Sığırların lösemi virüsünün enfekte lökosit hücrelerinde çoğalması aşamasında viral tersine transkripsiyon enzim aktivitesi sonucunda oluşan proviral DNA'lar, enfekte hücrelerin kromozal DNA'sına entegre olmakta ve bu proviral DNA'lar klinik olarak sağlıklı görünen hayvanlarda uzun yıllar bulunmaktadır. Proviral DNA bulunan bu hücrelerde üretimli dönemle birlikte fazla sayıda yeni yavru virüsler kana salıverilmektedir. Bu nedenle, klinik olarak sağlıklı enfekte hayvanlar taşıyıcı olarak uzun yıllar enfeksiyonu horizental ve konjenital yolla saçmaktadırlar². Bundan dolayı, enfekte hayvanların belirlenmesi ve bunların sürüde uzaklaştırılması hastalıkla savaşımda oldukça önemlidir.

Sığırların lösemi virüsü ile enfekte hayvanın teşhis edilmesinde, virüse karşı antikor varlığını belirlemeye yönelik, enzime bağlı immunosorbent deneyi (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), agar gel immunudifuzyon testi (AGID) ve radioimmunoassay (RIA) gibi serolojik testler sıklıkla kullanılmaktadır^3,4. Bu testler içerisinde, ELISA, enfeksiyonun teşhis edilmesinde kolay uygulanabilirliği, duyarlı ve özgül olmasından dolayı, diğer serolojik testlere tercih edilmektedir⁴. Ancak, son yıllarda provirusun pozitif olduğu ama serolojik olarak negatif olan sığırların varlığı bildirilmiştir^2,5,6. Bu nedenle, şüpheli vakalarda virüse karşı oluşan antikorun tespitiyle birlikte virüs veya virüs yapı unsurlarının belirlenmesine yönelik doğrulayıcı testler önerilmektedir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), BLV ile enfekte tüm hayvanlarda proviral DNA'nın belirlenmesinde oldukça etkin bir test olarak kabul edilmektedir^7,8.

Bu çalışmada, daha önceki yıllarda BLV enfeksiyonunun yaygın olduğu belirlenen doğal enfekte bir sürüde⁹ iki farklı ELISA ve nested-PCR ile BLV enfeksiyonunun varlığının tespiti ve BLV'ye karşı her hangi bir savaşım programı uygulanmayan bu sürüde 10 yıllık bir süreç sonunda enfeksiyon insidansının belirlenmesi amaçlanmıştır.

ELISA: EDTA'sız tüplere alınan kan örneklerinden elde edilen serumlar ticari iki farklı ELISA kiti kullanılarak BLV antikorları yönünden test edildi. Bu testlerde bir tanesinde yüzeyi inaktif BLV ile kaplı (The CHEKITLeucotest) diğer ELISA kitinde ise BLV'nin p-24 proteini ile kaplı mikropleytler kullanılmıştır (EBLV Ab ELISA, Test-Line Ltd., 61200, Brno, Czech Republic). Hayvanlardaki seronegatiflik, seropozitiflik ve şüphelilik durumu kitlerde belirtilen kriterler dikkate alınarak tespit edildi.

DNA ekstraksiyonu ve nested-PCR: Tüm hayvanların lökositinden DNA ekstraksiyonu NucleoSpin®Tissue ticari kiti kullanılarak üretici firmanın belirttiği prosedüre göre gerçekleştirildi (Macherey-Nagel Inc USA). Ekstraksiyonlar esnasında lökosit örneklerinin bir kısmı kullanıldı ve diğer kısmı ihtiyaç duyulduğunda kullanılmak üzere - 80 ºC'de saklandı.

Nested-PCR prosedürü daha önceden tanımlandığı gibi gerçekleştirildi¹⁰. İlk adım PCR reaksiyonu, 3 µl lökosit DNA, 5µl 10xPCR Buffer (100 mMTris-HCl, pH 8.0, 500 mM potassiumchloride, 15 mM Magnesium chloride), her birinden 1.25 µM deoksinükleotitler, 1U Taq DNA polymerase (Bioron), 10 pM primerler (env5032; 5'-TCTGTGCCAAGTCTCCCAGATA-3' ve env5608; 5'-AACAACAACCTCTGGGAAGGGT-3') olmak üzere toplam 50µl PCR karışımı ile gerçekleştirildi. İkinci adım PCR reaksiyonunda ise, ilk adımdan farklı olarak, templeyt DNA olarak 1 µl birinci PCR ürünü ile primer olarak da env5099; 5'-CCAACAAGGGCGGCGCGGTTT- 3' ve env5521; 5'-GCGAGGCCGGGTCCAGAGCTGG-3' primerleri kullanıldı. Her iki aşama amplifikasyonlar 94 ºC'de 10 dak. başlangıç inkübasyonundan sonra, 94 ºC'de 1 dak. 55 ºC'de 1 dak. ve 72 ºC'de 2 dak.'lık toplam 32 siklus döngüyü takiben, 72 ºC'de 10 dak. son uzatma ile gerçekleştirildi. Elde edilen PCR ürünleri etidyum bromid ile boyandı ve % 2'lik agaroz jelde UV altında görüntülendi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: Doğal enfekte bir sürüde (n:65) sığırların lösemi virüs enfeksiyonunun varlığının tespiti amacıyla gerçekleştirilen nested-polimeraz zincir reaksiyonu ve iki farklı ticari ELISA kiti sonuçları.

