Gereç ve Yöntem: Bu amaçla 21 adet Wistar-Albino cinsi erkek sıçan (200-220 g) 3 eşit gruba ayrıldı. Grup I kontrol olarak kullanıldı. Grup II' deki sıçanlar dört hafta boyunca tolüene maruz bırakılırken (3000 ppm/1 saat/gün) Grup III'deki sıçanlara tolüen ile birlikte melatonin verildi (10 mg/kg/gün, ip). Dört haftalık deney süresinin sonunda hayvanlar dekapitasyon yolu ile öldürüldü. Prefrontal korteks dokusu çıkarılarak %10'luk formalin solüsyonuna atıldı. Doku örnekleri parafine gömüldü ve kesildi (5 μm kalınlıkta). Apoptozisin tespit edilebilmesi için kesitler TUNEL yöntemi ile boyandı.

Bulgular: Tolüen soluyan sıçanların prefrontal korteks dokusunda apoptotik hücre sayısının arttığı görüldü. Melatonin tedavisinin apoptotik hücre sayısını belirgin bir şekilde azalttığı görüldü.

Sonuç: Sonuçta bu immünohistokimyasal çalışmada melatonin tedavisinin tolüenin neden olduğu sıçan prefrontal korteksinde nöronal hasarı önlediği sonucuna varıldı.

Santral sinir sisteminin kısımlarından prefrontal korteks; gyrus frontalis superior, gyrus frontalis medius ve gyrus frontalis inferior’un büyük bölümü ile gyri orbitales ve gyrus cinguli’nin ön yarısını içine alır. Öğrenme, hafıza, hareketlerin planlanması ve düşüncelerin olgunlaştırılması gibi görevleri vardır^8,9. Ayrıca prefrontal alanların kişilik ve davranışların düzenlenmesi, dikkatin sürdürülmesi gibi birtakım bilişsel fonksiyonları da vardır. Bununla birlikte karar alma, geleceği tahmin etme, motor hareketlerin sonucunun kestirilmesi, karmaşık matematik ve soyut problemlerin çözülmesi ve daha birçok alanda görev almaktadır^10,11.

Melatonin (N-acetyl-5-methoxytryptamine) memelilerde pineal bezde üretilen ve sirkadiyen ritimle salınan bir nörohormondur¹². Bu hormon lipofilik ve hidrofilik aktiviteye sahip olmasından dolayı plasenta ve kan beyin bariyeri de dahil biyolojik membranlardan kolaylıkla geçebilir¹³. Melatoninin endokrin ritmi düzenleyici¹⁴ ve nöroprotektif etkiye¹⁵ sahip olduğu bildirilmekle, birlikte lipit peroksidasyonunu önleyerek dokuları koruduğu da bilinmektedir¹⁶.

Tolüenin sinir sistemi üzerine etkilerini inceleyen çok sayıda çalışma olmasına rağmen spesifik olarak prefrontal korteks dokusunda yaptığı hasarı (apoptozis) ve melatoninin koruyucu etkisini gösteren çalışmaya rastlayamadık. Bu çalışmada tolüenin prefrontal korteks dokusunda oluşturduğu hasar ve bu hasara karşı melatonin hormonunun koruyucu etkisi TUNEL metodu kullanılarak gösterilmeye çalışıldı.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: Sıçan prefrontal korteks dokusunda TUNEL boyamasını gösteren doku fotoğrafları. Tolüen verilen hayvan dokularında sayıları artmış TUNEL pozitif hücreler (A), tolüen ile birlikte melatonin tedavisi uygulanan dokularda tolüen grubuna oranla daha az sayıda görülen TUNEL pozitif hücreler (B). Kontrol hayvanlarında az sayıda TUNEL pozitif hücre (C). 0.5 μg/ml actinomycin D ile 19 saat inkübe edilmiş HL60 hücrelerininin boyanması ile elde edilmiş pozitif kontrol dokusu (D).

