Kangal Köpeği Spermasının Ticari Sulandırıcı (CaniPlus Freeze) Kullanılarak Dondurulması

Günümüzde köpek spermasının kısa süreli ya da dondurularak uzun süreli saklanması amacıyla sperma sulandırıcısı olarak çeşitli solüsyonlar kullanılmaktadır. Bu çalışmada Kangal köpeği spermasının CaniPlus Freeze sulandırıcısı kullanılarak dondurulabilirliğinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla ırka ait fenotipik özellikleri taşıyan iki adet Kangal köpeğinden masaj yöntemi ile alınan toplam 32 ejekülat sperma kullanılmıştır. Dondurma işlemi için birleştirme (pooling) sonrası sperma iki eşit kısma bölünerek birinci kısım Tris solüsyonu ile ikinci kısım ise CaniPlus Freeze sulandırıcısı ile sulandırılmıştır. Payetlere çekilen spermalar buzdolabına (+4 ⁰C) yerleştirilmiş ve 1.5 saat ekilibrasyona bırakılmıştır. Ekilibrasyon süresi sonunda payetler, sıvı azot seviyesinden 4 cm yükseklikte (-120 ⁰C) 20 dakikada dondurulmuş ve buradan sıvı azota daldırılarak saklanmıştır. Dondurma işleminden sonra spermaların bulunduğu payetler 38 ⁰C’deki su banyosunda 30 saniyede çözdürülmüş ve spermatolojik muayeneye tabi tutulmuştur. Çalışmada çözüm sonu motilite oranları kontrol ve CaniPlus Freeze grubunda sırasıyla %45 ve %50 olarak belirlenmiştir (P>0.05). Anormal spermatozoon oranı ise kontrol grubunda %18.8 iken CaniPlus Freeze grubunda %16.4 olarak tespit edilmiştir (P>0.05). Sonuç olarak araştırmacıların yanı sıra özellikle klinisyen veteriner hekimlerin köpeklerde ticari sulandırıcıları kullanmasının sperma saklama çalışmalarında pratik fayda sağlayacağı kanısına varılmıştır.

Various solutions are used as sperm extenders in order to keep dog spermatozoa for a short time or for freezing for a long time. In our study, it was aimed to determine the effect of commercial diluent on freezing-thawing spermatological parameters in freezing of Kangal dog sperm. For this purpose, a total of 32 ejaculates were taken from two Kangal dogs by massage method. After freezing, the semen was divided into two equal portions and the first portion was diluted with Tris solution and the second portion was diluted with CaniPlus Freeze diluent. spermatozoa were placed in the refrigerator (+4 ⁰C) and left for 1.5 hours. At the end of the equilibration period, the straws were frozen for 20 minutes at a height of 4 cm (-120 ⁰C) from the level of liquid nitrogen and stored therein by immersion into liquid nitrogen. After freezing, the semens were thawed at 38 ⁰C for 30 seconds and subjected to spermatological examination. In the study, the resulting motility ratios were 45% and 50%, respectively in the control and CaniPlus Freeze groups (P>0.05). Abnormal spermatozoon ratio was found to be 18.8% in control group and 16.4% in CaniPlus Freeze group (P>0.05). As a result, in addition to researchers, we are particularly considering that the use of commercial diluents by clinician veterinarians in dogs will be of practical benefit in semen storage studies.

