) Yine uzun süreli saklamada da antioksidan maddelerin katılması, dondurma ve çözdürme sırasında oluşabilecek muhtemel DNA hasarlarını en aza indirgemede faydalı olabilir 43.