Fluorometil-2,2-difloro-1-(triflorometil)vinil eter (FDVE) sevofluranın en önemli yıkım ürünüdür ve karbon dioksit absorbanlı anestezi makinelerinde baz katalizli dehidroflorinasyon tarafından oluşur ⁷. Ratlara FDVE inhalasyon ile veya intraperitoneal olarak enjekte edildiğinde nefrotoksiktir ⁸.

Birçok klorlanmış ve florlanmış alkenler nefrotoksiktir ve nefrotoksisiteleri hepatik glutatyon S- konjugat oluşumu, glutatyon S- konjugatların sistein S-konjugatlara enzimatik hidrolizi, sistein S-konjugatların renal uptake'i ve hücresel proteinler ile reaksiyonu sonucu hücre hasarı ve ölümüne yol açan renal sistein S-konjugat beta liyaz tarafından reaktif parçacıklara biyoaktivasyonu gibi çok basamaklı yolaklardan kaynaklanır ⁹.

Sevofluran, halotan ile kıyaslandığında hepatotoksisitesi daha az olmakla birlikte (halotan için % 20, sevofluran için % 2-5), son zamanlarda yapılan çalışmalarda sevofluran anestezisinden sonra dejenerasyon ve nekrozla belirgin karaciğer hasarı tespit edilmiştir ^12-14.

Sevofluran anestezisi için her ne kadar spesifik radikal molekül tespit edilmemişse de antioksidan vitaminlerin veya antioksidan enzimlerin düzeylerinin değişmesi gibi indirekt etkiler sevofluranın hepatotoksik etkileri ile ilişkili olabilir ¹⁵. Hipoksi veya azalmış hepatik kan akımı nedeniyle antioksidan vitamin düzeylerindeki azalma serbest radikal üretiminin muhtemel sebepleri olabilir.

Sevofluran kalbi protein kinaz C aktivasyonu, mitokondrial K+ATPaz kanallarının açılması ve reaktif oksijen parçacıklarının oluşumu yolu ile iskemi indüklü ATP deplesyonu, Ca+2 akımı ve oksidadif strese karşı kalbi korur ¹⁰. Fakat sevofluranın, kardiyak dokuda direk T ROS oluşumuna yol açtığı düşünülmektedir ¹¹.

Anestezik maddeler karaciğerde kan akımını zayıflatarak hayvanlarda antioksidan durumdaki dengenin bozulmasına ve oksidatif strese neden olurlar ^15-17. Hayvanlarda özellikle plazmada E ve C vitaminleri GSH-Px aktivitesi gibi antioksidan vitamin ve antioksidan enzimlerin düşük miktarlarda olduğu ve oksidatif hasarın arttığı gözlenmiştir ^17-19. Artan oksidatif stress kanser, kalp damar hastalıkları, iskemi/reperfuzyon hasarı, nörodejeneratif bozukluklar, romatoid artrit ve nefrotoksisite gibi kronik hastalıkların yüksek oluşma riski ile ilişkilidir. ^20-26.

E vitamini ve selenyum gibi antioksidan katkılarla zenginleştirilmiş diyetlerin anestezik ajanların olumsuz etkilerine karşı kulanılabileceğini ve sonuçta oksidatif stresi azaltabileceğini göstermektedir ¹⁷. ROS'lar reaktif oksidan moleküller olup vücutta endojen olarak normal metabolik aktiviteler sonucunda meydana gelirler. ROS'lar hücrede bazı önemli biyomoleküllerle (lipit, protein, DNA) tepkimeye girerek oksidatif hasar meydana getirirler ²⁷. Antioksidanlar ROS'u inaktif edebilme özelliğine sahiptir ve böylece oksidatif hasara karşı koruma sağlarlar ^28,29. Karotenoit ailesinin bir üyesi olan likopen güçlü antioksidan özelliklere sahip olup reaktif oksijen türlerinin neden olduğu hücresel hasara karşı koruma sağlar ^27,30-32. Bol miktarda likopen içeren domates ve domates ürünlerinin tüketimi sonucunda kan likopen seviyesi artar ve bu durum yağlar, proteinler ve DNA'nın oksidatif hasarının azalmasıyla ilişkilendirilebilir ^33,34. Diyete likopen ilavesi prostat kanser riskinin azalması ^35,36 ve meme tümörü insidansının düşmesi ³⁷ ile ilişkili olabilir. Sevofluran uygulanan ratlarda likopenin antioksidan kapasitesini ortaya koyan bir çalışma mevcut değildir. Bu çalışmanın amacı, sevofluran anestezisi altındaki ratlarda diyete likopen katkısının dokulardaki histopatolojik değişimleri nasıl etkilediğini araştırmaktır.

