Malatya kayısılarından Hacıhaliloğlu ile üzüm türlerinden Banazı Karası olgun dönemlerinde toplandı. Meyvelerin flavonoid ve resveratrol içeriklerinin belirlenmesinden sonra hayvan grupları oluşturuldu. Çalışmada 36 adet erkek Wistar sıçan kullanıldı. Sıçanlar deneme öncesi adaptasyon sağlamak amacıyla bir hafta süreyle standart olarak fare yemi ve su ile ad libitum beslendi. Sonra tesadüfî olarak altı eşit gruba ayrılan hayvanlara meyve ekstraktları ile Fenton reaktifi intraperitonal yolla altı hafta boyunca gün aşırı olarak enjekte edildi.

Çalışma sonunda kayısı ve üzüm ekstraktlarındaki polifenolik bileşiklerin eritrositlerde lipid peroksidasyon oluşumunu engelleyici etkiye sahip olduğu saptandı. Ayrıca meyve ekstraklarındaki bu moleküllerin protein ve glutatyon düzeyleri üzerine etkili olduğu tespit edildi.

Günümüzde yapılan çalışmalar oksijen radikallerinin giderilmesinde sadece organizmadan kaynaklanan savunma sistemlerinin yeterli olmadığını göstermektedir. Özellikle yapılan araştırmalarda organizmada meydana gelen oksidatif hasarlara karşı dışardan alınan antioksidanların da oldukça etkili olabileceği saptanmıştır^6-8.

Giderek artan sayıda bilimsel çalışma besin bileşenlerinin sağlık üzerinde olumlu etkilerinin olduğuna, kardiyovasküler hastalıklar, kanser ve osteoporoz gibi hastalıkların önlenmesine katkıda bulunduğuna ilişkin sonuçlar vermektedir^9-11. Sıklıkla tükettiğimiz sebze ve meyvelerde bulunan fitokimyasallar oksidanların yakalanması yanı sıra detoksifiye edici enzimlerin aktivasyonu, immün sistemin uyarılmasını, hücre çoğalması ve apoptozuna ilişkin gen ekspresyonunu, hormon metabolizması ile antibakteriyal ve antiviral etkileri düzenleyerek de etkili olur^12,13.

Lipid peroksidasyona bağlı olarak ortaya çıkan metabolik bozukluklar yalnızca yaşa ve zamana bağlı değil çevresel faktörler ve yaşam tarzı ile ilgilidir. Bu nedenle günümüzde hastalıklara yakalanma riskini azaltmada ve hastalıklar sonucu görülen ölüm oranlarını düşürmede insan diyetindeki besinlerin içerikleri önemli bir rol oynamaktadır.

Son yıllardaki bilimsel çalışmalar diyet ile hastalıklar arasındaki ilişkiyi açık bir şekilde ortaya koymuş olup, epidemiyolojik çalışmalar diyetin kronik hastalıkların önlenmesindeki rolüne işaret etmektedir. Beslenme alışkanlıklarının daha fazla meyve, sebze ve tahıl tüketecek şekilde değiştirilmesi serbest radikallerin etkilerinin azalmasını sağlamakta ve buna paralel olarak da kronik hastalıkların önlenmesinde etkin ve pratik bir yaklaşım olarak karşımıza çıkmaktadır¹⁴.

Bu çalışmada hücre membran yapısı üzerinde önemli hasarlara neden olan LPO'nun önlemesinde Dünya'da sıkça tüketilen kayısı ve üzüm meyvelerinin metanolik ekstraktlarının rat eritrositlerindeki etkilerinin araştırılması amaçlandı. Ayrıca araştırma ile bu ekstraktların protein ile glutatyon miktarları üzerindeki etkileri de belirlendi.

