Çeşitli hayvan türlerinde ve dokularında enzimin optimum şartlarının belirlenmesi ve dokulardaki dağılımının araştırılması; ölçümler anında enzimin en aktif olduğu düzeyin saptanması ve enzimin fizyolojik rollerini ortaya çıkarmak için önemlidir. Tavşan karaciğer doku arginaz enziminin optimum özellikleri ile ilgili literatür bilgiye rastlanılmamıştır. Bu nedenle çalışmada tavşan karaciğer dokusunda arginazın optimize edilmesi ve farklı dokulardaki aktivitenin belirlenmesi amaçlanmıştır.

Karbondioksit solutma yöntemi (%99 karbondioksit içeren kapalı tank) ile ötenazi edilen tavşanlardan kesimden hemen sonra alınan dokular (karaciğer, böbrek, kalp, uterus, beyin, dalak, bağırsak, yemek borusu, kas, dil, akciğer, mide, soluk borusu) üzerindeki kanlardan temizlendikten sonra %0.9'luk NaCl içinde soğuk zincire uyularak laboratuara getirildi ve dokular folyo kağıdına sarılarak -80 °C'de derin dondurucuda daha sonra kullanılmak üzere saklandı.

Alınan doku örnekleri süzgeç kağıdı arasında kurutularak 0.5 g tartıldı ve distile su ile 5 mL'ye tamamlanarak (ağırlık/hacim) cam-teflon homojenizatörle homojenize edildi. Homojenat +4 °C'de 13500 rpm'de 15 dakika santrifügasyon işlemine tabii tutulduktan sonra ayrılan süpernatant kısmı enzim kaynağı olarak kullanıldı. Karaciğer arginazının optimum şartlarının belirlenmesi için tüm karaciğer homojenat süpernatantlarının yarısı birleştirilerek bir havuz oluşturuldu.

Arginaz aktivitesi, Tiyosemikarbazid-Diasetil Monoksim Üre (TDMU) yöntemi esas alınarak ölçüldü⁷. Yöntemin prensibi arginaz tarafından L-argininin hidrolizi ile oluşan ürenin spektrofotometrik ölçümüne dayanmaktadır. Arginaz aktivitesinin bir ünitesi 1 saatte 37 ºC'de L-argininden 1 μmol üre oluşturan enzim aktivitesinin mg protein cinsinden ifadesidir (μmol üre / saat/mg protein). Homojenatta protein miktarı Lowry ve ark.⁸'nın bildirdikleri modifiye yönteme göre tespit edildi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: Tavşan karaciğer doku arginaz aktivitesinin preinkübasyon ısısına bağlı olarak değişimi

2. Preinkübasyon Süresinin Tespiti: Preinkübasyon süresini tespit etmek için, 1 mM MnCl₂ varlığında ve 65 °C preinkübasyon ısısında, 0-25 dakikalık zaman aralıklarında enzimin aktivitesi incelenmiştir. 65 °C'de 15 dakikalık preinkübasyon enzim aktivitesinin yaklaşık 4 misli artırmıştır. Enzimin maksimum aktiviteye 15 dakikada ulaştığı görülmüş ve optimal preinkübasyon süresi 13 dakika olarak kabul edilmiştir (Şekil 2).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 2: Tavşan karaciğer doku arginaz aktivitesinin preinkübasyon zamanına bağlı olarak değişimi

3. Mangan İyonlarının Etkisi: Preinkübasyon ortamına 0-5 mM konsantrasyonları arasında değişen MnCl₂ ilave edilmiş ve enzim aktivitesi incelenmiştir. Enzim aktivitesi 2 mM MnCl₂ konsantrasyonunda yaklaşık 4 misli yükselmiş, daha yüksek konsantrasyonda aktivite düşmüştür. Tavşan karaciğer doku arginazı için en uygun MnCl₂ konsantrasyonu 2 mM olarak kabul edilmiştir (Şekil 3).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 3: Tavşan karaciğer doku arginaz aktivitesinin MnCl2 konsantrasyonuna bağlı olarak değişimi

4. İnkübasyon Süresinin Tespiti: Enzim kaynağı 0- 30 dakikalık zaman dilimlerinde 37 °C'de inkübasyona tabi tutulmuş ve reaksiyon sonunda meydana gelen ürenin zaman faktörüne bağlı olarak miktarları belirlenmiştir. Şekil 4'de görüldüğü gibi üre sentezindeki artış zamana bağlı olarak 18. dakikaya kadar doğrusallığını korumuş, bu sürenin sonunda lineerlik yerini hiperbolik bir görünüme bırakmıştır. Bundan dolayı enzim için optimum inkübasyon süresi 10 dakika olarak belirlenmiştir.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 4: Tavşan karaciğer doku arginaz aktivitesinin inkübasyon zamanına bağlı olarak değişimi

