Çalışmamızda Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi
Hayvan Laboratuvar’ından temin edilen 200-220g
ağırlığında erişkin 28 adet Wistar albino türü dişi sıçan
kullanıldı. Çalışma için Marmara Üniversitesi Tıp
Fakültesi Etik Kurulu'ndan onay alındı. Deney süresince
% 24 ham protein, % 0.88 kalsiyum, ortalama % 0.44
fosfor, % 3.7 ham selüloz, % 5.7 ham kül, % 0.2 tuz ve %
10 nem içeriğine sahip 2600 Kg/Cal metabolik enerjili
16mm çapında pellet tipi bazal yem ile beslendiler. Su
ihtiyaçları, musluk suyu ile günlük olarak karşılandı.
Bitkisel Materyalin Hazırlanması: Afyon yöresinden
toplanmış 1 kg ısırgan tohumu toz haline getirildikten
sonra 2 litre etil alkolle (mutlak alkol) 15 dakika ayırma
hunisinde karıştırılarak 24 saat beklemeye bırakıldı.
Daha sonra ayırma hunisinden alınan karışım santrifüj
edilerek süpernatant kısmı alındı. Çökelti kısmı atıldı.
Evaporatörde etil alkol uçuruldu ve geri kalan kısım
serum fizyolojik ile sulandırıldı (1g/ml). Ekstrenin protein
içeriği Bradford yöntemine 20 göre tayin edildi.
Ekstrenin protein miktarı 600±70 μg/ml olarak belirlendi.
Sıçanlara 14 gün süresince her gün 1g/kg ekstre
intraperitonal (i.p.) olarak enjekte edildi.
Gruplar aşağıdaki şekilde oluşturuldu:
Grup 1: Kontrol grubu (n:7)
Grup 2: CCl4 uygulanan grup (n:7)
Grup 3: Isırgan otu tohumu ekstresi (n:7)
Grup 4: Isırgan otu tohumu ekstresi + CCl4 (n:7)
Hazırlanan ekstre 3. ve 4. grup sıçanlara 14 gün
süresince her gün 1g/kg i.p. olarak enjekte edildi. Grup 1
ve grup 2’de yer alan sıçanlara ise aynı süre boyunca i.p.
olarak serum fizyolojik uygulandı. Sürenin bitiminde, 16-
18 saat süre ile aç bırakıldıktan sonra 2. ve 4. grup
sıçanlara tek doz (1ml/kg) karbon tetraklorürün
zeytinyağındaki (Sigma) % 20'lik çözeltisi, 1. ve 3. grup
sıçanlara ise aynı hacimde zeytinyağı i.p. olarak 15. gün
uygulandı. Daha sonra kalplerinden alınan kan örnekleri
santrifüj edilerek plazmaları ayrıldı.
Örneklerin Alınması ve Hazırlanması: CCl4
uygulanmasından iki saat sonra, ketamin ile anesteziye
alınan sıçanların kalplerinden alınan kanlar heparinli
tüplere konuldu; eter verilerek öldürülen sıçanların
karaciğerleri hızla çıkartıldı, temizlendi ve % 0.9'luk
soğuk NaCl çözeltisi ile yıkandı. Filtre kağıdı ile
kurutularak, kullanıncaya kadar derin dondurucuda (-
20°C) saklandı. Karaciğerin bir kısmı histolojik çalışmalar
için %10 formaldehit solüsyonu içerisinde saklandı.
Alınan kanlar santrifüj edildi, plazmaları ayrıldı ve
bekletilmeksizin alanin aminotransferaz (ALT) ve
aspartat aminotransferaz (AST) enzim aktiviteleri
otoanalizörde (Hitachi 717 Boehringer Mannheim)
ölçüldü. Karaciğer dokuları kullanılacağı zaman
homojenizatör ile 0.15 M’lık KCI çözeltisi içinde
homojenize edildi. Homojenizasyon sonrası doku
örneklerinde lipid peroksidasyonu (LPO) ve GSH
düzeyleri tayin edildi.
LPO Düzeyleri Tayini: Karaciğer doku LPO düzeyleri
tiyobarbiturik asit testi ile ölçüldü 21. Plazma LPO
düzeyleri de aynı prensibe dayanan Buege ve Aust 'un
22 metoduna göre ölçüldü. TBA testi, lipid
peroksidasyonunun yıkım ürünlerininden
malondialdehitin (MDA) TBA ile reaksiyona girmesi
sonucu oluşan pembe renkli kompleksin, 532 nm dalga
boyunda verdiği absorbansın spektrofotometrik olarak
ölçülmesi prensibine dayanır. Karaciğer doku ve plazma
LPO düzeyleri sırasıyla nmol MDA/g doku ve nmol
MDA/ml olarak ifade edildi.
GSH Düzeylerinin Tayini: Karaciğer doku glutatyon
düzeyleri Ellman'ın 23 metoduna göre ölçüldü. Metot
sülfidril gruplarının 5,5-ditiyo-bis-2-nitro benzoik asit
(DTNB) ile reaksiyonu sonucu oluşturduğu renkli ürünün
spektrofotometrik olarak 412 nm'de ölçülmesi amacına
dayanır. Sonuçlar μmol GSH/g doku olarak ifade edildi.
Histolojik çalışmalar: Tüm gruplardan alınan
karaciğer doku örnekleri % 10’luk nötral formalin
solüsyonu ile 18 saat fiske edildi. Yükselen alkol
serilerinden (%70, %90, %96, %100) geçirilerek suyu
alındı, toluen ile şeffaflaştırıldı, 60 °C’lik etüvdeki
parafinde 1 gece bekletildikten sonra bloklandı. Bu
bloklardan 5μm kalınlığında kesitler alınarak, genel
morfolojik değerlendirme yapabilmek için hematoksileneosin
(H-E) boyası yapıldı. Boyalı kesitler Olympus BH2
fotomikroskop ile incelenerek fotoğraflandı.
İstatistiksel Analiz: Bu çalışmada istatistik analizler
için SPSS 11 (Statistical Program for Social Sciences)
paket programı kullanıldı. Sonuçlar aritmetrik
ortalama±standart hata şeklinde ifade edildi. İstatistiksel
analizlerde tek yönlü varyans analizi (ANOVA)
kullanılarak Tukey-HSD testi ile gruplar arası
karşılaştırmalar yapıldı. Anlamlılık derecesi olarak
p<0.05 kabul edildi.