Ratlar her grupta 12 hayvan olacak şekilde 4 gruba bölünerek, birinci grup kontrol olarak ayrıldı. Grup 2, 3 ve 4'teki ratlara sırasıyla N-Nitrozodietilamin (N-NDEA), 1-Nitrozopiperidin (1-NPip) ve N-Nitrozopirolidin (N-NPir) 30 gün süreyle 200 ppb miktarında içme suyuna katılarak verildi. Uygulamaları takiben alınan kan ile karaciğer ve böbrek doku örneklerinde Beutler yöntemine göre pirüvat kinaz aktivitesi ölçüldü. Uzun süreli N-NDEA, 1-NPip ve N-NPir uygulamaları kan pirüvat kinaz aktivitesinde kontrol grubuna göre değişiklik oluşturmadı. Karaciğer ve böbrek dokularında N-NDEA verilmesi enzim aktivitesini önemli derecede değiştirmezken; 1-NPip ve N-NPir uygulamaları sonucunda kontrol grubuna göre karaciğer ve böbrek doku pirüvat kinaz aktivitelerinin azaldığı saptandı (p<0,05) .

Sonuç olarak, ratlarda uzun süreli nitrozamin uygulamalarının ve özellikle 1-NPip ve N-NPir'in öncelikle karaciğer ve böbrek pirüvat kinaz aktivitesini azalttığı ve buna bağlı olarak karbonhidrat metabolizmasında bozulma olabileceği, glikozun farklı metabolik yollara yönelebileceği ortaya konuldu. Bu nedenle, başta su olmak üzere çeşitli yollarla nitrozaminlere maruz kalınmasının sağlık problemlerine yol açabileceğinden dolayı gereken önleyici tedbirlerin alınmasının gerekli olduğu kanaatine varıldı.

Nitrozaminlerin protein ve nükleik asitlere bağlanarak kanserojenik etki gösterdikleri bilinmektedir. Mide, özafagus, nazofarenks, mesane ve karaciğer kanserleriyle, nitrat-nitrit ile nitrozaminlerin eksojen alımı ve endojen nitrozamin oluşumu arasında kuvvetli bir ilişki bulunmuştur. Nitrozaminler ve özellikle N-Nitrozodietilamin (N-NDEA) çevresel ortamlarda yaygın olarak bulunabilmekte ve güneş ışığı altında kolayca yıkımlanmaktadır. Fakat çevre ortamında bulunan N-nitrozo bileşikleri ile nitrat ve nitrit gibi bunların ön maddeleri vücuda alındıktan sonra kanser oluşumları için potansiyel risk faktörlerini oluşturmaktadır. Araştırıcılar gıdalar ile içme suyu içindeki nitrat ve nitritin de nitrozaminlerin oluşumuna yol açarak kanser oluşturabileceğini bildirmektedirler^3,6,7.

Nitrozaminlerin metabolizması öncelikle karaciğerde gerçekleşir. Ancak, başta N-NDEA olmak üzere nitrozaminler toksik etkilerini öncelikle kanda, ama özellikle karaciğerde oluştururlar. Ayrıca kan akımının fazla olduğu böbrekler gibi diğer organlar da bu durumdan karaciğere göre daha düşük düzeyde etkilenirler. Çeşitli araştırmalarda deney hayvanlarına farklı nitrozaminler verildiğinde başta karaciğer olmak üzere diğer organ ve doku tümörlerine neden olduğu gösterilmiştir^8,9.