Altmış beş hayvanın lökositlerinden elde edilen DNA'ların kalıp olarak kullanıldığı nested-PCR neticesinde ise her iki ELISA'da seropozitif 13 ve her bir ELISA'da birer farklı örneğe ilave olarak iki ELISA'da da seronegatif bir örnekte BLV proviral DNA varlığı tespit edildi. Dolayısıyla, nested-PCR'da toplam 16 örnekte (% 24,6) yaklaşık 444 baz çifti uzunluğunda amplikasyon ürünü agaroz jelde görüntülendi (Şekil 1).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: Sığırların lökosit hücrelerinde elde edilen DNA ile sığır lösemi virüs (BLV)'e karşı gerçekleştirilen nested-PCR ürünlerinin agaroz jelde görüntüsü. M1: marker (100 bp DNA Ladder), M2: marker (50 bp DNA Ladder), 1-9; BLV pozitif örnekler, 10; BLV negatif örnek.

Nested-PCR'a göre ELISA sonuçları kıyaslandığı zaman, ELISA'ların her birinin duyarlılıkları % 93,3 ve özgüllükleri ise % 100 olarak kaydedildi.

Mevcut çalışma sonunda 65 hayvanın iki farklı ELISA ile araştırılması sonucu, birer örnek farklı olmakla birlikte, 14 (% 21,5) tanesinde BLV'a karşı antikor yanıtı tespit edilmiştir. En az bir ELISA'da pozitif olan toplam 15 hayvanın hepsinde PCR ile BLV DNA'ları belirlenmiştir. Ayrıca, PCR'da, her iki ELISA'da da seronegatif olan bir sığırda BLV proviral DNA'sı tespit edilmiştir. Bu sonuçlar, öncelikle testler arası duyarlılığı akla getirmektedir. Bu nedenle, sonuç farklılığının PCR'da yalancı pozitiflikten kaynaklanabilmesi ihtimali düşünülerek, özellikle tartışmalı üç örnek (tek bir ELISA ile pozitif çıkan iki ve ELISA negatif olup PCR pozitif olan bir örnek) ekstraksiyon aşamasından başlayarak nested-PCR'da yeniden çalışılmıştır ve aynı sonuçlar elde edilmiştir. Daha önceki bazı çalışmalarda da BLV provirusun pozitif olduğu ama serolojik olarak negatif olan sığırlar bildirilmiştir^2,5,11. Enfeksiyonun varlığına rağmen seronegatiflik durumu genellikle enfeksiyonun ilk safhalarıyla ilişkili olabilir. Ayrıca, immun sistemi baskılayan sığırların mukozal hastalığı gibi enfeksiyonlar veya gebelik gibi fizyolojik faktörler de bu duruma neden olabilmektedir^12,13. Bunun yanısıra BLV'nin farklı provirus varyantlarıyla enfekte olan hayvanlarda da seronegatiflik bildirilmektedir^11,14. Bu nedenle, bu çalışmada da benzer durumlardan bir veya birkaçının söz konusu olduğu düşünülebilir. Elde edilen sonuçlar bu konuda devam eden tartışmalara katkı sağlamakla birlikte, bu konuda ileride daha detaylı çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır.

Son yıllarda ülkemizde, özellikle Ege ve Marmara Bölgelerinde, sığır yetiştiriciliğinde bireysel hayvan sağlığından ziyade sürü sağlığını gözeten yaklaşımların yaygınlaştığını görmekteyiz. Bu nedenle de enfeksiyöz hastalıklara verilen önemin arttığını ve birçok enfeksiyona karşı sürülerin taranması ile ilgili taleplerin geldiğini kaydetmekteyiz. Sürü taraması ile talepler, genel olarak, sığırların mukozal hastalığı, sığırların enfeksiyöz rinotrahitisi-enfeksiyöz balonopostitisi (İBR/İPV) ve sığırların lökozuna karşı olmaktadır. Bu bakımdan ülkemiz açısından mevcut çalışmanın verileri ileriki yıllarda daha da önem arz edecektir.