TUNEL Yöntemi: Parafin bloklardan 5 μm kalınlığında alınan kesitler polilizinli lamlara alındı. Üretici firmanın talimatları doğrultusunda ApopTag Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (Chemicon, cat no: QIA33, USA) kullanılarak apoptoza giden hücreler belirlendi. Xylene ile deparafinize edilen dokular, dereceli alkol serilerinden geçirilerek dehidrate edilip PBS ile yıkandı. Yüzde beşlik proteinase K ile 10 dakika inkübe edilen dokular, endojen peroksidaz aktivitesini engellemek için % 3 hydrogen peroxide ile 5 dakika inkübe edildi. PBS ile dokular yıkandıktan sonra, 20 dakika Equilibration Buffer ile inkübe edilip, 37 ºC’ de nemli ortamda bekletildi. TdT Enzyme damlatılarak ile 37 ºC’ de nemli ortamda 90 dakika inkübe edildi. Block buffer da 10 dakika daha sonra Stop/Wash Buffer da 10 dakika bekletilen dokular, Anti-Digoxigenin-Peroxidase ile 30 dakika inkübe edildi. Diaminobenzidine (DAB) substratı ile apoptotik hücreler görüntülendi. Methyl green ile zıt boyası yapılan kesitler uygun kapatma solüsyonu ile kapatıldı.Yeşil çekirdekli hücreler normal kabul edilirken kahverengi çekirdekler apoptozis lehine değerlendirildi.

İstatistik: Her hayvanda iki kesit, her kesitten ise 8 alan 400’ lük büyütme altında taranarak apoptotik hücreler sayıldı. Gruplardaki apoptotik hücre sayıları istatistiksel açıdan değerlendirildi. İstatistiksel değerlendirmede SPSS 15.0 bilgisayar paket programı (SPSS Inc. Software Chicago, IL, USA) kullanıldı. Gruplar arası farkın anlamlılığı Mann Whitney U testi ile değerlendirildi. P<0.05 olan değerler anlamlı kabul edildi.

TUNEL bulguları: Gruplardaki apoptotik hücre sayıları istatistiksel açıdan değerlendirildiğinde tolüen grubundaki hayvanlarda apoptotik hücre sayısının kontrol grubuna oranla anlamlı bir şekilde arttığı görüldü (p<0.01). Tolüen ile birlikte melatonin verilen grupta ise apoptotik hücre sayısının azaldığı, tolüen grubu ile tolüen+melatonin grubunda anlamlı bir fark olduğu tespit edildi (p<0.01, Şekil 2).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 2: Her gruba ait dokulardaki apoptotik hücre sayısı (TUNEL pozitif hepatosit) (p<0.01).

Bizim çalışmamızda da tolüen verilen sıçanların prefrontal korteks dokularında TUNEL yöntemi ile apoptotik hücre sayısının önemli oranda arttığı gösterildi (p<0,01).

Tolüenin beynin değişik bölgelerinde apoptotik nörodejenerasyona yol açtığı^7,23, ayrıca periferik sinir sistemini de hasarladığı gösterilmiştir²⁴. Tolüen solutulan gebe sıçanların serebellum, kalp, böbrek, karaciğer dokularında ve fetüs dokularında yüksek oranda tolüen tespit edilmiştir²⁵. Tolüenin serebellum ve hipokampus dokusunda apoptotik nörodejenerasyona yol açtığı gösterilmiştir²³. El-Nabi Kamel ve Shehata²⁶ tolüen verilen sıçanlarda en çok etkilenen dokunun beyin dokusu olduğunu, özellikle serebellum ve korteks bölgelerinin en fazla etkilenen yerler olduğunu kaspaz-3 miktarının artışı ile göstermişlerdir. Gotohda ve ark.²⁷ tolüenin hipokampus ve serebellum dokusunda GFAP (Glial fibriler asidik protein) miktarında artışa neden olduğunu bildirmişlerdir. Fujita ve ark.²⁸ tolüen bağımlısı bir kişide serebrum, serebellum ve beyin sapında atrofi ve bununla orantılı klinik bulgulara rastlamışlardır²⁸. Tolüenin frontal korteks ve beyin sapında hasara yol açarak caspase-3 aktivitesinde artışa yol açtığı gösterilmiştir⁷. Taş ve ark.²⁹ kronik tolüen maruziyetinin Bax immune reaktivitesinde artışa yol açtığını göstermişlerdir²⁹. Tolüene maruz kalan sıçanların akciğer, beyin ve testis dokularında TUNEL pozitif hücre sayısında anlamlı oranda artış olduğu bildirilmiştir^7,30,31.

