Atık Sığır Fetuslarında Chlamydophila abortus' un Mikrobiyolojik Kültür ve PZR ile Saptanması

Bu çalışmada abort yapan 47 sığıra ait fetusun doku örnekleri Chlamydophila abortus yönünden polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ve mikrobiyolojik kültür yöntemleriyle incelendi. 47 fetusun 3'ünde C.abortus DNA'sı saptandı. PZR pozitif örneklerin tümü kültür pozitifti.

In the present study, tissue samples from 47 aborted bovine fetuses were analysed to detect the presence of Chlamydophila abortus by polymerase chain reaction and microbiological culture. Chlamydophila abortus DNA was detected in 3 of 47 aborted bovine fetuses by PCR. All of PCR positive samples were culture positive.

Giriş

Chlamydialar kuşlar, memeliler ve insanlarda çeşitli hastalıklara neden olan zorunlu, hücre içi mikroorganizmalardır. Son yıllarda yapılan sınflandırmada, Chlamydiaceae familyası içerisinde Chlamydia ve Chlamydophila olmak üzere iki cins yer almaktadır. Chlamydophila cinsinde yer alan Chlamydophila abortus (C.abortus) ve Chlamydophila pecorum (C.pecorum) türleri ruminantlarda hastalığa neden olur[1]. Sığırlarda chlamydial enfeksiyon abort, endometritis, vaginitis gibi reprodüktif bozukluklar meydana getirir[2,3].

Abort yapan hayvanlarda infeksiyöz elementer cisimcikler süt, dışkı, nasal ve oküler akıntılarla etrafa bulaşır. C.abortus aynı zamanda infertiliteye ya da embriyonik ölüme yol açmasının yanı sıra semen ile de nakledilir[4,5]. Ayrıca yabani hayvanlar da bu organizmanın rezervuarı olarak hastalığın yayılmasına ve çevrenin kontaminasyonuna yol açar[6,7]. Gebe olmayan hayvanlarda organizma gebeliğin başlangıcına kadar lenfoid dokuda latent formda bulunur Ancak abort oluncaya kadar enfeksiyon serolojik olarak yada patojenin direk tespiti yoluyla teşhis edilemez[8,9].

C abortus doku kültürü, embriyolu tavuk yumurtası ve laboratuvar hayvanlarında üretilebilmektedir. Plasenta, fetal organlar, vaginal akıntı ve semen gibi biyolojik örneklerde C.abortus’u identifiye etmek için farklı teşhis yöntemleri kullanılabilir. Bu yöntemler embriyolu tavuk yumurtası, McCoy, VERO, ve L929gibi sürekli hücre kültürü, protein tespiti (direk immunofluorescence, immunhistokimya ve ELISA ) ve nükleik asit tespiti (polimeraz zincir reaksiyonu) gibi teknikleri kapsar[10-13]. İnfekte hayvanları tespit etmede en kolay metotlar; immunofloresan, ELISA ve komplement fikzasyon testleridir. Bu metotların spesifite ve sensitiviteleri farklı olmakla birlikte serolojik teşhiste komplement fikzasyon test yaygın olarak kullanılmaktadır[14-15]. Son zamanlarda Polimeraz Zincir Reaksiyonu-Restriksiyon Fragment Length Polimorfizm (PZR-RFLP) ve omp A gen sekanslama yöntemleri kullanılmaktadır. Fakat bunların yapılması için emek, zaman ve özel laboratuarlar gereklidir[16]. PZR gibi moleküler yöntemlerin spesifite ve sensitiviteleri yüksektir[17,18].

Bu çalışmada atık sığır fetuslarında hayvan yetiştiriciliği sektöründe ekonomik olarak önemli olan Chlamydiosis hastalığının teşhisinde kültüre alternatif olarak PZR metodunun kullanılması amaçlanmıştır.