Piruvat kinaz (E.C.2.7.1.40); adenozin difosfatın substrat düzeyinde fosforilasyonunu katalize eden bir enzim olup fosfoenolpirüvatın fosfat grubunu adenozindifosfata transfer etmekte ve sonuçta ATP ve pirüvat elde edilmektedir. Pirüvat kinaz enzimi glikoliz ve özellikle de glikoneogenezin göreceli olarak hızının kontrol edilmesinde görev alır¹⁰. Tümör hücrelerinde karbonhidrat metabolizmasında değişiklikler gözlenmiştir. İyi ve kötü huylu doku proliferasyonlarında piruvat kinaz aktivitesinin genellikle arttığı rapor edilmiştir. Bu da tümör hücrelerinin metabolizmasındaki enerji ve metabolitlerin sağlanması için glikolizin gerekliliğini açıklamaktadır¹¹. Daha önceki biyokimyasal çalışmalarda hepatosellüler tümörlerin gelişimi esnasında L-tip pirüvat kinaz izoenzimin azaldığı, M2-tip pirüvat kinaz izoenzimin ise arttığı gösterilmiştir^12,13. Klimek ve Bannasch¹² N-nitrozomorfin (NNM) ile oluşturulan hepatokarsinojenezisin erken dönemde görülen normal ve asidofilik hücre odaklarında pirüvat kinaz aktivitesinin arttığını, daha sonraki safhalarında hem karışık ve bazofilik hücre odaklarında hem de bazofilik karaciğer tümörlerinde azaldığını bildirmişlerdir.

Nitrozaminlerin çeşitli yollarla alınmalarının insan ve hayvanlarda özellikle karsinojenik potansiyelleri bakımından önemi büyüktür. Bu nedenle, çalışmada düşük miktarda ve uzun süreli olarak bazı nitrozaminlerin içme suyu içinde ratlara verilmesinin pirüvat kinaz aktivitesi üzerine etkilerini araştırmak amaçlanmıştır.

Hayvanlar, her grupta 12 rat olacak şekilde 4 gruba bölündü. Kontrol grubu (Grup 1) ratlara içme suyu verildi. Grup 2, 3 ve 4'teki ratlara ise sırasıyla N-NDEA, 1-NPip, N-NPir (Sigma, St Louis MO, USA) birbirini takip eden 30 gün süreyle uygulandı. Çalışmada kullanılan nitrozaminlerin miktarı daha önceki çalışmalara^6,7 göre belirlenerek, deneme gruplarına nitrozaminlerin içme suyundaki son konsantrasyonu 200 ppb olacak şekilde her gün taze içme suyuna katılarak uygulandı.

Uygulamaların 30. gününde ratlar sakrifiye edilerek kan, karaciğer ve böbrek doku örnekleri alındı. Kan örnekleri antikoagülan (%2 sodyum okzalat) içeren tüplerde toplandı ve plazmalarını ayırmak için +4ºC'de 2.000 g'de 5 dakika santrifüj edildi. Eritrositler serum fizyolojik (% 0,9'luk NaCl) ile 3 kez yıkanarak hemolizat hazırlandı. Hemolizat ile karaciğer ve böbrek doku örnekleri biyokimyasal analizler yapılıncaya kadar -20 ºC'de saklandı. Analizler öncesinde karaciğer ve böbrek dokuları serum fizyolojik ile yıkandıktan sonra Tris-HCl tamponu (50 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 7,6) ile 1:10 oranda sulandırılarak Teflon cam homojenizatörde homojenize edildi. Homojenat soğutmalı santrifüjde (Sorvall RC-5B) 8.000 g'de 30 dakika santrifüj edilerek süpernatant alındı. Pirüvat kinaz aktivitesi fruktozdifosfat varlığında, 340 nm'de NADH'in azalan absorbans hızının ölçülmesi esasına dayanan Beutler ve ark.¹⁴'nın yöntemiyle ölçüldü.

Alınan tüm örneklerde belirlenen veriler; ortalama değerler (X±S.E.M) olarak tabloda verildi. Gruplar arasındaki karşılaştırmalar tek yönlü varyans analizini takiben Duncan testiyle ve SPSS/PC paket programa göre (versiyon 12.0) değerlendirildi.