Nekropsi uygulamasını takiben karaciğer, böbrek ve kalp dokuları % 10'luk formaldehit solüsyonunda tespit edildi. Klasik işlemlerden geçirilen dokuların parafin blokları hazırlandı. Bloklardan 5 μm kalınlığında kesitler alınarak, hematoksilin–eozin ile boyandıktan sonra ışık mikroskobunda incelendi ³⁸.

Hepatik hasarın belirlenmesinde histopatolojik skorlama yöntemi kullanıldı. Bu skorlamadaki grade'ler 0,1,2,3,4,5 ve 6 şeklindedir. Grade 0: Hepatositlerde hasar yok, 1: Minimal sellüler değişiklikler, 2: Yalnızca hafif derecede sentrilobüler hasar, 3: Yalnızca ciddi sentrilobüler hasar, 4: Hafif sentrlobüler ve midzonal hasar, 5: Ciddi sentrilobüler ve midzonal hasar ve 6: Hepatositlerde tam bir bozulma şeklinde skorlandı ³⁹.

Hepatik hasarın skorlanması ile elde edilen veriler varyans analizi ile değerlendirildi. Farklılık çıkması halinde Duncan testi uygulanarak hangi gruplar arasında farklılığın olduğu tespit edildi. İstatistiksel analizler SPSS 12.0 paket programıyla yapıldı.

II-Makroskobik Bulgular
Makroskobik olarak iç organlarda kayda değer herhangi bir lezyon gözlenmedi.

Histopatolojik Bulgular
Karaciğer
Sevofluran grubundaki ratların karaciğerlerinde şiddetli hidropik dejenerasyon, sinuzoidal konjesyon ve dilatasyon ile birlikte hafif şiddette sentrilobüler nekroz ve ödem mevcuttu. Dejeneratif hepatositlerin sitoplazma-larında büyük vakuollerle birlikte parçalanmamış tek tük serpiştirilmiş tarzda piknotik çekirdeklerin bulunduğu izlendi (Şekil-1). Ayrıca bu hepatositlerin yer yer apoptotik değişimleri de içerdiği saptandı. Bunlara ek olarak periportal ve dejenerasyonun şiddetli olduğu alanlarda hafif derecede mononüklear hücre infiltrasyonları dikkati çekti.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: Sevofluran ile aneztezi sonrası karaciğerde şiddetli hidropik dejenerasyon (H&E, × 100).

Likopen grubundaki ratlarda hafif şiddetteki nekrotik değişimlerin hücre şişmesi ile sınırlı olduğu, sinuzoidal konjesyon, sentrilobuler ödem ve apoptototik değişimlerin ise kısmen azaldığı dikkati çekti (Şekil-2). Hepatoselüler dejenerasyon şiddeti bakımından Sevofluran grubu ile karşılaştırıldığında bu grupta hidropik dejenerasyonun daha baskın bir görünümde olduğu saptandı.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 2: Likopen uygulamasını takiben aneztezi uygulanan grupta karaciğerde hafif şiddette sinuzoidal dilatasyon (H&E, × 100).

İstatistiksel Bulgular
Karaciğer hasarının belirlenmesinde kullanılan skorlama yöntemine göre kontrol (0), likopen-sevofluran ^1, ve sevofluran (3.25) olarak bulundu. Kontrol ve likopen-sevofluran grupları arasında istatistiksel farklılık önemsiz (P>0.05) iken, likopen- sevofluran ve kontrol grubu sevofluran grubu ile karşılaştırıldığında ise istatistiksel farklılığın oldukça belirgin (P<0.001) olduğu görüldü.