Deney Hayvanları: Deneysel çalışmalarda, canlı ağırlıkları ortalama olarak 192 g (192 ± 30 g) olan toplam 36 adet iki aylık Wistar albino cinsi erkek sıçan kullanıldı. Bu sıçanlar adaptasyon amacıyla bir hafta boyunca standart fare yemi ile beslendi ve su alımı serbest bırakıldı. Daha sonra sıçanlar altı gruba ayrıldı. Bu gruplar ve gruplara verilen madde konsantrasyonları aşağıda belirtilmiştir:

1. Kontrol grubu
2. H₂O₂ (Hidrojen Peroksit)+ FR (Fenton Reaktifi) grubu
3. Kayısı grubu
4. Üzüm grubu
5. FR+H₂O₂+Kayısı grubu
6. FR+H₂O₂+Üzüm grubu

Kontrol grubuna dimetil sülfoksid (DMSO) verildi. Radikal grubuna 100 ml distile su için 100 µl H₂O₂ ve 0.1 g FR karıştırılıp 500 µl gün aşırı olmak üzere sıçanlara intraperitonal yolla enjekte edildi. Meyveler ise 50/250 oranında %85' lik metanol ile ekstrakte edildi. Kullanılmaya hazır hale getirilen ekstraktlar gruplara 500 µl gün aşırı olmak üzere intraperitonal yolla enjekte edilip, uygulama 60 günlük süre sonunda tamamlandı. Bu sürenin sonunda bir gece öncesinden yemleri alınan sıçanların 12 saatlik açlık periyodundan sonra kan örnekleri eter anestezisini takiben median laparotomi sonrasında kalpten punksiyon ile EDTA'lı tüplere alındı ve analize kadar -20ºC'de bekletildi.

İnceleme Materyali: Çalışmada kullanılan meyve örnekleri Malatya ilinden mevsimsel dönemlerinde 2008 yaz aylarında toplandı. Kayısı türlerinden Hacıhaliloğlu Darende ilçesinden tüketilme olgunluğuna eriştiğinde ağaçlardan toplandı. Üzüm türlerinden Banazı Karası ise; Banazı kasabasından temin edildi. Çalışmada kullanılan meyve örnekleri steril poşetler içine konularak analiz yapılıncaya kadar -60ºC'de tutuldu.

Bitki Ekstraktlarının Hazırlanması: Kayısı (Prunus armeniaca) ve üzüm (Vitis vinifera) için 50/250 oranında metanol ekstraktı hazırlandı. Ekstraktlar blenderda örnek bitki grubunun çözücüler içerisinde parçalanmasıyla elde edildi. Blenderde parçalama işleminden sonra örnekler santrifüj edildi (5000 rpm +4°C). Santrifüj sonunda elde edilen supernatantdan rotovapor kullanılarak çözücüler ortamdan uzaklaştırıldı. Kullanılmaya hazır hale getirilen ekstraktlar -60ºC' de donduruldu.

Resveratrol ve Flavonoid İçeriğinin Belirlenmesi: Flavonoidlerin kromatografik analizi için 5 µm iç çapında PREVAIL C18 (15x4.6 mm) ters-faz kolon kullanıldı. Mobil faz olarak %1 asetik asit içeren metanol/su/asetonitril (46/46/8, v/v/v) karışımı kullanıldı¹⁵. Kateşin ve naringin için 280 nm, rutin, mirisetin ve morin için 254 nm, resveratrol için 306 nm dalga boyu kullanılarak RHPLC (Radyo Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi) ayrımını takiben DAD (Diode-Array Dedektör) tarafından bu flavonoidlerin ölçümü yapıldı. Akış hızı 1.0 ml/min ve enjeksiyon değeri 10 µL olarak ayarlandı. Analizlerin kromatogafik pikleri reaksiyon sürelerinin karşılaştırılması ve standart referanslarının UV spektrumları ile doğrulandı. Miktar ölçümü standart metot kullanımıyla pikin birleştirme yoluyla gerçekleştirildi. Tüm kromatogafik işlemler 25°C'de yapıldı.