Karaciğer ve böbrek dokularında uzun süreli N-NDEA verilmesi kontrol grubuna göre enzim aktivitesini önemli derecede değiştirmezken; 1-NPip ve N-NPir verilmesi sonucunda ise hem karaciğer (p<0,05) ve hem de böbrek (p<0,05) dokularında pirüvat kinaz aktivitelerinin kontrol grubuna göre azaldığı belirlendi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: Ratlarda uzun süreli (30 gün) N-NDEA, 1-NPip and N-NPir uygulanmasından sonra kan(U/ml) ile karaciğer ve böbrek (U/g doku) pirüvat kinaz aktivitelerinin değişimi.

Nitrozaminlerin metabolik aktivasyonu ile spontan olarak oluşan N-nitrozoüre hedef dokunun DNA'sı ile etkileşerek bazların değişimine neden olmakta ve karsinojenezisi başlatmaktadır. Çalışılan bütün deney hayvanlarında nitrozaminlerin mutasyonlara neden olduğu, tümör oluşumunu artırdığı, karsinojenik ve mutajenik etkisini çoğunlukla mikrozomal sistem tarafından aktive edildikten sonra gösterdiği bildirilmiştir^13,15,17. Phillipson ve Ioannides¹⁷ insan, fare, sıçan, hamster ile domuzda NDMA, dipropilnitrozamin, metiletilnitrozamin, 1-NPip, ve N-NPir'in mutajenligini incelemişler ve bu bileşiklerin farklı oranlarda mutajen etkisi gösterdiklerini bildirmişlerdir. NDMA'in başlıca metabolize olduğu yer karaciğer mikrozomal sistemdir. Rat, fare ve kemirgen karaciğer mikrozomlarında NDMA'nin demetilasyonla formaldehide ve denitrozasyonla nitrite dönüştüğü, bu nitrozaminin kendisinden çok metabolitlerinin karsinojenik ve mutajenik etkileri olduğu birçok araştırmacı tarafından gösterilmiştir^15,17,18.

Tümör hücrelerinin enzimoloji ile ilişkisi, tümörlü hücrede karbonhidrat, pürin ve pirimidin metabolizmasını düzenleyen enzimlerin aktivitelerinin değişikliğe uğramalarından ileri gelmektedir¹⁹. Atalay²⁰ ve Çetinkaya²¹ tarafından NDEA'in sıçan karaciğer dokusunda laktat dehidrogenaz, fare karaciğerinde malat dehidrogenaz, in vitro koşullarda ise maya glikoz-6-fosfat dehidrogenazı inhibe ettiği gösterilmiştir. Ayrıca fare karaciğerinde Na/K ATPaz aktivitesi üzerine NDEA, N-nitrozonornikotin (NOR) ve N-Pir'in etkileri çalışılmış ve NDEA'in enzimi %77 oranında aktive ettiği, buna karşılık NOR, N-Pir'in ise %30 ve %20 oranında inhibe ettiği saptanmıştır. Diğer yandan; beyin tümörleri, retinoblastomalar, rhabdomyosarcomalar, medullar tiroid kanserleri, karaciğer, meme kanserleri ve hepatomalar gibi neoplastik dokularda M2-tip pirüvat kinaz aktivitesinde değişim olduğu tespit edilmiş ve tümörlü dokuda bulunan M2-tip pirüvat kinaz aktivitesi ile tümör arasında bir ilişki olduğu saptanmıştır^22,23. Tümör M2-tip pirüvat kinaz izoenzimi karbonhidrat metabolizmasının düzenlenmesinde aktif rol oynamaktadır. Tiroid kanseri ve hepatomalarda pirüvat kinazın spesifik aktivitesinin arttığı, sarkomalarda, insan beyin tümörlerinde ise düştüğü bildirilmiştir²⁴.