5. pH'nın Etkisi: Glisin-sodyum hidroksit tamponu (pH: 8.6-10.6), sodyum bikarbonat-sodyum karbonat tamponu (pH:9.2- 10.2) ve sodyum bikarbonat-sodyum hidroksit tamponları (pH:9.7-10.9) kullanılarak değişik pH’larda arginaz aktivitesi ölçülmüş ve pH profili çıkarılmıştır. Şekil 5'de görüldüğü gibi en yüksek aktivite pH 10-10.1'de sodyum bikarbonat–sodyum karbonat tamponu varlığında elde edildiğinden tavşan karaciğer arginaz aktivitesi için en uygun tamponun sodyum bikarbonat- sodyum karbonat tamponu, optimal pH'nın da 10 olduğu tespit edilmiştir.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 5: Tavşan karaciğer doku arginaz aktivitesinin çeşitli tampon sistemlerine ve pH'ya göre gösterdiği değişiklikler ( NaHCO3-Na2CO3 tamponu, Glisin-NaOH tamponu, NaHCO3-NaOH tamponu)

6. Arginin Konsantrasyonunun Etkisi: Tavşan karaciğer doku arginazı için optimal şartlar tespit edildikten sonra, arginazın substratı olan L-arginine karşı Km'i Michaelis-Menten kinetiği ile incelenmiştir (Şekil 6). Bu amaçla enzim miktarı sabit tutulup, L-arginin konsantrasyonu değiştirilerek arginaz aktivitesine bakılmıştır. Şekil 6'da görüldüğü üzere 0.5 mM'a kadar olan L-arginin konsantrasyonundaki artış enzim aktivitesinde lineer bir artışa (birinci mertebe kinetiği) neden olmuş, bu noktadan itibaren doğrusallık yavaş yavaş kaybolarak, yerini hiperbolik bir görünüme (karışık mertebe kinetiği) bırakmıştır. 25 mM'lık L-arginin konsantrasyonundan itibaren, arginaz L-arginin ile doygunluğa ulaşarak (sıfır mertebe kinetiği) reaksiyon sabit hızla devam etmiştir.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 6: Tavşan karaciğer doku arginaz aktivitesinin L-arginin konsantrasyonuna bağlı olarak değişiminin Michaelis-Menten grafiği ile gösterilmesi

Enzim aktivitesinin L-arginin konsantrasyonuna bağlı olarak değişimi Michaelis-Menten eşitliği yanında Lineweaver-Burk (Şekil 7) ve Eadie-Hofstee (Şekil 8) eğrileriyle de incelenmiş ve tavşan karaciğer doku arginazının L-arginine karşı olan Km'inin 1.6 mM civarında olduğu bulunmuştur.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 7: Tavşan karaciğer arginaz aktivitesinin L-arginin konsantrasyonuna bağlı olarak değişiminin Lineweaver-Burk eğrisi ile gösterilmesi

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 8: Tavşan karaciğer arginazının L-arginine karşı olan Km’inin Eadie-Hofstee eğrisi ile saptanması

7. Tavşanlarda Arginaz Aktivitesinin Dokulara Göre Dağılımı: Tavşan karaciğer doku arginazı ölçümünde tarafımızdan tespit edilen, diğer dokuların arginaz aktivitesinin ölçümünde ise rat böbrek arginazı için saptanmış⁹ optimum koşullar kullanılmıştır. Tavşan dokularındaki arginaz aktiviteleri Tablo 1'de verilmiştir.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: Tavşan dokularında arginaz akvitelerinin dağılımı (n: 6, ortalama±standart sapma)

Arginazın aktivasyonunda preinkübasyon ısısı kadar preinkübasyon süresi de önemlidir. 65 °C'de 15 dakikalık preinkübasyon tavşan karaciğer doku arginazının aktivitesini yaklaşık 4 misli artırmıştır (Şekil 2). Farklı tür ve dokularda çalışılan arginazların preinkübasyon sürelerinin 5 ile 20 dakika arasında değiştiği bildirilmiştir^9,10,12-15. Tavşan karaciğer doku arginazının en uygun preinkübasyon süresinin 13 dakika olduğu tespit edilmiş olup bu değer diğer dokular için belirtilen preinkübasyon süresi sınırları içerisindedir. Tüm bu çalışmalara zıt olarak rat böbrek arginazının aktivasyonu için preinkübasyon ısısı ve süresinin gereksiz olduğu bildirilmiştir⁹.