Lipid peroksidasyon Miktarının Ölçülmesi: EDTA'lı tüplere alınan kan örnekleri +4ºC'de 5000 rpm'de 10 dakika süre ile santrifüj edilip, serum ile eritrosit kısmı ayrıldı. Eritrosit örneklerinin LPO düzeyinin ölçümü Ohkawa ve ark.'nın metodunda bazı modifikasyonlar yapılarak HPLC cihazında floresan dedektör ile ölçüldü¹⁶. Bunun için eritrosit pelletlerinden 1g tartıldı ve 2ml olarak serum fizyolojik ilavesinden sonra santrifüj edildi. Elde edilen süpernatantdan 500 µl alındı, 0.084 N H₂SO₄ ‘den 6 ml ve %10'luk PHA'dan 3ml olarak ilave edildikten sonra oda sıcaklığında 5 dakika bekletilip 5000 rpm'de 10 dakika santrifüj edilerek üst sıvı atıldı. Kalan pellet üzerine 1ml distile su ilave edilip çözündükten sonra 1 ml % 3'lük hidroklorik asit ve 1ml % 0.6'lık TBA eklendi ve 95ºC'de 60 dakika bekletildi. Bu süre sonunda soğuyan örneklere 3 ml butanol ilave edilip, santrifüj edildikten sonra süpernatantdan 1ml viallere alınarak ölçüm HPLC cihazında floresan dedektör ile gerçekleştirildi.

Glutatyon Miktarının Ölçülmesi: Eritrosit pelletlerinin yaş ağırlığı belirlendi. Önce beş ml Tris-EDTA tamponu ile yıkandı. Yıkama sonunda elde edilen süpernatant alınıp, glutatyon miktarı Elman reaktifi kullanılarak 412 nm'de spektrofotometrik olarak belirlendi¹⁷. Eritrosit pelletlerindeki glutatyon miktarının hesaplanmasında mg/g hücre pelleti miktarı cinsinden belirlendi.

Total Protein Miktarının Ölçülmesi: Örneklerin total protein miktarlarının ölçümü Lowry yöntemine göre yapılıp, sonrada 750 nm'de balnk'a karşı spekrofotometrede okundu¹⁸.

İstatistik Analizi: İstatistiksel analiz için, SPSS 15.0 software programı kullanıldı. Kontrol grubu ile deneysel grupları arasındaki karşılaştırma varyans analizi (ANOVA) ve LSD (En küçük anlamlı fark analizi) testleri kullanılarak yapıldı. Sonuçlar mean±SEM olarak verildi. Anlamlılık düzeyi olarak p<0.05 kabul edildi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: Meyve ekstraktlarının flavonoid ve resveratrol içeriği (µg/1 g)

Meyve Ekstraktlarının Eritrosit' deki Lipid Peroksidasyon Oluşumu Üzerine Etkisi: Eritrositlerdeki lipid peroksidasyonu düzeyinin kontrol grubuna göre FR grubunda oldukça belirgin miktarda arttığı belirlendi (p<0.001) (Şekil 1). Buna karşılık Darende-Hacıhaliloğlu (DH) ve Banazı Karası (B) verilen gruplarda LPO seviyesinin azaldığı ve bu azalmanın da B grubunda daha belirgin olduğu tespit edildi (p<0.05, p<0.01) (Şekil 1). Meyve örnekleri kendi aralarında karşılaştırıldığında, özellikle Banazı Karası verilen gruplardaki LPO düzeyinin kayısı gruplarına göre daha belirgin düzeyde azaldığı belirlendi. Fenton reaktifi grubuna göre ise DH+FR ve B+FR gruplarındaki MDA-TBA miktarının fazla düzeyde azaldığı gözlemlendi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: Meyve ekstraktlarının eritrositte MDA-TBA seviyesi üzerine etkisi Kontrol grubuna göre karşılaştırma; b<0.05, c:p<0.01 d:p<0.001. FR grubuna göre karşılaştırma; *** =p<0.001.