Pek çok deneysel çalışmada farklı nitrozamin türlerinin özellikle karaciğerde olmak üzere oluşturdukları doku hasarlarında pirüvat kinaz aktivitesinin değiştiği bildirilmektedir^{12,25,26,27,28}. Gerbracht ve ark.²⁵ ise; ratlara 8 hafta süre ile NDEA uyguladıktan sonra karaciğer parankimasının %36'sında GGT-pozitif, %54'ünde GST-pozitif lezyon oluştuğunu bildirmişler ve bu değişikliklerin karaciğer pirüvat kinaz, laktat dehidrogenaz ve gliserol-3-fosfat dehidrogenaz aktivitesindeki azalma ile ilişkili olabileceğini düşünmüşlerdir. Karaciğerde glikoz-6-fosfat dehidrogenaz aktivitesi %113 oranında artmıştır. Bu veriler rat karaciğerinde preneoplastik odakların gelişmesi esnasında pentoz fosfatlar ile indirgeyici ürünler artarken, pirüvat sentezinin azaldığı ve glikozun triaçilgliserollere yönlendiğini desteklemektedir. Yapılan diğer bir çalışmada¹² ratlara ağız yolu ile NNM verilmesi ile rat karaciğerinde hepatokarsinojenezisin oluştuğu ve erken safhasında fokal karaciğer lezyonlarının görüldüğü, karbonhidrat metabolizmasının bozulduğu bildirilmiştir. Preneoplastik ve neoplastik karaciğer lezyonlarında, özellikle glikojen depolayan odaklarda, karışık hücre odaklarında, bazofilik hücre odaklarında, hepatosellüler adenom ve karsinomda glikolizisin anahtar bir enzimi olan pirüvat kinaz enzim aktivitesi ölçülmüş, glikojen depolayan odaklarda artış, karışık hücre odaklarında ise çok az bir düşüş saptanmıştır. Buna karşın düşük glikojen bazofilik odakta ve bazofilik karaciğer tümörlerinde pirüvat kinaz aktivitesinde önemli ölçüde bir azalma gözlenmiştir. Pirüvat kinaz aktivitesindeki azalmanın glikojen depolayan odaktan hepatosellüler karsinoma yol açan hücresel değişiklikler esnasında nispeten geç oluşan bir sonuç olduğunu desteklediği öne sürülmektedir. Diğer yandan, bir başka çalışmada²⁶ ratlara NDEA uygulanması ile oluşan hepatokarsinojeneziste pirüvat kinazın total aktivitesinin arttığı bildirilmiştir. Total pirüvat kinaz aktivitesi karaciğer dokusundaki primer tümöral odakta olduğu gibi hiperplastik semptomların görülmesi ile de artmıştır. Primer hepatomalarda L-tip pirüvat kinaz azalırken M2-tip pirüvat kinaz aktivitesi artmıştır. Çalışmada pirüvat kinaz aktivitesinin tüm deneme gruplarında kontrol grubuna göre kanda değişmezken, böbrek ve özellikle karaciğer dokusunda azaldığı saptanmıştır. Bu bulgular yukarıdaki araştırıcıların bulgularıyla paralellik göstermektedir. Pirüvat kinaz aktivitesi ile karaciğer dokusunda metabolize edilen nitrozaminlerin mutajenik etkileri arasında bir ilişki olabilir. Pirüvat kinaz enzim aktivitesinin normal dokulardakinden farklı olması kısmen değişmiş bir gen ifadesi ile açıklanmaktadır²⁷.

Ahn ve ark.²⁸ tarafından 7 hafta süre ile ratların içme sularına 12 mg/100 ml konsantrasyonda NNM uygulanmasından sonra 12, 23 ve 34. haftalarda böbreklerde normal hücre tubülleri ile karşılaştırıldığında asidofilik hücre tubülleri ve tümörlerinin saydam hücrelerinde glikolitik ve mitokondrial enzim aktivitelerinde artış saptanmıştır. Normal toplayıcı kanal epitelyumu ile karşılaştırıldığında glikolitik enzimler olan gliseraldehid-3-fosfat-dehidrogenaz ve pirüvat kinaz aktivitelerinde artışın daha az olduğunu göstermişlerdir. Diğer yandan, böbrek toplayıcı kanal epitelyumunda saydam hücre tubüllerinin gelişmesi ile glikolitik ve mitokondrial enzimlerde azalma görülmüştür. Bu enzim aktivitelerindeki azalma preneoplastik ve neoplastik lezyonların ilerlemesi esnasında karbonhidrat metabolizmasında temel bir değişme gösteren saydam/asidofilik hücre tümörlerinde artmaya meyletmektedir. Bu durum benzer şekilde çalışmamızda böbrek dokusu pirüvat kinaz aktivitelerinde azalma şeklinde kendini göstermiştir.