Bir metalloenzim olan arginazın tam katalitik aktivite gösterebilmesi, subunitelerine ayrılmaması ve kuaterner yapısının şekillenmesi için her subünitenin bir mol Mn⁺² içermesi gerekir^16,17. Preinkübasyon ısısının Mn⁺² iyonlarına gereksinimini tespit etmek için enzim kaynağı MnCl₂'lü ve MnCl2'süz (distile su ile) preinkübasyona tabii tutulmuştur. MnCl₂'lü preinkübasyon uygulanan enzim kaynağının, MnCl₂'süz preinkübasyon uygulanan enzim kaynağından yaklaşık 4 kat daha fazla aktivite gösterdiği saptanmıştır (Şekil 4). Tavşan karaciğer arginaz aktivitesi için de preinkübasyon ve Mn+2 iyonları gereklidir. Mn⁺²'nın preinkübasyon sırasında arginaza bağlanarak enzim aktivitesini ve dayanıklılığını artırdığı açıklanmıştır^10,11,17. Mn⁺² iyonlarının enzim ile substrat arasında metal bir köprü kurduğu ve enzim- Mn⁺²-arginin kompleksinin oluşmasının enzimi aktive ettiği bildirilmektedir¹⁸. Bu konu ile ilgili çalışmalarda ortak nokta Mn⁺²'nın arginaz aktivitesinde vazgeçilmez bir kofaktör olması ve optimal Mn⁺² derişiminin dokuya göre farklılık göstermesidir^10,11,16-18.

Enzimatik reaksiyonlar vücut ısısında oluştuğu için enzim kaynağı 37 °C'de 0-30 dakikalar arasında inkübasyona bırakılarak optimum inkübasyon süresi tespit edilmeye çalışılmış, 18. dakikaya kadar lineerliğin devam ettiği, 18. dakikadan sonra ise lineerliğin yerini hiperbolik bir görünümün aldığı gözlemlenmiştir (Şekil 4). Enzim aktivitesindeki lineer artışın 18. dakikadan sonra lineerlikten sapması reaksiyon sonucu oluşan ornitin ve ürenin, enzimin inhibisyonuna (ürün inhibisyonu) neden olmasından kaynaklanabilir^19,20.

Farklı tamponlar ve farklı pH'lar kullanılarak memeli arginazlarının bazik optimum pH'a (9.5-10.5) sahip olduğu gösterilmiştir^10-13,15,18. Tavşan karaciğer doku arginazı için en yüksek aktivite pH 10-10.1'de sodyum bikarbonat-sodyum karbonat tamponu varlığında bulunmuştur (Şekil 5).

Tavşan karaciğer doku arginazının L-arginine karşı olan Km değeri 1.6 mM olarak bulunmuştur (Şekil 6). Yapılan çalışmalarda farklı türlerden karaciğer arginazının L-arginine karşı olan Km' inin geniş sınırlar içinde değiştiği görülmüştür. Km değeri fascioliosisli koyunlarda 4 mM^13, insanlarda 4.1 mM^12, diabetik ve normal ratlarda 3.2 mM^9, kobaylarda 19.6 mM²¹ olarak bulunmuştur. Tavşan karaciğer doku arginazı için tarafımızdan bulunan Km değeri diğer çalışmalarda elde edilen Km değerlerinden daha düşüktür.

Tavşan dokularındaki arginaz aktivitelerinin tespit edildiği bu çalışmada en yüksek arginaz aktivitesi diğer memeli türlerinde olduğu gibi^1,2 karaciğerde tespit edilmiştir. Lisowska-Myjak ve ark.²² 31 türün bağırsak arginaz aktivitesinin türden türe 2 ile 100 misli arasında geniş bir farklılık gösterdiğini ve en yüksek aktivitenin tavşan, rat, hamster ve farelerde olduğunu tespit etmiştir. Fare ve ratların tükürük bezlerinde arginaz aktivitesinin değişen seviyeleri bulunurken tavşan ve kobayın tükürük bezlerinin hemen hemen hiç arginaz aktivitesine sahip olmadığı kaydedilmiştir²³.

Primatlarla karşılaştırıldığında (maymun, orangutan, gorilla, insan) primat olmayan türlerde (fare, rat, tavşan, kedi, köpek) eritrosit arginaz aktivitesi tespit edilemeyecek seviyelerde (<1.0 μmol üre / g Hb / saat) bulunmuştur²⁴. Bu çalışmada ise eritrosit arginaz aktivitesini 3.22±0.60 μmol üre / g Hb / saat) olarak tespit edildi.

Yapılan taramalarda tavşan karaciğer doku arginazının kinetik özellikleri ile ilgili bir çalışmanın yapıldığı literatüre rastlanmamıştır. Bu nedenle tavşan karaciğer dokusunda arginaz enziminin kinetik özellikleri araştırılmış, tavşan karaciğer arginazının aktivasyonu için preinkübasyonun ve Mn⁺² iyonlarının gerekli olduğu saptanmıştır. Sonuç olarak elde edilen verilerin enzimin fizyolojik rolleri ile ilgili yapılacak araştırmalara ışık tutacağı kanaatine varıldı.