Meyve Ekstraktlarının Eritrositte Glutatyon Miktarı Üzerine Etkileri: Eritrositlerde glutatyon (GSH) düzeyinin kontrole kıyasla tüm gruplarda belirgin oranlarda azaldığı ve bu azalmanın da, FR ile DH+FR gruplarında daha belirgin olduğu gözlendi (p<0.001) (Şekil 2). FR grubu ile karşılaştırıldığında, D+FR ve B+FR gruplarında glutatyon belirgin oranda arttığı saptandı.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 2: Meyve ekstraktlarının eritrositte glutatyon miktarı üzerine etkileri Kontrol grubuna göre karşılaştırma; a:p>0.05, b<0.05, c:p<0.01 d:p<0.001. FR grubuna göre karşılaştırma; * =p<0.05, ** =p<0.01, *** =p<0.001.

Meyve Ekstraktlarının Eritrositteki Total Protein Miktarı Üzerine Etkileri: Eritrositlerde toplam protein düzeyinin kontrol grubuna göre bütün gruplarda belirli oranlarda azaldığı ve bunun da B ve B+FR gruplarında daha belirgin olduğu gözlemlendi (p<0.001) (Şekil 3).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 3: Meyve ekstraktlarının eritrositte total protein miktarı üzerine etkileri Kontrol grubuna göre karşılaştırma; b<0.05, c:p<0.01 d:p<0.001.

Bu değerlendirmemizi destekleyen bitkisel kaynaklı çoğu araştırmada da in vivo şartlarda oluşturulan oksidatif strese karşı fitokimyasalların koruyucu etkilerinin olduğunu ortaya koymuştur. Feng ve ark., çalışmalarında yeni doğan ratlarda üzüm çekirdek ekstraktının beyinde hipoksi iskemik hasarı azalttığını ve lipid peroksidasyonunu önlediğini bildirmişlerdir¹⁹. Obah ve ark., beyin dokusunda Fe⁺⁺ ile indüklenen lipit peroksidasyonuna karşı yeşil ve kırmızı biberlerin koruyucu etkisini araştırmışlardır²⁰. Biber ekstraktlarının rat beyninde basal hem de Fe⁺⁺ ile indüklenen lipit peroksidasyonunda MDA oluşumunu önemli ölçüde azalttığını belirlemişlerdir. Bu koruyucu etkinin ise biberlerin içerdiği fenolik bileşiklere bağlı olarak oluştuğunu ileri sürmüşlerdir.

Vardı ve ark., çalışmalarında rat bağırsağında oksidatif hasara karşı kayısı ve β-karotenin koruyucu etki gösterebildiğini ifade etmişlerdir. Kayısı eklenen gruplarda MDA seviyelerinde azalma olduğu ifade edilirken, antioksidan enzim düzeylerinde ise artış olduğunu bildirmişlerdir²¹. Konyalıoğlu ve Karamenderes Türkiye'de doğal olarak yetişen Achillea (civanperçemi) bitkisinin insan eritrosit ve lökositlerinde H₂O₂ ile indüklenen oksidatif strese karşı koruyucu etkisini araştırmışlar, çalışma sonunda Achillea türlerinin lipit peroksidasyonunun önlenmesinde doğal bir antioksidan kaynağı olduğunu bildirmişlerdir²². Eritrositler üzerinde yapılan başka bir araştırmada ise Mangifera indica (Mango)'nın H₂O₂ ile indüklenen lipit peroksidasyonuna karşı eritrositlerde direnç oluşturduğu belirlenmiştir²³.

Araştırmamızda bu hasara karşı gelişen nonenzimatik savunma sistemi olarak GSH aktivitesine bakıldığında eritrositlerde kayısı ve üzüm ekstraktlarının LPO üzerindeki olumlu etkilerinin glutatyon seviyesi üzerinde aynı etkiye sahip olmadığı şeklinde ifade edilmiştir. Meyve kontrol gruplarında daha belirgin olan bu farklılığın sebebinin ise; meyvelerin fenolik içeriğinden dolayı, eritrositlerde antioksidan bileşiklere gerek kalmadan LPO'nun engellenmesinden kaynaklandığı şeklinde düşünülmektedir.