Gereç ve Yöntem

Çalışmanın materyalini 2009-2010 yılları arasında Elazığ merkez ve köylerinden toplanan ve Elazığ Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü’ne getirilen toplam 47 adet atık sığır fetusu oluşturdu. Fetusun doku örnekleri (karaciğer, akciğer), kotiledonlar, plasental membranlar alınarak streptomycin (200 μg/ml) içeren nutrient broth içerisinde doku homojenatları hazırlandı.

Bu homojenattan 0,2 ml alınarak 6-8 günlük embriyolu yumurtaların sarı keselerine ekildi[19]. Ekim yapılan yumurtalar 37°C’lik etüve bırakıldı. Ekimden sonra enfeksiyona bağlı olarak embriyolar 4. günden sonra ölmeye başladı[19]. Ölen embriyoların yumurta sarıları alınarak DNA ekstraksiyonu için kullanıldı[20]. Embriyo ölümlerin görülmediği durumda iki kez kör pasaj yapıldı. Etken identifikasyonu için embriyolu yumurtaların sarı kesesi zarlarından preparat hazırlanarak stamp boyama ile boyandı. Elementer cisimcikler görülen örneklerden elde edilen DNA’lar PZR ile identifiye edildi.

C. abortus DNA’sının PZR ile tespiti: Embriyo ölümlerinin görüldüğü yumurtların sarı keseleri DNA ekstraksiyonu için kullanıldı. Doku ekstraksiyon kitinde (QIAmp DNA mini Kit (Qıagen) belirtildiği şekilde DNA izole edildi. DNA ekstraksiyonu için yumurta sarı kesesi sıvısından 200 μl alınarak enzim solüsyonu içinde ( 20 mg lysozyme, 20 mM Tris-HCL (ph 8.0), 2mM EDTA ve 1.2 % Triton) 37°C‘ de 1 saat inkube edildi. Sonra 25 μl Proteinaz K ve 200 μl buffer AL (Qiagen) ilave edildi. Daha sonra ise ilk önce 56°C’de 30 dak ve 70º C’de 10 dak inkube edildi. DNA’ya 200 μl elution buffer ilave edilerek -20°C de donduruldu. Bu süspansiyondan 5 μl alınarak PZR’de hedef DNA olarak kullanıldı. Negatif kontrol olarak inokülasyon yapılmayan tavuk yumurtlarından ekstrakte edilen DNA’lar kullanıldı.

Toplam 50 μl’lik volümde hazırlanan PZR karışımı 5μl 10xPZR buffer (100 mM Tris-HCl, pH 9.0, 500mM KCl, 15mM MgCl2, %1 Triton X-100), deoksinükleotid trifosfatların her birinden 250 μM, 2U Taq DNA polymerase enzimi (Fermentas), 40 pmol her bir primer 8 FP: 5’-TGG TAT TCT TGC CGA TGA C-3’; RP: 5’-GAT CGT AAC TGC TTA ATA AAC CG-3’[21] ve 5 μl hedef DNA içermektedir. PZR Reaksiyonu, Touchdown Thermocycler'de (Hybaid Marka, İngiltere) gerçekleştirildi. DNA amplifikasyonu 95°C'de 5 dakika ön ısıtmayı müteakip 94°C'de 1 dakika denatürasyon, 45°C'de 1 dakika hibridizasyon ve 72°C' de 2 dakika olmak üzere 40 siklus halinde gerçekleştirildi. Son siklus 72°C'de 7 dakika olarak gerçekleştirildi. Amplifikasyon Perkin-Elmer Gene Amp PCR sistemi 2400 thermocycler’de yapıldı. Ampliconlar ise +4 ºC’de elektroforeze kadar bekletildi.

PZR'de amplifiye edilen DNA, agaroz jel elektroforez işlemine tabi tutuldu. Elektroforez tampon solüsyonu olarak Tris-Borik asit-EDTA (TBE) kullanıldı ve bir midi jel elektroforez tankında 70 voltta 1 saat süreyle elektroforez işlemi gerçekleştirildi. Elektroforezi müteakip, jel ethidium bromide (0.5 μg/ml) ile 30 dakika süreyle boyandı ve sonuçlar ultraviyole transilluminatörde değerlendirildi. PZR ürünlerinin jel elektroforezi neticesinde 479 bp uzunluğundaki bant C. abortus yönünden pozitif olarak değerlendirildi.