Giriş

Türk çoban köpeği Kangal (Karabaş), dünyanın en eski ve en yaygın doğal çoban köpeği ırkıdır. Fakat gerek evcilleştirmenin etkisi gerekse bilinçsiz, kontrolsüz çiftleştirmeler sebebiyle sahip olduğu üstün özelikler açısından risk altındadır. Ayrıca venereal hastalıklar, damızlık köpekler için sürekli tehdit oluşturmaktadır [1]. Köpek yetiştiriciliğinde venereal hastalıklarının önlenmesi, genetik yapılarının iyileştirilmesi, üstün damızlık niteliklere sahip köpeklerden en yüksek ölçüde yararlanılabilmesi ve gen kaynaklarının korunması büyük önem taşır. Bu noktada biyoteknolojik bir yöntem olan suni tohumlama uygulaması ön plana çıkmaktadır [2]. Suni tohumlama ile kontrolsüz çiftleşmelerin önüne geçilmesinin yanı sıra erkek ya da dişi köpeklerdeki fizyolojik ve psikolojik kaynaklı çiftleşme sorunlarına çözüm sağlanabilmektedir [3-5]. Fakat bu uygulamanın ön şartı dişiye transfere hazır spermanın bulundurulmasıdır. Köpek sperması, alınmasını takiben hemen kullanılacaksa herhangi bir işleme gerek duymamaktadır. Ancak kısa ya da uzun süreli saklanması ve nakledilmesi gerekli ise canlılığını koruyabilmesi için bazı işlemlere tabi tutulmak zorundadır. Spermanın uzun süre canlılığını koruyabilmesi dondurulması (kriyoprezervasyon) ile mümkündür. Başarılı bir kriyoprezervasyon, doğru vericinin seçilmesi, spermanın uygun yöntemle alınması, fertilizasyon yeteneğini kaybetmeden korunabilmesi için uygun sulandırıcılarla işlenmesi ve doğru metotla dondurulmasına bağlıdır [6,7]. Köpeklerde dondurulmuş sperma ile yapılan suni tohumlama sonrası ilk canlı yavru 1954 yılında elde edilmiştir [8]. Bu tarihten günümüze kadar pek çok araştırmacı [4,9,10] suni tohumlama uygulamalarında başarılı sonuçlar kaydetmiştir. Günümüzde başta Amerika Birleşik Devletleri olmak üzere Kanada ve pek çok Avrupa ülkesinde köpek spermasının dondurulması endüstri haline gelmiştir.

Köpeklerde suni tohumlama amacıyla taze sperma ya da dondurulmuş sperma kullanılabilmektedir. Dondurulmuş sperma suni tohumlama uygulamalarında yaygın olarak kullanılmasına rağmen, taze sperma ile yapılan tohumlamalardaki başarı şansı daha yüksektir. Bu sebeple fertilite oranlarının yükseltilmesi yönünde çalışmalar devam etmektedir [11].

Köpeklerde suni tohumlama uygulamasının başarılı olabilmesi için uygun şekilde dondurulmuş spermanın kullanılması şarttır. Spermanın dondurulması işleminde ise pek çok faktör başarıyı etkilemektedir. Bu faktörleri sulandırıcı seçimi, spermatozoon yoğunluğu, kryoprotektif ajanlar, dondurma ve çözme yöntemi olarak sıralamak mümkündür [12].

Günümüzde köpek spermasının kısa süreli ya da dondurularak uzun süreli saklanması amacıyla sperma sulandırıcısı olarak çeşitli solüsyonlar kullanılmaktadır. Bunlar Tes (N-Tris [hydroxymethyl] methyll-2 aminomethene solfonic acid), Hepes (N-2 [hydroxymethyl] piperazine-n-2-ethane sulfonic acid) ve Pipes (piperazine-N, N-bis -2-ethane sulfonic acid) gibi tampon solüsyonlar olarak sıralanabilir. Son yıllarda hazır ticari preparatlar da (Laiciphos, Biociphos, Biladyl, Triladyl, CaniPlus Freeze) köpek spermasının dondurulmasında ön plana çıkmaktadır [12]. Ancak Kangal köpeği spermasının, Tris bazlı sulandırıcı ile dondurulma verileri literatürde yer almasına rağmen, ticari sulandırıcı kullanımı verilerine rastlanılmamıştır [13].

Bu çalışma ile kangal köpeği spermasının dondurulmasında ticari sulandırıcılardan olan CaniPlus Freeze kullanımının dondurma-çözdürme sonrası spermatolojik parametrelere etkisinin ortaya koyulması amaçlanmıştır.