Bu sonuçların yanında yaptığımız çalışmada, Fenton reaktifi verilen gruplarda glutatyon seviyesinin azaldığı belirlenmiştir. Glutatyon oksidatif strese karşı savunmanın en önemli basamağını oluşturmaktadır²⁴. Oksidatif stresin zayıf olduğu durumlarda devreye giren adaptasyon mekanizmaları sonucunda GSH düzeyi artmaktadır. Ancak; oksidatif stresin güçlü olduğu durumlarda zayıflayan adaptasyon mekanizmalarına ve artan GSSG oluşumuna bağlı olarak GSH düzeyi azalmaktadır^25,26. Hücre içerisinde GSSG'nin GSH'a redüksiyonunu katalizlemekle görevli olan enzim, glutatyon disülfid redüktaz (G; EC 1.6.4.2) olarak bilinmektedir. Sitozolde yerleşen enzim, aktivitesi sırasında bir kofaktör olan nikotinamid adenin dinükleotid fosfat'a (NADPH) gereksinim duymaktadır. GSSG miktarının artması da NADPH üretim yollarındaki herhangi bir bozukluğu göstermekte veya enzimin inaktivasyonu sonucu hücre içi GSH miktarının azalması anlamına gelmektedir. Çalışmamızda benzer şekilde glutatyonda azalmaya neden olan faktörün Fenton reakrifi olduğunu sonucuna varılmıştır. Çünkü sitozolik NAD(P) dehidrogenaz ve NAD malik enzimleri demir iyonu tarafından inhibe edilerek buna bağlı olarak ta pentoz döngüsü enzimlerinin inhibisyonu ile hücrelerde NADPH'ın varlığı azalır. Böylece reaktif oksijen türlerine olan duyarlılığın artması ile antioksidan savunma sistemi başarısızlığa uğrayarak glutatyon miktarında azalma gerçekleşebilir. Kısaca özetlemek gerekirse deney gruplarımızda GSH seviyelerinin kontrol grubuna göre düşük belirlenmesi, Fe⁺⁺ yüklemesi sonucu ortaya çıkan reaktif oksijen türlerine karşı GSH düzeyinin yetersiz kaldığını gösterebilir ya da sentez mekanizmasında bir azalma söz konusu olabilir.

Sonuç olarak; hidrojen peroksit ve demir enjeksiyonunun sıçanlarda eritrosit lipid peroksidasyonunu arttırdığını buna karşılık kayısı ve üzüm ekstraktlarındaki polifenolik bileşiklerin eritrositlerde oluşan LPO oluşumunu engelleyici etkiye sahip olduğu saptanmıştır. Ayrıca, meyve ekstraklarındaki bu moleküllerin protein ve GSH düzeyleri üzerine etkili olduğu tespit edilmiştir.

1) Freeman BA, Crapo JD. Biology of disease, free radicals and tissues injury. Lab Invest 1982; 47: 412-425.

2) Gupta MP, Khanduya KL, Sharma RR. Effects of cigarette smoke inhalation on antioxidant enzymes and lipid peroxidation in the rat. Toxicology Lett 1998; 41: 107-114.

3) Güven A, Maraşlı N, Kaya N. Karbon tetraklorür (CCI4) ve etil alkolün fare eritrosit antioksidan ve plazma lipid peroksidasyonuna etkisi. Kafkas Univ Vet Fak Derg 2003; 9: 1-4.

4) Salyi G, Mezes M, Bandihi G. Changes in the lipid peroxide status of broiler chickens in acute monensin poisoning. Acta Vet Hung 1990; 38: 263-270.

5) Sözmen EY, Onat T, Tanyalçın T, Erlaçin S. Eritrosit antioksidan enzimlerinde yaşa bağlı değişiklikler. Biyokimya Derg 1993; 18: 83-89.

6) Knekt P, Jarvinen R, Reunanen A, Maatela J. Flavonoid intake and coronary mortality in Finland: a cohort study. Br Med J 1996; 312: 478-481.