1) Aminlari M, Vaseghi T. Arginasedistribution in tissue of domesticanimals. Comp Biochemand Physiol B 1992; 103: 385-389.

2) Aminlari M, Shahbazkia HR, Esfandiari A. Distribution of arginase in tissues of cat (Feliscatus). J Feline Med Surg 2007; 9: 133-139.

3) Cederbaum SD, Yu H, Grody WW, et al. Arginases I and II: Do theirfunctionsoverlap? Mol Genet Metab 2004; 81: S38-44.

4) Hakovirta H, Keiski A, Toppari J, et al. Polyamines and regulation of spermatogenesis: Selective stimulation of late spermatogonia in transgenic mice over expressing the human ornithinede carboxylase gene. Mol Endocrinol 1993; 7: 1430-1436.

5) Heby O, Emanuelsson H. Role of the polyamines in germcell differentiation and in early embryonic development. Med Biol 1981; 59: 417-422.

6) Castillo L, deRojas TC, Chapman TE, et al. Splanchnic metabolism of dietary arginine in relation to nitricoxide synthesis in normal adult man. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 193-197.

7) Geyer JW, Dabich D. Rapid method for determination of arginaseactivity in tissue homogenates. Anal Biochem 1971; 39: 412-417.

8) Lowry OH, Rosenbrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurements with the folin phenol reagent. J Biol Chem 1951; 193: 265-275.

9) Erişir M, Erçel E, Yılmaz S, Ozan ST. Evaluation of optimal conditions for arginase activity in streptozotocin induced diabetic rats. Vet Med-Czech 2005; 50: 69-76.

10) Erişir M, Ozan S. Sığır rumen doku arginazının saflaştırılmasından önce ve saflaştırılmasından sonra bazı özellikleri. Turk J Vet Anim Sci 1999; 23: 597-608.

11) Spector EB, Rice SCH, Moedjono S, Bernard B, Cederbaum SD. Biochemical properties of arginase in human adult and fetal tissues. Biochem Med 1982; 28: 165-175.

12) Halifeoğlu İ. İnsan Karaciğer, Eritrosit ve Uterus Doku Arginazının Kinetik Özellikleri. Doktora Tezi, Elazığ: Fırat Ünivüniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, 1993.

13) Benzer F, Ozan ST. Fascioliosisli koyunların arginaz enzim aktivite düzeyleri ile karaciğer doku arginazının bazı biyokimyasal özellikleri. Fırat Üniv Sağ Bil Derg (Vet) 2002; 16: 217-222.

14) Altundağ Y. Bronj lavaj sıvısında arginaz enziminin özellikleri ve klinik diagnostik önemi. Uzmanlık Tezi, Edirne: Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı, 2001.

15) Kandemir MF, Özdemir N. Koyun dalak doku arginazının bazı kinetik özellikleri. Kafkas Univ Vet Fak Derg 2009; 15: 553-559.

16) Muszynska G. Immobilization of Rat Liver Arginase. In: H. Peeters (Editor). Protides of The Biological Fluids. Oxford, Newyork: Pergamon Press, 1976: 633-637.

17) Scolnick LR, Kanyo ZF, Cavalli RC, Ash DE, Christianson DW. Altering the binuclear manganes ecluster of arginase diminishes thermostability and catalytic function. Biochem 1997; 36: 10558-10565.

18) Colombo JP, Konarska L. Arginase. In: Bergmayer GM. (Editor). Methods of Enzymatic Analysis. 3rd Edition, Weinheim: Vertag Chemie 1984: 285-294.

19) Glass RD, Knox WE. Arginase isozymes of rat mammarygl and, liver, and other tissues. J Biol Chem 1973; 248: 5785- 5789.

20) Reczkowski RS, Ash DE. Rat liver arginase: Kinetic mechanism, alternate substrates, and inhibitors. Arch Biochem Biophys 1994; 312: 31-37.

21) Soler G, Mataix FJ, Ruiz-Amil M. Physico-chemical properties of Guinea Pig liver arginase. Rev Esp Fisiol 1981; 37: 37-44.

22) Lisowska-Myjak B, Tomaszewski L, Kraszewska- Domańska B. Intestinal arginase in the phylogenetic development of animals. Pol Arch Weter 1987; 25: 283-296.

23) Yasuda N, Moriwaki K, Furuyama S. Distribution andproperties of arginase in the salivary glands of four species of laboratory mammals. J Comp Physiol B. 2004; 174: 237-242.

24) Spector EB, Rice SC, Kern RM, Hendrickson R, Cederbaum SD. Comparison of arginase activity in red blood cells of lower mammals, primates, and man: Evolution to high activity in primates. Am J Hum Genet 1985; 37: 1138-1145.