Lipofilik özelliğe sahip olan tolüen hücre duvarındaki lipit yapısını değiştirip proteinlerle etkileşime girerek ve Na/K-ATPaz aktivitesini etkileyerek membran yapısını ve akışkanlığını etkileyebilir³². Doz cevap ilişkisini gösterir çok fazla çalışma olmadığından doz cevap ilişkisi tam olarak belirlenememiştir ancak yüksek dozlarda ilk etkinin santral sinir sistemi depresyonu olduğu bilinmektedir. Yüksek dozda maruziyetlerde diğer uçucu maddelerle benzer olarak psikomotor hasarlanma, lokomotor aktivitelerde eksitasyon ve daha sonra da inhibisyon, ayakta durma refleksinin kaybolması ve sedasyon gibi etkiler görülür. Tolüenin bu etkileri gabaerjik, glutamaterjik, serotonerjik, dopaminerjik yolakları etkileyerek yaptığı sanılmaktadır^5,25.

Çalışmamızın sonuçları incelendiğinde literatürdeki çalışmalarla paralellik gösteriyordu. Tolüene maruz kalan hayvanlarda akut dönemde lokomotor aktivitede azalma, taşikardi ve hipersalivasyon gözlemlenirken, uzun dönemde hayvanlarda davranış değişiklikleri, iştahsızlık ve saldırgan hareketlerin arttığı gözlemlendi.

Reiter³³ melatoninin hem direk hem de dolaylı olarak antioksidan özelliğe sahip olduğunu belirtmiştir. Melatoninin mitokondri üzerinde etki göstererek yaşlanmayla birlikte meydana gelen doku hasarını önlediği^13, Parkinson ve diğer nörodejeneratif hastalıklarda oldukça yüksek bir tedavi edici potansiyele sahip olduğu da bilinmektedir³⁴. İskemi-reperfüzyon hasarı gibi çok fazla hasarın olduğu durumlarda bile dışarıdan verilen melatoninin en az fizyolojik melatonin kadar koruyucu etkisi olduğu iddia edilmektedir³⁵. Melatoninin oldukça toksik etkili bir madde olan formaldehitin birçok dokuda meydana getirdiği oksidatif hasarı önlediği de gösterilmiştir¹⁵. Baydaş ve ark.^36,37 % 60-70 oranında tolüen içeren tiner (3000 ppm/45 gün) ile yaptıkları çalışmalarda melatoninin artan oksidatif stresin neden olduğu GFAP seviyelerini düşürdüğünü, hafıza öğrenme bozukluklarını azalttığını göstermişlerdir. Kronik tolüene maruz kalan sıçanların frontal korteks ve beyin sapı dokularında apoptotik hücre sayısının arttığı kaspaz-3 aktivitesinde artış ve TUNEL pozitif hücre sayısıdaki artış ile gösterilmiştir⁷.

Bizim çalışmamızda ise melatonin hormonunun bu çalışmalara paralel bir etki göstererek dokuyu koruduğu bunun neticesi olarak melatonin grubundaki sıçanlarda TUNEL pozitif hücre sayılarının kontrol grubuna yakın olarak düşük olduğu görüldü.

Bu çalışmada tolüen verilen sıçanlarda tolüen toksisitesi ile ilgili klinik belirtiler gözlemlenmiştir. Bunun yanında apoptotik hücrelerin sayısında artma olması tolüenin prefrontal korteks dokusunda ciddi hasara yol açtığının bir göstergesidir. Melatonin tedavisi ile bir düzelmenin sağlanmış olması melatoninin tolüenin toksik etkilerini azaltmada bir koruyucu ve tedavi seçeneği olabileceğini göstermektedir.

