Çalışmamızda 21 günlük 60 adet dişi Wistar albino rat kullanıldı. Ratların bakım ve beslenmeleri Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Deneysel Araştırmalar Merkezi’nde (FÜTDAM) yapıldı. Ratlar rahatça hareket edebilecekleri alanlarda, yem ve su kaplarının kafese monte edilen plastik kafeslerde barındırıldı. Yem ve suları ad libitum olarak verildi. Kafeslerin temizliği haftalık olarak yapıldı ve altlık olarak talaş kullanıldı. Hayvanlar standart laboratuar şartlarında 12 saat aydınlık/karanlık periyodunda oda sıcaklığında (22±3 ˚C) muhafaza edildi.
Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurulundan gerekli onay alındıktan sonra çalışma başlatıldı. Denekler 4 gruba ayrıldı ve her grup 15 rattan oluştu. Meme kanseri oluşturmak üzere bir direkt karsinojen olan N-Metil-N-nitrosoüre (MNU)(Sigma Chemical Company Munich-Germany) kullanıldı.
Grup 1: Kontrol grubu: Kanser oluşturulmayan ve sadece bazal diyetle beslenen grup.
Grup 2: MNU uygulanan grup: 21 günlük dişi ratlara 50 mg/kg MNU periton içine (i.p.) enjekte edildi ve bazal diyetle beslenmeleri sağlandı. Bu grupta 2 rat öldüğünden, 13 rat ile çalışmaya devam edildi.
Grup 3: MNU uygulanan + Isırgan otu verilen grup: Bu gruptaki ratlara da ikinci grup ile aynı zamanda ve aynı dozda MNU uygulandı. 21 günlük ratlar 5,5 ay boyunca kg yem başına 50 gr ısırgan otu olacak şekilde yem hazırlanıp deney sonuna kadar beslenmeleri sağlandı. Ayrıca litre başına 50 gr olacak şekilde ısırgan otu kaynatılıp su olarak ta bunun tüketilmesi sağlandı (Yemler haftalık olarak hazırlandı ve suyla birlikte buzdolabında muhafaza edildi).
Grup 4: Isırgan otu verilen grup: 21 günlükten itibaren üçüncü gruptaki beslenme şekliyle aynı olmak üzere ısırgan otu verildi.
Kimyasal va Bitkisel Materyalin Hazırlanması: MNU, rat başına 50 mg/kg olarak tek doz halinde uygulandı. MNU birkaç damla %3’lük asetik asitte çözüldü. Sonra stok solüsyonu 10 mg MNU/ml olacak şekilde distile su ile sulandırılarak iki saat içinde ratlara ip. olarak enjekte edildi (22).
Isırgan otu Elazığ’daki yerel aktarlardan elde edildi. Kurutulmuş olarak alınan ısırgan otu blender ile toz haline getirildi. Toz halindeki ısırgan otunun 20 gr’ı 400 ml su ile 15 dakika kaynatıldı ve süzgeçten geçirildikten sonra 5,5 ay boyunca ratların bu su ile beslenmesi sağlandı (17). Yine 5,5 ay boyunca, kg yem başına 50 gr olacak şekilde toz halindeki ısırgan otu toz halindeki rat yemiyle harmanlandıktan sonra su ile hamur haline getirildi ve şekil verildikten sonra kurutuldu ve ratlar bu şekilde beslendi.
Örneklerin Alınması ve Hazırlanması: Palpasyon ile meme dokusunda tespit edilen kitlenin patologlar tarafından histopatalojik olarak tümör olduğu doğrulandıktan sonra, ratlar dekapite edilerek kan örnekleri alındı. Elde edilen kanın bir kısmı plazma hazırlanması için EDTA’lı tüplere alındı ve plazmada MDA, bir kısım kan ise heparinli tüplere alınarak elde edilen plazmada total antioksidan durum (TAS) çalışılmak üzere -20ºC derecede saklandı.
Biyokimyasal ölçümler: Plazma Lipid Peroksid Düzeylerinin Ölçümü: Plazma lipid peroksid düzeylerinin (malondialdehit) ölçümü Satoh (23) ve Yagi’den (24) modifiye edilen bir yöntemle spektrofotometrik olarak ölçüldü. Bu yöntemin prensibi, pH’nın 3,4 olduğu oksijenli bir ortamda numunenin tiyobarbitürik asit (TBA) ile 95ºC derecede inkübasyonu sonucu oluşan ürünün renginin 532 mn’de ölçülmesidir. Oluşan renkli kompleks, lipid peroksidin sekonder ürünü olan malondialdehit’e (MDA) aittir.
Total Antioksidan (TAS) Durum Ölçümü: Randox firmasına ait ticari kiti (Randox Laboratories, Diamond Road, Crumlin,Co.Antrim, United Kingdom, BT29 4QY) kullanılarak total antioksidan ölçümü yapıldı. Kullanılan metodun prensibine göre; ABTS (2,2’-Azino-di-[3-aehylbenzthiazolinesulphonate]) peroksidaz (metmyoglobin) ve H2O2 ile ABTS.+ radikal katyon oluşturmak için okside olur. Bunun sonucunda oluşan sabit mavi renk 600 nm’de ölçülür. TAS ölçümü için serum veya heparinli plazma kullanılabilir (25).
İstatistik Analizleri Bu çalışmada istatistik analizlerde SPSS 10 (Statistical Program for Social Sciences) paket programı kullanıldı. Bütün sonuçlar aritmetrik ortalama ± standart hata şeklinde ifade edildi. İstatistiksel analizlerde tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak Tukey-HSD testi ile gruplar arası karşılaştırmalar yapıldı. Anlamlılık derecesi olarak p<0.05 kabul edildi.