Gereç ve Yöntem

Çalışmadaki hayvan muayene ve denemeleri Cumhuriyet Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu’nun 19.02.2015 tarihli ve 8 sayılı kararı doğrultusunda yürütülmüştür. Çalışmanın hayvan materyali 3-5 yaş arası Kangal ırkı erkek köpekler arasından seçilmiştir. Sağlıklı ve ırka ait fenotipik özellikleri taşıyan iki adet köpek deneye dâhil edilmiştir. Çalışma için seçilen köpekler aynı bakım besleme şartlarına tabi tutulmuştur.

Spermanın Alınması: Çalışmada kullanılan hayvanlardan sperma elde edilmesi için penis masajı (onani) yöntemi uygulanmıştır [14]. Bu yönteme alıştırma için köpeklerden hayvan hastanesinde özel olarak ayrılan muayene salonunda, östrus periyodunda bulunan dişi köpek ile seksüel stimulasyon sağlanarak, Eylül-Ekim ayları arasında, üç gün ara ile haftada iki kez sperma alınmıştır. Ejakulatın sadece spermatozoadan zengin olan ikinci fraksiyonu renk ve kıvam değişikleri gözlenip diğer fraksiyonlardan ayrılarak toplama kadehine alınmıştır. Bu şekilde en az bir ay süreyle yönteme alıştırılan köpeklerden daha sonra çalışma için aynı sıklıkta sperma alınmaya devam edilmiştir. Çalışmada sekiz hafta süreyle her köpekten 16’şar olmak üzere toplamda 32 ejekulat kullanılmıştır.

Spermatolojik Muayene: Çalışmada spermalar hem dondurma öncesinde hem çözdürme sonrasında muayene edilmiştir. Nativ sperma miktarı dereceli toplama kadehinden okunarak saptandı. Spermatozoa motilitesi ısıtma tablası üzerindeki lama 1 damla damlatılan sperma üzerine lamel kapatılması ve 40x büyütmede 3 farklı alanda gözlenen motil spermatozoonların ortalama yüzdeleri alınarak hesaplanmıştır. Spermatozoa yoğunluğu ise hemositometrik yöntemle thoma lamında sayım yapılarak tespit edilmiştir. Anormal spermatozoa oranı giemsa boyama yöntemi ile, ölü spermatozoa oranı ise eosin-nigrosin boyama yöntemi ile tespit edilmiştir. Spermanın pH değeri indikatör kağıda damlatılan spermanın renk skalasındaki karşılığı okunarak belirlenmiştir. Çözdürme sonrası muayenesinde ise miktar dışındaki parametreler yukarıda belirtilen metotlarla değerlendirilmiştir.

Spermaların Dondurulması: Elde edilen spermalardan en az %80 motilite ve en fazla %10 anormal oranına sahip olanlar dondurulma işlemine alınmıştır. Dondurma işlemi için birleştirme (pooling) sonrası sperma iki eşit kısma bölünerek birinci kısım Tris (T-1378 Sigma) solüsyonu ile ikinci kısım ise CaniPlus Freeze (13700 Minitube) sulandırıcısı ile sulandırılmıştır. Her iki gruba ait örnekler bir payette 200x106 motil spermatozoa bulunacak şekilde dozlanarak payetlere çekilmiştir.

Kontrol grubunda sulandırıcı olarak Tris sulandırıcısı %20 oranında yumurta sarısı, %3 gliserol ile kombine edilmiştir. Deneme grubunda ise CaniPlus Freeze solüsyonuna üretici firma talimatları doğrultusunda yalnızca %25 oranında yumurta sarısı ilave edilmiştir (Tablo 1).

Spermalar sulandırıldıktan hemen sonra 0.5 mL’lik payetlere çekilip açık olan uçları ısı yardımıyla kapatılmıştır. Sonrasında buzdolabına (+4 ⁰C) yerleştirilmiş ve 1,5 saat ekilibrasyona bırakılmıştır. Ekilibrasyon süresi sonunda payetler, sıvı azot seviyesinden 4 cm yükseklikte (–120 ⁰C) 20 dakikada dondurulmuş ve buradan sıvı azota daldırılarak saklanmıştır. Dondurma işleminden 1 hafta sonra spermaların bulunduğu payetler 38 ⁰C’deki su banyosunda 30 saniyede çözdürülmüş ve spermatolojik muayeneye tabi tutulmuştur.