Tolüenin özellikle beyin ve karaciğer olmak üzere birçok dokuda aşırı derecede biriktiği dikkate alındığında, kan beyin bariyerini kolayca geçebilen, hücrenin DNA’sına kadar kolayca nüfuz edebilen bilinen en güçlü antioksidanlardan biri olan melatonin de tedavideki yeri iyi değerlendirilmelidir.

1) OEHHA (Office of Environmental Health Hazard Assessment) Determination of Acute Reference Exposure Levels for Airborne Toxicants. http://www.oehha.ca.gov/air/acute_rels/pdf/108883A.pdf/15.09.2011

2) Ono A, Kawashima K, Sekita K, et al. Toluene inhalation induced epididymal sperm dysfunction in rats. Toxicology 1999; 139: 193-205.

3) ATSDR (Agency for Toxic Substances and Disease Registry). Case Studies in Environmental Medicine; Toluene Toxicity. http://www.atsdr.cdc.gov/csem/toluene/15.09.2011

4) Dossing M, Aelum JB, Hansen SH, Lundqvist GR, Andersen NT. Urinary hippuric acid and orthocresol excretion in man during experimental exposure to toluene. Br J Ind Med 1983; 40: 470-473.

5) Balster RL. Neural basis of inhalant abuse. Drug Alcohol Depend 1998; 51: 207-214.

6) Gotohda T, Nishimura A, Morita K. Immunohistochemical studies on early stage of hepatic damage induced by subacute inhalation of toluene vapor in rats. J Appl Toxicol 2009; 29: 505-509.

7) Kanter M. Protective Effects of Nigella sativa on the Neuronal Injury in Frontal Cortex and Brain Stem after Chronic Toluene Exposure. Neurochem Res 2008; 33: 2241-2249.

8) Arıncı K, Elhan A. Anatomi (2.cilt). Ankara: Güneş Kitabevi, 1995: 388.

9) Duncan J. An adaptive coding model of neural function in prefrontal cortex. Nat Rev Neurosci 2001; 2: 820-829.

10) Ganong WF. Tıbbi Fizyoloji. İstanbul: Nobel Tıp Kitabevi, 2002: 249-268.

11) Ranganath C, Jonson MK, D’Espisoto M. Prefrontal activity associated with working memory and episodic long-term memory. Neuropsychologia 2003; 41: 378-389.

12) Shida CS, Castrucci AM, Lamy-Freund MT. High melatonin solubility in aqueous medium. J Pineal Res 1994; 16: 198-201.

13) Okatani Y, Wakatsuki A, Reiter RJ. Melatonin protects hepatic mitochondrial respiratory chain activity in senescence-accelerated mice. J Pineal Res 2002; 32: 143-148.

14) Forsling ML, Stoughton RP, Zhou Y, Kelestimur H, Demaine C. The role of the pineal in the control of the daily patterns of neurohypophysial hormone secretion. J Pineal Res 1993; 14: 45-51.

15) Zararsiz I, Kus I, Ogeturk M, et al. Melatonin prevents formaldehyde-induced neurotoxicity in prefrontal cortex of rats: an immunohistochemical and biochemical study. Cell Biochem Funct 2007; 25: 413-418.

16) Longoni B, Salgo MG, Pryor WA, Marchiafava PL. Effects of melatonin on lipid peroxidation induced by oxygen radicals. Life Sci 1998; 62: 853-859.

17) Yilmaz B, Canpolat S, Sandal S, et al. Paint thinner exposure inhibits testosterone synthesis and secretion in a reversible manner in the rat. Reprod Toxicol 2006; 22: 791- 796.

18) Saraste A, Pulkki K. Morphologic and biochemical hallmarks of apoptosis. Cardiovasc. Res 2000; 45: 528- 537.