Sonuç olarak, ratlarda uzun süreli nitrozamin uygulamalarının ve özellikle 1-NPip ve N-NPir'in öncelikle karaciğer ve böbrek pirüvat kinaz aktivitesini azalttığı ortaya konuldu. Pirüvat kinaz aktivitesinin azalmasına bağlı olarak karbonhidrat metabolizmasında bozulma olabileceği, başta su olmak üzere çeşitli yollarla nitrozaminlere maruz kalınması sağlık problemlerine yol açabileceğinden önleyici tedbirlerin alınmasının gerekli olduğu kanaatine varıldı. Kullanılan denitrifikasyon yöntemleri oldukça pahalı ve ileri derecede teknik bir işlem olduğundan bu konuda en etkili yöntem, etkenin oluşmadan yok edilmesi, yani nitrat-nitrit kirliliğine neden olan kaynakların kontrol altına alınması olacaktır.

1) Morselli PL. Drug metabolism in vitro: Role of drug metabolism in drug disposition and effects. In: Pacifici GM, Fracchia GN (Editors). Advances in Drug Metabolism in Man. Luxenbourg: European Commission, Office for Official Publications of the European Communities, 1995: 3-34

2) Cooney RV, Ross PD, Bartolini GL, Romseyer J. N-nitrosamine formation: Factors influencing the aqueous reactions of nitrogen oxide with morfoline. Environ Sci 1987; 21: 77-83.

3) Andrews AW, Lijinsky W, Snyder SW. Mutagenicity of amine drugs and their products of nitrosation. Mutat Res 1984; 135 (2): 105-108.

4) Gough TA, McPhail MF, Webb KS, Wood BJ, Coleman RF. An examination of some foodstuffs for the presence of volatile nitrosamines. J Sci Food Agric 1977; 28 (4): 345-351.

5) Hodgson E, Silver IS, Butler LE, Lawton MP, Levi PE. Metabolism. In: Hayes WJ. Laws ER. (Editors). Handbook of Pesticide Toxicology. Vol. 1. Academic Press, San Diego, CA,1991; 107-143.

6) Aiub CA, Pinto LF, Felzenszwalb I. N-nitrosodiethylamine mutagenicity at low concentrations. Toxicol Lett 2003; 145 (1): 36-45.

7) Mirvish SS. Role of N-nitroso compounds (NOC) and N-nitrosation in etiology of gastric, esophageal, nasopharyngeal and bladder cancer and contribution to cancer of known exposures to NOC. Cancer Lett 1995; 93 (1): 17-48.

8) Vendemiale G, Grattagliano I, Caruso ML, et al. Increased oxidative stress in dimethylnitrosamine induced liver fibrosis in the rat: effect of nacetylcysteine and interferon-alpha. Toxicol Appl Pharmacol 2001; 175 (2): 130-139.

9) Thirunavukkarasu C and Sakthisekaran D. Effect of selenium on N-nitrosodiethyl-amine-induced multistage hepatocarcinogenesis with reference to lipid peroxidation and enzymic antioxidants. Cell Biochem. Funct 2001; 19 (1): 27-35.

10) Valentini G, Chiarelli L, Fortin R et al. The allosteric regulation of pyruvate kinase. J Biol Chem 2000; 275 (24): 18145-52.