Bulgular

Toplam 47 adet atık sığır fetusunun incelenmesi sonucunda; embriyo ölümleri görülen 3 örneğe (% 6.3) ait yumurtaların sarı kesesi zarlarından yapılan boyamalarda elementer cisimcikler görüldü. Yumurtaların sarı keselerinden yapılan PZR testinde 479 bp uzunluğunda C.abortus DNA’sı saptandı (Şekil 1).

Tartışma

C. abortus’ un lokal olarak plasental fonksiyonları etkileyerek abort ve perinatal ölümlere yola açtığı bilinmektedir[12]. Bununla birlikte, C. abortus pozitif buzağılarda perinatal ölüm, ölü doğum ve abort oranlarının arttığı görülmekle birlikte, sığırlarda bu konudaki bilgiler azdır[22-23].

C.abortus prevalansının dünyada sığırlarda %5 ila %20 arasında olduğu bildirilmiştir[6,8,9] . Wang (2001) abort yapmış ineklerde PZR ile C.abortus’u %34,9, PZR pozitif olan örneklerin daha sonra embriyolu tavuk yumurtasına yapmış olduğu ekimlerde %33,3, fetusta ise %8,3’lük bir oranda tespit etmiştir[24]. Borel ve ark. (2006) ıntergenic spacer (IGS-S) PZR ile 235 vakanın 12’sinde pozitif (%5,1)’ lik bulmuştur[25]. Godin ve ark (2008) yaptıkları çalışmada reprodüktif problemi olan 70 sürüde yapılan çalışmada 525 ineğin iki tanesini C.abortus yönünden seropozitif olarak bulmuş, seropozitif olanlar real time PZR ‘a tabi tutulduğunda ise Chlamydiaceae 12 kontrol ineğin sadece 2 adet sıvabında bulunmuştur[26]. Berri (2009) abort problemi olan ruminant sürülerinden alınan 67 kliniksel örneğin 16 (% 24)’sında (13 vagial sıvab, 3 plasenta) C. abortus’u multiplex PZR ile pozitif bulmuştur (Berri, 2009)[27].

Sığırlarda C.abortus’un neden olduğu abortlar konusunda Türkiye’de yapılmış olan serolojik çalışmalar mevcut olmakla birlikte sınırlı düzeydedir. Gökçe ve ark. (2007) Kars yöresinde C.abortus yönünden abort yapmış sığırlardan alınan kan serumlarında ELISA ile % 8,33 (16/192) oranında pozitiflik saptamıştır (Gökçe, 2007)[28]. Aynı araştırmacı sığırlarda C.abortus seroprevalansının % 4.76 ile 12.67 arasında değiştiğini bildirmiştir. Bu çalışma Elazığ ve yöresinde abort yapmış sığırlardan alınan doku örneği materyallerinde C.abortus varlığının PZR yöntemi ile araştırılmasına yönelik tek çalışmadır. Bu çalışma %6,3’lük oranda C.abortus’un neden olduğu sığır abort vakası olduğunu göstermiştir. Bu çalışmada elde ettiğimiz %6,3’lük pozitiflik oran yapılan diğer çalışmalarla paralel değerde bulunmuştur.