Sonuç olarak, bu çalışmanın verilerine göre, BLV'e karşı sürü bazında bir tarama programı uygulanması durumunda, serolojik testler içinde en duyarlı olan ve birçok avantajları bulunan ELISA'nın tek başına yetersiz kalabileceği görülmüştür. Bu nedenle de, ELISA ile bir tarama yapılması durumunda, özellikle prevalansı yüksek çıkan sürülerde, bu sürülerin uzun süre klinik ile hematolojik takibi ve ELISA'nın belirli bir süre sonra tekrarı faydalı olacaktır. Ayrıca, bu çalışmada elde edilen diğer bir önemli sonuç, enfekte bir sürüde eradikasyon programı uygulanmadığı taktirde 10 yıl gibi bir sürede enfeksiyonunun insidansının %7,1 oranından % 24,6 gibi oldukça yüksek bir orana yükseldiği kaydedilmesidir. Bu sonuçlar anneden yavruya plesanta yoluyla konjenital olarak geçen ve rektal palpasyonla dahi saçılabildiği gösterilen¹⁵ BLV gibi etkenlerle savaşımda sürü takibinin önemini göstermektedir.

1) Zhao X, Buehring GC. Natural genetic variations in bovine leukemia virus envelope gene: possible effects of selection and escape. Virology 2007; 366: 150-165.

2) Coulston J, Daniel RC, Lavin MF. Integration of bovine leukaemia virus at all stages of enzootic bovine leucosis. Arch Virol 1991; 119: 13-23.

3) Gutierrez SE, Dolcini GL, Arroyo GH, et al. Development and evaluation of a highly sensitive and specific blocking enzyme-linked immunosorbent assay and polymerase chain reaction assay for diagnosis of bovine leukemia virus infection in cattle. Am J Vet Res 2001; 62: 1571-1577.

4) Martin D, Arjona A, Soto I, et al. Comparative study of PCR as a direct assay and ELISA and AGID as indirect assays for the detection of bovine leukaemia virus. Vet Med B Infect Dis Vet Public Health 2001; 48: 97-106.

5) Eaves FW, Molloy JB, Dimmock CK, Eaves LE. A field evaluation of the polymerase chain reaction procedure for the detection of bovine leukaemia virus proviral DNA in cattle. Vet Microbiol 1994; 39: 313-321.

6) Fechner H, Kurg A, Geue L, et al. Evaluation of polymerase chain reaction (PCR) application in diagnosis of bovine leukaemia virus (BLV) infection in naturally infected cattle. Zentralbl Veterinarmed B 1996; 43: 621-30.

7) Murtaugh MP, Lin GF, Haggard DL, Weber AF, Meiske JC. Detection of bovine leukemia virus in cattle by the polymerase chain reaction. J Virol Methods 1991; 33: 73-85

8) Dusty WN, Tyler JW, Kleiboeker SB, Stoker A. Use of a polymerase chain reaction assay to detect bovine leukosis virus in dairy cattle. JAVMA 2003; 222: 983-985.

9) Yılmaz K, Gül Y, Özdemir H, Bolat Y. Elazığ ve çevresindeki sığırlarda enzootik sığır lökozunun araştırılması Turk J Vet Anim Sci 1997; 21: 115-123.

10) Licursi M, Inoshima Y, Wu D, et al. Genetic heterogeneity among bovine leukemia virus genotypes and its relation to humoral responses in hosts. Virus Res 2002; 86: 101-110.

11) Fechner H, Blankenstein P, Looman AC, et al. Provirus variants of the bovine leukemia virus and their relation to the serological status of naturally infected cattle. Virology 1997; 237: 261-269.

12) Kelly EJ, Jackson K, Marsolais G, Morrey J.D, Callan RJ. Early detection of bovine leukemia virus in cattle by use of the polymerase chain reaction. Am J Vet Res 1993; 54: 205-209.

13) Roberts DH, Lucas MH, Wibberley G, Westcott D. Response of cattle persistently infected with bovine virus diarrhoea virus to bovine leukosis virus. Vet Rec 1988; 122: 293-296.

14) Licursi M, Inoshima Y, Wu D, et al. Provirus variants of bovine leukemia virus in naturally infected cattle from Argentina and Japan. Vet. Microbiol 2003; 96,17-23.

15) Kohara J, Konnai S, Onuma M. Experimental transmission of Bovine leukemia virus in cattle via rectal palpation. Jpn J Vet Res 2006; 54: 25-30.