Böbrek
Sevofluran uygulanan ratların böbreklerinde özellikle hafif şiddette kortikal nekroz ve şiddetli dejenerasyonla karakterize değişimlerin oluştuğu saptandı. Böbreğin proksimal tubulus epitellerinde dejenerasyon ve deskuamasyonla birlikte intertubuler hemoraji baskın görünümdeki değişimler olarak kaydedildi. Dejenerasyonun yanı sıra bazı tubülus hücrelerinin çekirdeklerinde piknotik değişimler mevcuttu. Bu değişimlere ek olarak bazı tubullerin lümeni içerisinde eozinofilik görünümlü hiyalin silindir formasyonları da vardı (Şekil-3). Yer yer bazı glomerulusların kapillar konjesyonuna bağlı olarak genişlediği dikkati çekti. Böbreğin medullar bölgesinde ise damarlarda şiddetli konjesyon ile birlikte intertubuler hemoraji odakları dikkate değer değişimlerdi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 3: Sevofluran ile aneztezi sonrası böbreğin proksimal tubülus epitellerinde dejeneratif ve nekrotik değişimler (H&E, × 100).

Likopen verilip sonrasında sevofluran uygulanan ratlarda dejeneratif değişimlerin Sevofluran grubuna göre daha hafif şiddette ve sitoplazma ile sınırlı bir görünümde olduğu tespit edildi. Glomerular konjesyon ve intertubuler hemoraji bu grupta da benzer bir görünümde olup, tubuler lümen içerisinde hiyalin silindir formasyonlarına rastlanmadı (Şekil-4).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 4: Likopen uygulanan grupta böbreğin dejeneratif görünümü (H&E, × 100).

Mikroskobik olarak, diğer organlarda herhangi bir değişikliğe rastlanmadı.

Karaciğer hasarının belirlenmesinde kullanılan skorlama yöntemine göre kontrol, likopen+sevofloran ve sevofloran gruplarındaki skor değer ortalamaları sırasıyla; 0, 1.00±0.53 ve 3.25±1.66 olarak bulundu. Gruplar arasında yapılan değerlendirmelerde kontrol ve likopen arasındaki farklılık istatistiksel olarak önemsizken (p≥0.061), sevofloran grubuyla likopen+sevofloran grupları arasındaki farklılık ise önemli bulundu ((p≤0.001).

Anestezik ajanlara maruz kalan hayvanlarda karaciğer enzimlerinin ve antioksidan enzimlerin azaldığı bilinmektedir. ^17,40-44. Çeşitli uygulamalarda karaciğer hasarından korunmak için özellikle antioksidanların verilmesi yöntemi kullanılmıştır. ^17,45-48. Bazı çalışmalar laboratuar hayvanlarında halojenli anesteziklerin bazı karaciğer enzimlerinin plazma aktivitelerini artırdığını bildirmişlerdir. ^40,49-53. Bu çalışmada likopen katkısının sevofluran uygulanmış hayvanlarda olumlu etkileri bulunmuştur. Bu çalışma, sevoflurana maruz bırakılmış ratlarda ölçülen bu parametreler üzerine likopenin etkisinin değerlendirildiği ilk çalışmadır. Sunulan bulgulara benzer olarak, halojenli anasteziklerin dokularda dejenerasyona sebep olduğu ve kan plazmasında AST, ALT ve ALP'nin aktivitelerini kısmen arttırdığı bildirilmiştir ^17,49. Likopen bitkiler ve mikroorganizmalar tarafından sentez edilebilirken hayvanlar tarafından sentez edilemez ²⁷. Bu nedenle stres altındaki hayvanların likopen gereksinimi diyete katkı yoluyla giderilmelidir. Likopen doğal karotenoidler arasında en güçlü tekli oksijen radikali yok edicisidir. ^27,31,54,55. Tekli oksijenlerin yanı sıra likopen, H2O2 ve NO2 yi de yok eder ⁵⁶. Agarwal ve Rao ³³ diyete likopen katkısı ile kan likopen seviyesinin artığını göstermiştir. Buna ek olarak Obara ve ark ⁵⁷ yeni doğanlarda anestezi ve cerrahi müdahale sırasında serum vitamin E seviyesinin azaldığı ve serum MDA seviyesinin artığını bildirmişlerdir. Çalışmanın bulgularına benzer olarak Jain ve ark. ⁵⁸ ratlarda likopen katkısının serum ve karaciğer likopen ve tiyollerin miktarını artırdığı ve serum thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS) konsantrasyonunu % 14 oranında azaltığını bildirmişlerdir. Bu, Rao ve Agarwal ⁵⁹ in likopen katkısının yağ protein ve DNA'yı oksidasyona karşı koruduğunu gösterdikleri bulguları desteklemektedir. Sonuçlarımıza paralel olarak Muzandu ve ark ⁶⁰ likopenin bu koruyucu etkilerinin ROS ve RNS'lerin yok edilmesine bağlı olabileceğini bildirmişlerdir.