19) Friedlander MR. Apoptosis and caspases in neurodegenerative diseases. N Engl J Med 2003; 348: 1365-1375.

20) Fulda S, Debatin KM. Resveratrol modulation of signal transduction in apoptosis and cell survival: a mini-review. Cancer Detect Prev 2006; 30: 217-223.

21) Tao W, Kurschner C, Morgan JI. Modulation of cell death in yeast by the Bcl-2 family of proteins. J Biol Chem 1997; 272:15547-15552.

22) D'Amelio M, Cavallucci V, Cecconi F. Neuronal caspase-3 signaling: not only cell death. Cell Death Differ 2010; 17: 1104-1114.

23) Ladefoged O, Hougaard KS, Hass U, et al. Effects of combined prenatal stress and toluene exposure on apoptotic neurodegeneration in cerebellum and hippocampus of rats. Basic Clin Pharmacol Toxicol 2004; 94: 169-176.

24) Coskun O, Yuncu M, Kanter M, Buyukbas S. Ebselen protects against oxidative and morphological effects of high concentration chronic toluene exposure on rat sciatic nerves. Eur J Gen Med 2006; 3: 64-72.

25) Bowen SE, Hannigan JH, Irtenkauf S. Maternal and fetal blood and organ toluene levels in rats following acute and repeated binge inhalation exposure. Reprod Toxicol 2007; 24: 343-352.

26) El-Nabi Kamel MA, Shehata M. Effect of toluene exposure on the antioxidant status and apoptotic pathway in organs of the rat. Br J Biomed Sci 2008; 65: 75-79.

27) Gotohda T, Tokunaga I, Kubo S, et al. Effect of toluene inhalation on astrocytes and neurotrophic factor in rat brain. Forensic Sci Int 2000; 113: 233-238.

28) Fujita K, Koga Y, Takemasa K, Koike H, Akai J. A case of chronic toluene intoxication with atrophy of cerebrum, cerebellum and brainstem on CT and MRI. Rinsho Shinkeigaku 1992; 32: 421-425.

29) Tas U, Ogeturk M, Meydan S, et al. Hepatotoxic activity of toluene inhalation and protective role of melatonin. Toxicol Ind Health 2011; 27: 465-473.

30) Kanter M. Thymoquinone attenuates lung injury induced by chronic toluene exposure in rats. Toxicol Ind Health 2011; 27: 387-395.

31) Kanter M. Thymoquinone reestablishes spermatogenesis after testicular injury caused by chronic toluene exposure in rats. Toxicol Ind Health 2011; 27: 155-166.

32) Calderon-Guzman D, Espitia-Vazquez I, Lopez-Dominguez A, et al. Effect of toluene and nutritional status on serotonin, lipid peroxidation levels and NA+/K+-ATPase in adult rat brain. Neurochem Res 2005; 30: 619-624.

33) Reiter RJ, Tan DX, Mayo JC, et al. Melatonin as an antioxidant: biochemical mechanisms and pathophysiological implications in humans. Acta Biochim Pol 2003; 50: 1129-1146.

34) Mayo JC, Sainz RM, Uria H, et al. Melatonin prevents apoptosis induced by 6-hydroxydopamine in neuronal cells: implications for Parkinson's disease. J Pineal Res 1998; 24: 179-192.

35) Kavakli A, Parlakpinar H, Yahsi S, Ogeturk M, Acet A. The effects of melatonin on focal cerebral ischemia-reperfusion model. Saudi Med J 2004; 25: 1-2.

36) Baydas G, Reiter RJ, Nedzvetskii VS, et al. Melatonin protects the central nervous system of rats against toluenecontaining thinner intoxication by reducing reactive gliosis. Toxicol Lett 2003; 137: 169-174.

37) Baydas G, Ozveren F, Akdemir I, Tuzcu M, Yasar A. Learning and memory deficits in rats induced by chronic thinner exposure are reversed by melatonin. J Pineal Res 2005; 39: 50-56.