Çalışmada elde edilen bulguların istatistiksel analizi için SPSS paket programı (SPSS for Windows v. 11.5) kullanılmıştır. Bağımsız değişkenlerde sonuçlar ortalama ± standart sapma kullanılarak Student t-test yöntemi ile değerlendirildi.

Bulgular

Nativ Sperma Bulguları: Köpeklerden sekiz hafta boyunca masaj yöntemiyle sperma alınmış uygulama başına ortalama 2.91 mL ejekulat (ikinci fraksiyon) hacmi elde edilmiştir. Köpeklerden alınan nativ spermaların ortalama motilite oranı %87.5 olarak saptanmıştır. Köpekler arasında önemli fark olmamakla birlikte spermatozoon konsantrasyonu ortalama 291.35x106 /mL olarak tespit edilmiştir. Nativ spermada tespit edilen spermatolojik parametreler Tablo 2’de sunulmuştur.

Kriyoprezervasyon Bulguları: Çalışmada fenotipik olarak ırk özelliklerini yansıtan 2 adet Kangal köpeğine ait toplam 128 doz (0.5 mL’lik) sperma dondurulmuştur. Çalışmada çözüm sonu motilite oranları kontrol ve CaniPlus Freeze grubunda sırasıyla %45 ve %50 olarak belirlenmiştir. Çözüm sonu anormal spermatozoon oranı ise kontrol grubunda %18.8 iken CaniPlus Freeze grubunda %16.4 olarak tespit edilmiştir. Çözüm sonrası motilite ve anormal spermatozoon oranı açısından gruplar arasında istatistiksel açıdan önemli bir fark ortaya çıkmamıştır (P>0.05). Çalışmada sulandırma sonrası ve çözdürme sonu belirlenen spermatolojik parametreler Tablo 3’te sunulmuştur.

Tartışma

Köpeklerde spermanın uygun solüsyonlarla sulandırılarak dondurulması ve gerektiğinde suni tohumlama için kullanılmasına yönelik araştırmalar uzun yıllardan beri sürdürülmektedir. Dondurma işlemi spermatozoonlar üzerinde birçok olumsuz etkiye yol açabilmektedir. Bunlardan biri de membran bütünlüğünün bozulmasıdır. Spermatozoondaki membran yapıları, donma/çözünme işlemine karşı son derece duyarlıdır. Membran yapıları akıcı mozaik tarzında düzenlenmiş protein, glikoprotein ve glikolipitlerle bezeli iki sıralı fosfolipit katmanından oluşmuştur. Bu yapıların soğutulup-çözündürülmeleri irreverzibil faz değişimine, sıvı fazdan jel fazına geçmesine neden olmaktadır [16,17]. Gelişen faz değişimi membran içi enzimlerinin kinetiğinde değişime yol açarak spermanın çözüm sonu canlılığını azaltmaktadır. Bu değişimler sebebiyle hücrede soğuk şoku gelişmekte, bu durum terminolojide soğutma zararı (cryoinjury) olarak adlandırılmaktadır. Kriyopreservasyonda soğuk soku hasarının yanı sıra spermatozoayı pH değişimleri ve oksidatif strese karşı koruyacak, metabolit ve enerji ihtiyacını karşılayabilecek niteliklerde çeşitli sulandırıcılar kullanılmaktadır [18]. Köpek spermasının dondurulmasında Tris bazlı klasik sulandırıcıların yanı sıra son yıllarda hazır ticari solüsyonlar (Laiciphos, Biociphos, CaniFreeze, CaniPlus Freeze) ön plana çıkmaktadır [8,12,19]. Silva ve Verstegen [12], laiciphos, biociphos ve tes / tris’ten oluşan üç farklı sulandıcı ile dondurdukları köpek spermalarının çözdürme sonrası spermatozoa motilitesini laiciphos, biociphos ve Tes/Tris için sırasıyla %65, 70 ve 50 canlı spermatozoa oranını ise %78, 80 ve 65 saptadıklarını bildirmişlerdir. Pipes, Bes, Tes ve Tris sulandırıcılarının köpek spermasının dondurulması üzerine etkilerini inceleyen Smith [20] ise, 1:2 oranında %50 Pipes/KOH + %25 sodyum sitrat + %25 dekstroz + %20 yumurta sarısı + %9 gliserol ile çözdürme sonrası en iyi spermatozoa motilitesi elde etmiştir. Blesbois ve Caffin [21], sulandırıcıya membran stabilizatörü olarak bovine serum albumini (BSA) eklenmesinin spermatozoa üzerine olumlu etkisi olduğunu bildirmişlerdir. Yu [22], köpek spermasının dondurulmasında glucose-TRIS ile gliserol-TRIS sulandırıcılarını karşılaştırmış ve sırasıyla (%42 ve %41) çözüm sonu motilite oranlarına ulaşmıştır.