Sevofluran'ın karaciğer ve böbreklerde değişikliğe neden olduğu bu çalışmada mikroskobik olarak karaciğerde sinüzoidal konjesyon, sentrilobuler dejenerasyon ve nekroz; böbrekte tubulus epitellerinde dejenerasyon, nekroz ve deskuamasyon gözlendi. Bu değişikliklerin derecesi Sevofluran grubunda şiddetli, likopen grubunda ise daha hafifti. Sonuç olarak ratlara anestezi öncesi likopen verilmesinin doku ve organlarda sevofluran'ın zararlı etkilerini önemli derecede önleyebildiği kanaatini uyandırmaktadır.

1) Eger EI, II. New inhaled anesthetics. Anesthesiology 1994;80:906–22.

2) Tiainen P, Lindgren L, Rosenberg PH. Changes in hepatocellular integrity during and after desflurane or isoflurane anaesthesia in patients undergoing breast surgery. Br J Anaesth 1998;80:87–9.

3) Kenna JG, Jones RM. The organ toxicity of inhaled anesthetics. Anesth Analg 1995;81:S51– 66.

4) Frink EJ. The hepatic effects of sevoflurane. Anesth Analg 1995;81:S46 –50

5) Kharasch ED, Thummel KE. Identification of cytochrome P450 2E1 as the predominant enzyme catalyzing human liver microsomal defluorination of sevoflurane, isoflurane, and methoxyflurane. Anesthesiology 1993; 79:795–807.

6) Newman PJ, Quinn AC, Hall GM, Grounds RM. Circulating fluoride changes and hepatorenal function following sevoflurane anaesthesia. Anaesthesia 1994; 49:936–939.

7) Frink EJ Jr, Malan TP, Morgan SE et al. Quantification of the degradation products of sevoflurane in two CO2 absorbants during low-flow anesthesia in surgical patients. Anesthesiology 1992;77:1064–1069.

8) Morio, M, Fujii K, Satoh N et al. Reaction of sevoflurane and its degradation products with soda lime: Toxicity of the byproducts. Anesthesiology 1992;77:1155–1164.

9) Dekant, W, Lash LH, Anders MW. Bioactivation mechanism of the cytotoxic and nephrotoxic S-conjugate S-(2-chloro-1,1,2-trifluoroethyl)-L-cysteine. Proc. Natl. Acad. Sci. 1987;84:7443–7447.

10) de Ruijter W, Musters RJ, Boer C et al. The cardioprotective effect of sevoflurane depends on protein kinase C activation, opening of mitochondrial K(+)(ATP) channels, and the production of reactive oxygen species. Anesth. Analg 2003;97:1370–1376.

11) Yoshida K, Okabe E. Selective impairment of endothelium-dependent relaxation by sevoflurane: oxygen free radicals participation. Anesthesiology 1992;76: 440–447.

12) Nishiyama T, Yokoyama T, Hanaoka K. Liver function after sevoflurane or isoflurane anaesthesia in neurosurgical patients. Can. J. Anaesth. 1998;45:753–756.

13) Nishiyama T, Yokoyama T, Hanaoka K. Liver and renal function after repeated sevoflurane or isoflurane anaesthesia. Can. J. Anaesth. 1998;45:789–793.

14) Shichinohe Y, Masuda Y, Takahashi H et al. A case of postoperative hepatic injury after sevoflurane anesthesia. Masui 1992;41:1802-1805

15) Morris DM, Smith HO, Liu W et al. Are antioxidant levels measured immediately postoperatively an indicator of magnitude of injury. Am J Surg 2000;180:212–216,

16) Schmidt CC, Suttner SW, Piper SN, Nagel D, Boldt J. Comparison of the effects of desflurane and isoflurane anaesthesia on hepatocellular function assesed by alpha glutathione S-tarnsferase. Anaesthesia 1999;54:1204–1219.