11) Van Erp HE, Van Unnik JA, Rijksen G, Smits JG, Staal GE. Cellular expression of K-type pyruvate kinase in normal and neoplastic human tissues. Cancer 1991; 68 (12): 2595-601.

12) Klimek F, Bannasch P. Biochemical microanalysis of pyruvate kinase activity in preneoplastic and neoplastic liver lesions induced in rats by N-nitrosomorpholine. Carcinogenesis 1990; 11 (8): 1377-1380.

13) Klimek F, Moore MA, Schneider E, Bannasch P. Histochemical and microbiochemical demonstration of reduced pyruvate kinase activity in thioacetamide-induced neoplastic nodules of rat liver. Histochemistry. 1988; 90 (1): 37-42.

14) Beutler E, Blume KG, Kaplan JC et al. International committee for standardization in haematology: Recommended methods for red-cell enzyme Analysis. Br J Haematol 1977; 35: 311-340.

15) Lake BG, Phillips JC, Heading CE, Gangolli SD. Studies on the in vitro metabolism of dimethylnitrosamine by rat liver. Toxicology 1976; 5 (3): 297-309.

16) Fine DH, Rounbehler DP, Belcher NM, Epstein SS. N-Nitroso compounds: Detection in ambient air. Science 1976; 192 (4246): 1328.

17) Phillipson CE, Ioannides C. A comparative study of the bioactivation of nitrosamines to mutagens by various animal species including man. Carcinogenesis 1984; 5 (8): 1091-1094.

18) Karahan İ, Yılmaz S. Ratlarda bazı nitrosoaminlerin düşük miktarda, uzun süreli verilmesinin kan, karaciğer ve böbreklerde oksidatif stres üzerine etkileri. Fırat Üniversitesi Sağlık Bilimleri Dergisi 2006; 20 (1): 73-78.

19) Rigden DJ, Phillips SE, Michels PA, Fothergill-Gilmore LA. The structure of pyruvate kinase from Leishmania mexicana reveals details of the allosteric transition and unusual effector specificity. J Mol Biol. 1999; 20, 291(3): 615-635.

20) Atalay A. Nitrozolu bileşiklerin sıçan karaciğer laktat dehidrogenaz enzimine in vitro etkisi. Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi 1981; 3: 208-214.

21) Çetinkaya Ö, Çetinkaya S. Atalay A. Effect of intraperitonal administration of some nitrosamine on mause liver Na/K ATPase activities. Tr J Medical Sciences Tübitak 1994; 22: 81-83.

22) Elbers JR, Van Unnik JA, Rijksen G et al. Pyruvate kinase activity and isozyme composition in normal fibrous tissue and fibroblastic proliferations. Cancer 1991; 67 (10): 2552-2559.

23) Yılmaz S, Ozan S, Özercan İH. Comparison of pyruvate kinase variants from breast tumor and normal breast. Arch Med Res 2003; 34 (4): 315-324.

24) Pedersen SN. The glycolytic enzyme activity of the human cervix uteri. Cancer 1975; 35 (2): 469-474.

25) Gerbracht U, Eigenbrodt E, Simile MM et al. Effect of S-adenosyl-L-methionine on the development of preneoplastic foci and the activity of some carbohydrate metabolizing enzymes in the liver, during experimental hepatocarcinogenesis. Anticancer Res 1993; 13 (6A): 1965-1972.

26) Kil'dema LA. Changes in the isoenzymatic make up of pyruvate kinase in hepatic carcinogenesis. Vopr Med Khim 1979; 25 (4): 383-387.

27) Reinacher M, Eigenbrodt E, Gerbracht U et al. Pyruvate kinase isoenzymes in altered foci and carcinoma of rat liver. Carcinogenesis 1986; 7 (8): 1351-1357.

28) Ahn YS, Zerban H, Grobholz R, Bannasch P. Sequential changes in glycogen content, expression of glucose transporters and enzymic patterns during development of clear/acidophilic cell tumors in rat kidney. Carcinogenesis 1992; 13 (12): 2329-2334.