Chlamydia enfeksiyonlarının prevalansındaki artışın; sığırların bu enfeksiyona karşı antikor taşımaları, endometritis, fertilite problemleri ve epizootik sığır abort hastalıklarının artması ile bağlantılı olduğu açıklanmıştır[24,29-31]. Rutin teşhiste PZR gibi moleküler yöntemlerin kullanılması ile hastalığın tespit edilme oranı artmıştır[4,18]. Chlamydialarda dıştaki zar proteini (MOMP gene), CTU ve CHOMP 371 primerleri ile çoğaltılırken, CPI ve PSI primerlerinin gendeki bölgelerin birisinden seçilmiş olduğu bildirilmiştir. Clone 8 primerleri MOMP primerlerinden daha yüksek duyarlılığa sahip olduğu bildirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan clone 8 primerleri ile başarılı bir şekilde hedef DNA ‘nın izolasyonu yapılarak 479 bp’lik ürün elde edilmiştir[21]. Bu durum chlamydial genomda helicase geninin birçok kopyasının olmasıyla açıklanmıştır.

Bu çalışmada toplam 47 kliniksel örneğin 3’ünde PZR ile C.abortus etkeni için pozitiflik elde edilmiş olup, bulunan %6,3 lik oran bu yörede C.abortus’un neden olduğu sığır enzootik abortusunun varlığını göstermekle birlikte, abort olayları ile mücadelede C.abortus üzerinde durulması, yine prevalans ve insidens saptanmasına yönelik olarak çalışmaların yapılmasında fayda görülmektedir. Ayrıca bu çalışmada PZR ve kültür sonuçlarının aynı olması, PZR’nin kültüre paralel olarak kulanılabileceğini göstermektedir.