17) Karakilcik AZ, Hayat A, Zerin M, Cay M. Effects of intraperitoneally injected selenium and vitamin E in rats anesthetized with halothane. J. Trace Elem. Med. Biol. 2003;17:33-38.

18) Dikmen B, Unal Y, Pampal HK et al. Effects of repeated desflurane and sevoflurane anesthesia on enzymatic free radical scavanger system. Molecular and Cellular Biochemistry 2007;294:31-36.

19) Durak I, Kurtipek O, Ozturk HS et al. Impaired antioxidant defence in guinea pig heart tissues treated with halothane. Can J Anaesth 1997;44:1014-1020.

20) Kovacic P, Thurn LA. Cardiovascular toxicity from the perspective of oxidative stress, electron transfer, and prevention by antioxidants. Curr. Vasc. Pharmacol. 2005;3:107-117.

21) van Oostrom AJ, van Wijk J, Cabezas MC. Lipaemia, inflammation and atherosclerosis: novel opportunities in the understanding and treatment of atherosclerosis. Drugs 2004;64:19-41.

22) Szocs K. Endothelial dysfunction and reactive oxygen species production in ischemia/reperfusion and nitrate tolerance. Gen. Physiol. Biophys. 2004;23:265-295.

23) Rego AC, Oliveira CR. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem. Res. 2003;28:1563-1574.

24) Hadjigogos K. The role of free radicals in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Panminerva Med. 2003;45:7-13.

25) Cousins MJ, Mazze RI. Methoxyflurane toxicity: a study of dose response in man. JAMA, 1973;225:1611-1616.

26) Crandell WB, Pappas SG, MacDonald A. Nephrotoxicity associated with methoxyflurane anesthesia. Anesthesiology 1966;27:591-607.

27) Rao AV, Agarwal S. Role of lycopene as antioxidant carotenoid in the prevention of chronic diseases: a review. Nutr Res. 1999;19:305-323.

28) Halliwell B, Gutteridge JMC. Lipid peroxidation: A radical chain reaction. In: Free Radicals in Biology and Medicine. 2nd edition, Oxford University Press, New York 1989;188-218.

29) Witztum JL. The oxidation hypothesis of atherosclerosis. Lancet 1994;344:793-795.

30) Mangles AR. Holden JM, Beecher GR, Forman MR, Lanza E. Carotenoid contents of fruits and vegetables: an evaluation of analytical data. J. Am.Diet Assoc. 1993;93:284-296.

31) DiMascio P, Kaiser S, Sies S. Lycopene as the most effective biologica carotenoid singlet oxygen quencher. Archives of Biochemistry and Biophysics 1989;274:532-538.

32) Sahin K, Onderci M, Sahin N et al. Effects of lycopene supplementation on antioxidant status, oxidative stress, performance and carcass characteristics in heat-stressed Japanese quail. Journal of Thermal Biology 2006;31:307-312.

33) Agarwal S, Rao AV. Tomato lycopene and low-density lipo-protein oxidation: A human dietary intervention study. Lipids 1998;33:981-984.

34) Rao AV, Shen H. Effect of low dose lycopene intake or lycopene bioavailability and oxidative stres. Nutr. Res. 2002;22:1125-1131.

35) Kucuk O. Chemoprevention of prostate cancer. Cancer Metast Rev. 2002;21:111-124.

36) Kucuk O, Sarkar F, Sakr W et al. Phase II randomized clinical trial of lycopene supplementation before radical prostatectomy. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2001;10:861-868.

37) Sharoni Y, Giron E, Rise M, Levy J. Effects of lycopene-enriched tomato olerosin on 7, 12-dimethyl-benz [a] antracene-induced rat mammary tumors. Cancer Detect. Prev. 1997;21:118-123.

38) Bancroft JD, Stevens A. Theory and practise of histological techniques. Third Edition. Churchill, Livingstone, Edinburg, London, Melbourne and New York. 1990;112-147.