Literatür [23] verileri incelendiğinde kangal köpekleri için nativ sperma bulguları çalışmamızla benzerlik göstermektedir. Dondurma çözdürme sonrası spermatolojik bulgular açısından kangal köpekleri için ticari sulandırıcı verisi bulunmamakla birlikte Alman çoban köpeği için laiciphos sulandıcısı ile 34.0±9.8 çözüm sonu motilite oranı elde edilmiştir [9]. Diğer bir çalışmada [12] ise Beagle ırkı köpeklerde laiciphos sulandıcısı ile %65 çözüm sonu motilite oranına ulaşmıştır.

Yapılan araştırmalarla [9,12,23] sunulan çalışmada elde edilen sonuçlar arasındaki farklılıklar çeşitli etmenlere bağlı olarak şekillenmiş olabilir. Özellikle kullanılan hayvanların bakım besleme ve özellikle ırk farklılıkları, sulandırıcı kompozisyonları ve dondurma çözdürme prosedürlerindeki farklılıklar spermatolojik parametrelere etki etmektedir. Aynı ırka ait köpeklerde de bireysel olarak spermanın sulandırıcılara farklı tepkiler verebileceği bildirilmektedir [9].

Literatür verilerinde görüldüğü üzere yürütülen çalışmalara rağmen köpek spermasının dondurulmasında %60’lara varan çözüm sonu motilite oranlarına ulaşılabilmiş fakat standart bir dondurma protokolü henüz oluşturulamamıştır. Bu noktada köpek türünün fazla sayıda ırk barındırması ve yöntemlere farklı yanıtlar alınması da standardizasyon çalışmalarının önünde engel teşkil etmektedir. Bu sebeple gerek dondurma tekniği ve ekipmanlarının, gerekse sulandırıcıların geliştirilmesine yönelik çalışmalar devam etmektedir [9,19,24,25].

Spermanın dondurulması için farklı sulandırıcılar söz konusu olmakla birlikte, sulandırıcı hazırlama işlemi uygulayıcılara iş yükü getirmektedir. Bunun yanı sıra ölçüm tartım hataları, kontaminasyon riskleri ve birden fazla kimyasal maddeyi hazır bulundurma zorunluluğu oluşturmaktadır. Çalışmamızda kangal köpeklerinin spermalarının dondurmasında sulandırıcı hazırlama aşamasını ve buna bağlı riskleri azaltabilecek CaniPlus Freeze sulandırıcısının kullanımının klasik sulandırıcılarla benzer başarı oranları sağladığı gözlenmiştir.

Sonuç olarak, CaniPlus Freeze adlı ticari sulandırıcının Kangal köpeği spermasının dondurulmasında rahatlıkla kullanılabileceği kanaatine varılmıştır.

Teşekkür
Çalışmanın planlanması ve verilerin istatistiksel açıdan değerlendirilmesindeki katkılarından dolayı Doç.Dr. Barış Atalay USLU’ya teşekkür ederim.