References

1. Everett KDE. Chlamydia and Chlamydiales: more than meets the eye. Vet Microbiol 2000; 75: 109-126.
2. Storz J. Overview of animal diseases induced by chlamydial infections. In Microbiology of Chlamydia Edited by: Barron AL, Florida: CRC Press Inc 1988; 167-192.
3. Wehrend A, Failing K, Hauser B, Jager C, Bostedt H. Production, reproductive, and metabolic factors associated with chlamydial seropositivity and reproductive tract antigens in dairy herds with fertility disorders. Theriogenology 2005; 63: 923-930.
4. Jee J, DeGraves FJ, Kim TY, Kaltenboeck B. High prevalance of natural Chlamydophila species infection in calves. J Clin Microbiol 2004; 42: 5664-5672.
5. Ongor H, Cetinkaya B, Acik MN, Karahan M, Bulut H. Detection of Chlamydophila abortus in ovine milk by immunomagnetic separation-polymerase chain reaction. Vet Med B Infect Dis Vet Public Health 2004; 51: 43-45.
6. Berri M, Bernard F, Lecu A, Ollivet-Courtois F, Rodolakis A. Molecular characterizations and ovine livevaccine 1B evaluation toward a Chlamydophila abortus strain isolated from springbok antelope abortion. Vet Microbiol 2004; 103: 231-240.
7. Hotzel H, Berndt A, Melzer F, Sachse K. Occurrence of Chlamydiaceae spp. in a wild boar (Sus scrofa L.) population in Thuringia (Germany). Vet Microbiol 2004; 103: 121-126.
8. Da Silva FG, De Freitas JC, Muller EE. Chlamydophila abortus in production animals. CiencRural 2006; 36: 342-
9. Entrican G. Immune regulation during pregnancy and hostpathogen interactions in infectious abortion. J Comp Pathol 2002; 126: 79-94.
10. Storz J, Carroll EJ, Ball L, Faulkner LC. Isolation of a psittacosis agent (Chlamydia) from semen and epididymis of bulls with seminal vesiculitis syndrome. Am J Vet Res 1968; 29: 549-555.
11. Dagnal GJR, Wilsmore AJ. A simple staining method for the identification of Chlamydial elementary bodies in the fetal membranes of sheep affected by the ovine enzootic abortion. Vet Microbiol 1990; 21: 233-239.
12. Buxton D, Barlow RM, Finlayson J, Anderson IE, Mackellar A. Observations on the pathogenesis of Chlamydia psittaci infection of pregnant sheep. J Comp Pathol 1990; 102: 221-237.
13. Laroucau K, Souriau A, Rodolakis A. Improved sensitivity of PCR for Chlamydophila using pmp genes. Vet Microbiol 2001; 82: 155-164.
14. Aitken ID. OIE Manual Vol II. (B/028) 12 nde Prony 75017 Paris, France 1990.
15. Aitken ID. Enzootic abortion of ewes (ovinechlamydiosis). In: Manual of Standards for Diagnostic Testsand Vaccines, 4th Edition, Paris, France: Office International desEpizooties, 2000b.
16. Sachse K, Grossman E. Chlamydial diseases of domestic animals-zoonotic potential of the agents and diagnostic issues. Deutsche Tierarztliche Wochenschrift 2002; 109: 142-148.
17. Berri M, Laroucau K, Rodolakis A. The detection of Coxiella burnetii from ovine genital swabs, milk and faecal samples by the use of a single touchdown polymerase chain reaction. Vet Microbiol 2000; 72: 285-293.
18. DeGraves FJ, Gao D, Hehnen HR, Schlapp T, Kaltenboeck B. Quantitative detection of Chlamydia psittaci and C.pecorum by high sensitivity real-time PCR reveals high prevalance of vaginal infection in cattle. J Clin Microbiol 2003a; 41: 1726-1729.
19. Moulder JW. Chlamydiaceae. In “Bergey’s of Manual of “Systematic Bacteriology”, Vol. I, Krieg NR, Hold JG. (Editors). Baltimore: Williams and Wilkins, 1984: 729-739.
20. McClenaghan M, Herring AJ, Aitken ID. Comparison of C.psittaci isolates by DNA restriction endonuclease analyses. Infect Immun 1984; 45: 384-389.
21. Creelan JL, McCullough SJ. Evaluation of strain specific primer sequences from an abortifacient strain of ovine Chlamydophila abortus (Chlamydia psittaci) for the detection of EAE by PCR. FEMS Microbiology Letters 2000.
22. Papp JR, Shewen PE. Pregnancy failure following vaginal infection of sheep with Chlamydia psittaci prior to breeding. Infect Immun 1996; 64: 1116-1125.
23. Longbottom D, Coulter LJ. Animal chlamydioses and zoonotic implications. J Comp Pathol 2003; 128: 217–244.
24. Wang FI, Shieh H, Liao YK. Prevalance of Chlamydophila abortus infection in domesticated ruminants in Taiwan. J Vet Med Sci 2001; 63: 1215-1220.
25. Borel N, Thoma R, Spaeni P. et al. Chlamydia-related abortions in cattle from Graubunden, Switzerland. Vet Pathol 2006; 43: 702-708.
26. Godin AC, Björkman C, Englund S, Johansson K, Niskanen R, Alenius S. Investigation of Chlamydophila spp. in dairy cows with reproductive disorders. Acta Veterinaria Scandinavica 2008.
27. Berri M, Rekiki A, Boumedine KS, Rodolakis A. Simultaneous differential detection of Chlamydophila abortus, Chlamydophila pecorum and Coxiella burnetii from aborted ruminant\'s clinical samples using multiplex PCR. BMC Microbiology, 2009; 9: 130.
28. Gökçe HI, Kaçar C, Genç O, Sözmen M. Seroprevalance of Chlamydophila abortus in aborting ewes and dairy cattle in the north-east part of Turkey. Bull Vet Inst Pulawy 2007; 51: 9-13.
29. Cavirani S, Cabassi CS, Donofrio G, De Iaco B, Taddei S, Flammini CF. Association between Chlamydia psittaci seropositivity and abortion in Italian dairy cows. Prev Vet Med 2001; 50: 145-151.
30. Domeika M, Ganusauskas A, Bassiri M, Froman G, Mardh PA. Comparison of polymerase chain reaction, direct immunofluorescence, cell culture and enzyme immunoassay for the detection of Chlamydia psittaci in bull semen. Vet Microbiol 1994; 42: 273-280.
31. Wittenbrink MM, Horchler H, Bisping W. Investigations into the incidence of Chlamydia psittaci in the genital tract and feces of female cattle. J Vet Med B 1988; 35: 237-246.