39) Tsimoyiannis EC, Moutesidou KJ, Moschos CM et al. Trimetazidine for prevention of hepatic injury induced by ischemia and reperfusion in rats. Eur J Surg. 1993;159:89-93.

40) Lind RC, Gandolfi AJ, Hall PM. The role of oxidative biotransformation of halothane in the guiena pig model of halothane-associated hepatotoxicity. Anesthesiology 1989;70:649-653.

41) Hassal E, Israel DM, Gunesakaran TM. Halothane hepatitis in children. J. Pedr. Gastroen. Nutr. 1990;11:553-557.

42) Ray DC, Drummond GB. Halothane hepatitis. Br. J. Anaesth. 1991;67:84-99.

43) Comporti M. Biology of diseases: Lipid peroxidation and cellular damage in toxic liver injury. Lab. Invest. 1985;53:599-623.

44) Knights KM, Gourlay GK, Hall PM, Adams JF, Cousins MJ. Halothane hepatitis in an animal model: Time course of hepatic damage. Br J Exp Path 1987;68:613-624.

45) Södergen E, Cederberg J, Vessby B, Basu S. Vitamin E reduces lipid peroxidation in experimental hepatotoxicity in rats. Eur. J. Nutr. 2001;40:10-16

46) Parola M, Leonarduzzi G, Biasi F et al. Vitamin E dietary supplementation protects against carbon tetrachloride-induced chronic liver damage and cirrhosis. Hepatology 1992;16:1014-1021

47) Brucato M, Sundlof SF, Bell JU, Edds GT. Aflatoxin B1 toxicosis in dairy calves pretreated with selenium vitamin E. Am. J. Vet. Res. 1986;47:179-183

48) Harvey RB, Kubena LF, Elissalde M. Influence of vitamin E on aflatoxicosis in growing swine. Am. J. Vet Res. 1994;55:572-577.

49) Durak I, Güven T, Birey M et al. Halothane hepatotoxicity and hepatic free radical metabolism in guiena pigs: the effects of vitamin E. Can. J. Anaesth. 1996;43:741-748

50) Younes M, Heger B, Wilhelm KP, Sieges CP. Enhanced in vivo lipid peroxidation associated with halothane hepatotoxicity in rats. Pharmacol. Toxicol. 1988;63: 52-56.

51) Johnson ME, Sill JC, Uhl CB, Van Dyke RA. Effect of halothane on hypoxic toxicity and glutathione status in cultured rat hepatocytes. Anesthesiolgy 1993;79:1061-1071.

52) Fee JPH, Black GW, Dundee JW et al. A prospective study liver enzyme and other changes following repeat administration of halothane and enflurane. Br. J. Anaesth. 1979;51:1133-1141.

53) Steffey EP, Zinkl J, Howland D Jr. Minimal changes in blood cell counts and biochemical values associated with prolonged isofluoran anaesthesia of horses. Am. J. Vet. Res. 1979;40:1646-1648.

54) Nguyen ML, Schwartz SJ. Lycopene: chemical and biological properties. Food Tech. 1999;53:38-45.

55) Agarwal S, Rao AV. Carotenoids and chronic diseases. Drug Metabolism and Drug Interactions. 2000;17:189-210.

56) Bohm F, Trinkler JH, Truscott TG. Carotenoids protect against cell membrane damage by nitrogen dioxide radical. Nature Med. 1995;1:98-99.

57) Obara H, Maekawa, N, Hoshina H. et al. Plasma levels of vitamin E and lipoperoxide during pediatric anaesthesia. Can. Anaesth.Soc. J 1985;32:358-363.

58) Jain CK, Agarwal S, Rao AV. The effect of dietary lycopene on bioavailability, tissue distribution, in-vivo antioxidant properties and colonic preneoplasia in rats. Nutr Res. 1999;19:1383-1391.

59) Rao AV, Agarwal S. Bioavailability and in vivo antioxidant properties of lycopene from tomato products and their possible role in the prevention of cancer. Nutr Cancer. 1998;31:199-203.

60) Muzandu K, Ishizuka M, Sakamoto KQ et al. Effect of lycopene and beta-carotene on peroxynitrite-mediated cellular modifications. Toxicol Appl Pharmacol. 2006;215:330-340.