References

1. Mamak N. Sivas Yöresindeki Kangal Köpeği Üretim Çiftliklerinde Bulunan Köpeklerde Bazı Enfeksiyöz ve Paraziter Hastalıkların (Leptospirozis, Listeriozis, Dirofilariazis, Barsak Parazitleri) Araştırılması ve Sağaltımı. Doktora Tezi, Ankara: Ankara Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, 2002.
2. Hiemstra SJ. “Guidelines for the constiution of national cryopreservation programmes for farm animals”. http://www.agris.fao.org/ 05.01.2018.
3. Stockner PK. Status of the canine frozen semen industry. Modern Veterinary Practice 1985; 66: 98-100.
4. Concannon PW, Battista M. Current Veterinary Therapy. 1st Edition, Philadelphia: WB Saunders, 1989.
5. Tekin N. Hayvan yetiştiriciliğinde reprodüktif biyotekniklerin önemi ve yeri. Veteriner Hekimliği Dergisi 2007; 78: 15-17.
6. Hunter FRH. Physiology and Technology of Reproduction in Female Domestic Animals. 1st Edition, Edinburgh: Academic Press, 1980.
7. Linde-Forsberg C. Artificial insemination with fresh, chilled extended, and frozen-thawed semen in the dog. Seminars in veterinary medicine and surgery (small animal). 1995; 10: 48-58.
8. England GC. Cryopreservation of dog semen: A review. J Reprod Fertil Supp 1992; 47: 243-255.
9. Uysal O, Varish O, Tosun H, Yavas I, Gurcan I. Cryopreservation of canine semen at different freezing and thawing programmes. Indian Vet J 2007; 84: 57-59.
10. Watson PF. Artificial insemination and the preservation of semen. Marshall’s Physiology of Reproduction 1990; 2: 747-869.
11. Linde-Forsberg C, Forsberg M. Fertility in dogs in relation to semen quality and the time and site of insemination with fresh and frozen semen. J Reprod Fertil 1989; 299-310.
12. Silva LDM, Verstegen JP. Comparisons between three different extenders for canine intrauterine insemination with frozen-thawed spermatozoa. Theriogenology 1995; 44: 571-579.
13. Gungor S, Bucak MN. Basal medium eagle solution may improve the post-thaw parameters of Kangal dog semen. Eurasian Journal of Veterinary Sciences 2016; 32: 193-199.
14. Tekin N, İzgür H, Özyurt M. Köpeklerde penis masajı yöntemiyle sperma alma ve başlıca spermatolojik özellikler üzerinde araştırmalar. Selçuk Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi 1987; 1: 83-95.
15. Tekin N. Spermanın muayenesi ve değerlendirilmesi. In: Alaçam E. (Editor). Evcil Hayvanlarda Reprodüksiyon, Sun’i Tohumlama, Doğum ve İnfertilite. 1st Baskı, Konya: Dizgievi, 1994: 69-70.
16. Watson PF. Recent developments and concepts in the cryopreservation of spermatozoa and the assessment of their post-thawing function. Reprod Fertil Dev 1995; 7: 871-891.
17. Watson PF. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Anim Reprod Sci 2000; 60: 481-492.
18. Holt WT. Fundemental aspects of sperm cryobiology: The importance of species and individual differences. Theriogenology 2000; 53: 47-58.
19. Hermansson U, Forsberg CL. Freezing of stored, chilled dog spermatozoa Theriogenology 2006; 65: 584-593.
20. Smith FO. Cryopreservation of canine semen. Tecnique and performance. Diss Abstr Int B-Sci 1985; 11: 3441.
21. Blesbois E, Caffin JP. Serum like’ albumin of fowl seminal plasma and effects of albumin on fowl spermatozoa stored at 4 ⁰C. Brh Poult Sci 1992; 33: 663-670.
22. Yu I. Canine sperm cryopreservation using glucose in glycerol-free tris. CryoLetters 2014; 35: 101-107.
23. Akçay E, Tekin N. Andrological examinations of Kangal sheepdogs (Karabash). Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences 2002; 26: 965-973.
24. Brito MM, Lúcio CF. Angrimani DS, et al. Comparison of cryopreservation protocols (Single and Two-steps) and thawing (Fast and Slow) for canine sperm. Anim Biotechnol 2017; 28: 67-73.
25. Baran A. Köpek Spermasının Farklı Oranlarda Gliserol İçeren Sulandırıcılarda Dondurulması. Doktora Tezi, İstanbul: İstanbul Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, 1997.