7) Pace-Asciak CR, Hahn SE, Diamandis EP, Soleas G, Goldberg DM. The red wine phenolics trans-resveratrol and quercetin block human platelet aggregation and eicosanoid synthesis: implication for protection againist coronary heart disease. Clinica Chimica Acta 1995; 235: 207-219.

8) Jang M, Cai L, Udean GO, Slowing KV, et al. Cancer chemopreventive activity of resveratrol, a natural product derived from grapes. Science 1997; 275: 218-220.

9) Hasler CM. The cardiovascular effects of soy products. J Cardiovasc Nur 2002; 16: 50-63.

10) Rein D, Paglieroni TG, Pearson DA, et al. Cocoa and wine polyphenols modulate platelet activation and function. J Nutr 2000; 130: 2120-2126.

11) Nakachi K, Matsuyama S, Miyake S, Suganuma M, Imai K. Preventive effects of drinking gren tea on cancer and cardiovascular disease: epidemiological evidence for multiple targeting prevention. BioFactors 2000; 13: 49-54.

12) Bouic PJ. The role of phytosterols and phytosterolins in immune modulation: a review of the past 10 years. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2001; 4: 471-475.

13) Liu RH. Health benefits of fruit and vegetables are from additive and synergistic combinations of phytochemicals. Am J Clin Nutr 2003; 78: 517-520.

14) Klug D, Rabanı J, Frıdovıch I. A direct demonstration of the catalytic action of superoxide dismutase through the use of pulse radiolysis. J Biol Chem 1972; 247(15): 4839-4842.

15) Zu Y, Li C, Fu Y Zhao C. Simultaneous determination of catechin, rutin, quercetin kaempferol and isorhamnetin in the extract of sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) leaves by RP-HPLC with DAD. J of Pharma and Biomed Anal 2006; 41: 714-719.

16) Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem 1979, 95: 351-358.

17) Elman GI. Tissue Sulfhydryl Groups. Arch Bioc 1959; 70-77.

18) Lowry OH, Rosenbrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin-phenol reagent. The J of Biochem 1951; 193: 265-277.

19) Feng Y, Liu Y, Fratkins JD, LeBlanc MH. Grape seed extract suppresses lipid peroxidation and reduces hypoxic ischemic brain injury in neonatal rats. Brain Res Bul 2005; 66: 120-127.

20) Oboh G, Puntel RL, Rocha JBT. Hot pepper (Capsicum annuum, Tepin and Capsicum chinese, Habanero) prevents Fe²⁺-induced lipid peroxidation in brain in vitro. Food Chem 2007; 102: 178-185.

21) Vardi N, Parlakpinar H, Ozturk F, et al. Potent protective effect of apricot and beta-carotene on methotrexate- induced intestinal oxidative damage in rats. Food and Chem Toxicol 2008; 46: 3015-3022.

22) Konyalioglu S, Karamenderes C. The protective effects of Achillea L. species native in Turkey against H2O2 -induced oxidative damage in human erythrocytes and leucocytes. J of Ethnopharma 2005; 102: 221-227.

23) Dixit Y, Kar A. Antioxidative activity of some vegetable peels determined in vitro by inducing liver lipid peroxidation. Food Res Inter 2009; 42: 1351-1354.

24) Rodriguez J, Di Pierro D, Gioia M, et al. Effects of a natural extract from Mangifera indica L, and its active compound, mangiferin, on energy state and lipid peroxidation of red blood cells. Biochim et Biophy Acta 2006; 1760: 1333-1342.

25) Ahmed RS, Seth V, Pasha ST, Banerjee, BD. Influence of dietary ginger (Zingiber officinales) on oxidative stress induced by malathion in rats. Food and Chem Toxicol 2000; 38: 443-450.

26) Zhang JF, Lıub H, Sun YY, Wang XR, Wu JC, Xue YQ. Responses of the antioxidant defenses of the Goldfish Carassius auratus, exposed to 2,4-dichlorophenol. Environ Toxicol and Pharma 2005; 19:185-190.