Bu çalışmanın amacı, kesim sonrası sığır karaciğerlerinden elde edilen Fasciola spp. örneklerinin morfolojik ve morfometrik analizinin yapılması ve moleküler analiz sonuçlarıyla kıyaslanmasıdır.

Erişkin Parazitlerin Morfometrik Analizi: Parazitlerin morfometrik analizi Valero ve ark.⁶'nın bildirdiği şekilde yapılmıştır. Öncelikle parazitler %70 ethanolden çıkarılıp 1X PBS içerisine konulup 37°C'deki etüvde 15 dk bekletilmiştir. Sonra bir petri içerisine konulan erişkin parazitlerin Olympus SZX12 stereo mikroskopta X7 büyütme ile Şekil 1'de gösterilen ölçümleri yapılmıştır.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: Erişkin Fasciola spp. örneklerinin morfometrik analizinde ölçümleri yapılan parametreler. KG: Koni genişliği, KU: Koni uzunluğu, VG: Vücut genişliği, VU: Vücut uzunluğu, A-KÇ: Arka uç ile karın çekmeni arası mesafe, Ö-KÇ: Ön uç ile karın çekmeni arası mesafe, AÇ-KÇ: Ağız çekmeni ile karın çekmeni arası mesafe (Valero ve ark.6'dan modifiye edilmiştir).

Moleküler Analiz
Genomik DNA İzolasyonu: Bu amaçla morfometrik ölçümleri yapılan erişkin parazitler bir lam üzerine alınıp ön 2/3'lük kısmı bir bistüri ile kesilip eppendorf tüplere konulduktan sonra en az 5 kez PBS (pH=7.4) ile yıkandı. Öncelikle bu tüplere kitte bulunan lizis buffer eklenip, 20 mg/μL proteinaz-K'dan 25 μL konulup 1 gece 56°C'de bekletildikten sonra ticari kit ile (Fermentas, Lithuania) genomik DNA izole edildi ve kullanılıncaya kadar -20°C'de saklandı. Bu işlemin başarılı olup olmadığını anlamak için bütün örneklerdeki total DNA miktarı DNA spektrofotometre ile ölçülerek yeterli gDNA olmayan örneklerden yeniden izolasyon yapıldı⁷.

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR): Fasciola spp.'nin mitokondrial sitokrom oksidaz 1 (CO1) gen bölgesi PZR ile çoğaltıldı. Toplam 50 μL'lik hacimde hazırlanan PZR karışımına 5 μL 10X PZR buffer, 5 μL 25 mM MgCL₂, deoksinükleotidlerin her birinden 250 μM, 1.25 U Taq DNA Polymeraz enzimi, primer çiftlerinin her birinden 20 pmol ve ortalama 200 ng gDNA ilave edildi. PZR amplifikasyonu 95ºC'de 5 dk ön denatürasyon aşamasını takiben, toplam 35 PZR siklusu 94ºC'de 50 sn denaturasyon, 45ºC'de 50 sn hibridizasyon, 72ºC'de 50 sn sentez olarak gerçekleştirildi ve son siklusu müteakip 72ºC'de 10 dk ekstra sentez işlemi yapıldı. Çalışmada CO1 genini çoğaltmak için JB3 (TTTTTTGGGCATCCTG AGGTTTAT) ve JB4.5 (TAAAGAAAGAACATAATGAAA ATG) adlı primerler kullanıldı. Polimeraz Zincir Reaksiyonunda elde edilen ürünler agaroz jel elektroforeze tabi tutuldu, bu amaçla %1.4'lük agaroz jel hazırlandıktan sonra, 10 μL PZR ürünü, 5 μL yükleme solüsyonu ile karıştırılarak jeldeki kuyucuklara yüklendi. Elektroforez işlemi Tris-Asetik asit-EDTA (TAE) tampon solüsyonu kullanılarak jel tankında 90 voltta 45 dk süreyle gerçekleştirildi. Daha sonra jel, ethidium bromide (10 mg/mL) ile boyanıp, UV transilluminatörde bandların varlığı yönünden incelendi. Bandların moleküler ağırlığını belirlemek için 100 bp'lik marker kullanıldı. Metod, Simsek ve ark. (7)'nın bildirdiği şekilde yürütüldü.

PZR-RFLP Analizi: Bu işlem için 10 μL PZR ürünü, 10 U restriksiyon enzimi –Alul-, 2 μL restriksiyon buffer, 0.2 μL BSA, 5.5 μL distile su olacak şekilde hazırlanan karışım üç saat boyunca 37°C'deki su banyosunda inkübe edildi. Bu sürenin sonunda %3'lük agaroz jelde yürütülüp 90 V akımda 45 dk yürütülen örnekler ethidium bromide (10 mg/mL) ile boyanıp, UV transilluminatörde bandların varlığı yönünden incelendi⁷.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: Morfometrik analizi yapılan Fasciola spp.'lerin vücut ölçüm sonuçları

İncelenen bütün örneklerdeki değerlerin ortalaması alındığında, ortalama VG 6.26 mm, KG 1.19 mm, KU 1.25 mm, VU 13.26 mm, AÇ-KÇ 0.91 mm, Ö-KÇ 2.21 mm, A-KÇ 10.73 mm olarak belirlenmiştir.

Erişkin Fasciola spp. örneklerinden elde edilen gDNA'nın mt-CO1 gen bölgesinin PZR ile çoğaltılması neticesinde bütün örneklerde 446 bp büyüklüğünde band gözlenmiştir (Şekil 2).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 2: Erişkin Fasciola spp. örneklerinin mt-CO1 gen bölgesinin PZR bulgusu (446 bp). M: Marker (100 bp).

Bu örneklerin Alul enzimiyle kesimi neticesinde 330 ve 110 bp büyüklüğünde iki band elde edilmiş olup, bu örneklerin hepsinin F.hepatica olduğu anlaşılmıştır (Şekil 3).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 3: Fasciola spp. örneklerinin AluI enzimiyle kesimi neticesinde elde edilen bandların görünümü (110 bp ve 330 bp). M: Marker (100 bp).

Sığır ve koyunlardaki Fasciola etkenlerinin büyüklükleri ile ilgili literatür bilgi çelişkilidir. Sığırlardaki Fasciola'ların koyunlardakinden daha büyük olduğuna yönelik öneriler bulunmakla birlikte kesin bir bilgi bulunmamaktadır⁹. Ancak Dixon¹⁰ koyunlardaki Fasciola etkenlerinin daha hızlı büyüdüğünü ve sığırlardakinden daha büyük ebatlara ulaştığını ifade etmiştir.

Valero ve ark.^6, koyunlardan elde ettikleri F.hepatica'ların vücut uzunluklarının sığır ve domuzlardakinden daha büyük olduğunu bildirmişlerdir. Araştırıcılar^6, sığırlardaki erişkin F.hepatica'ların ise vücut genişliklerinin koyun ve domuzlardakinden büyük olduğunu belirlemişlerdir. Benzer şekilde Akahane ve ark.¹¹ domuzlardaki karaciğer kelebeklerinin vücut genişliği ve uzunluğunun sığır ve koyunlardakinden daha küçük olduğunu bildirmişlerdir.

Valero ve ark.^6, sığırlardaki F.hepatica izolatlarında VU ortalama 19.07±3.45 mm olarak bulmuşlar ancak bizim çalışmamızda bu oran ortalama 13.26 mm olarak belirlenmiştir. Bu farklılığın erişkin parazitlerin elde edildiği konakların yaşlarıyla ilgili olabileceği düşünülmüştür. Yine adı geçen çalışmada VG ortalama 8.39±1.51 mm olarak belirlenirken bizim çalışmamızda ortalama 6.26 mm olarak belirlenmiştir. Araştırıcılar^6, KU ve KG değerlerini sırasıyla 2.11±0.31 mm ve 2.76±0.41 mm olarak belirlerlerken bu çalışmada adı geçen oranlar sırasıyla 1.25 mm ve 1.19 mm olarak hesaplanmıştır. Bahse konu araştırmada Ö-KÇ, A-KÇ ve AÇ-KÇ değerleri sırasıyla 2.27±0.28 mm, 15.81±3.19 mm ve 1.63±0.27 mm olarak belirlenirken bizim çalışmamızda bu değerler sırasıyla 2.21 mm, 10.73 mm ve 0.91 mm olarak ölçülmüştür. Genel olarak bakıldığında Valero ve ark.⁶'nın ölçüm değerleri bizim örneklerimizinkinden daha büyüktür. Bu farklılığın nedeni bizim 20 örnek kullanmamız ancak diğer çalışmada 169 örneğin kullanılması olabilir. Yine örneklerin toplandığı sığırların yaşı ve enfeksiyon süresinin de parazitlerin büyüklükleri üzerinde etkili olabileceği düşünülmüştür.

Ghavami ve ark.^12, koyunlardaki Fasciola etkenlerinin sığırlardakinden daha büyük olduğunu bunun sebebinin koyunların parazite karşı düşük direnç gösterirken sığırların orta dereceli direnç göstermeleri olabileceğini ileri sürmüşlerdir. Yine morfometrik farklılıkların enfeksiyonun yoğunluğu, konak türü, yaş ve immun yanıttan etkilenebileceğini belirtmişlerdir.

Sonuç olarak, bu çalışma ile sığırlardan elde edilen erişkin Fasciola spp. örneklerinin morfometrik analizleri yapılmış ve takiben yapılan moleküler analizlerle bu örneklerin hepsinin F.hepatica olduğu teyid edilmiştir.

1) Soulsby EJL. Helminths, Arthropods and Protozoa of Domesticated Animals. London. Bailliere Tindall, 1986.

2) Kassai T. Veterinary Helminthology. London: Butterworth Heinemann, 1999.

3) Yakhcali M, Malekzadeh-Viayeh R, Imani-Baran A, Mardani K. Morphological and molecular discrimination of Fasciola species isolated from domestic ruminants of Urmia City. Iranian Journal of Parasitology 2015; 10: 46-55.

4) Mas-Coma S, Funatsu IR, Bargues MD. Fasciola hepatica and Lymnaeid snails occurring at very high altitude in South America. Parasitology 2001; 123: 115-27.

5) Marcilla A, Bargues MD, Mas-Coma S. A PCR-RFLP assay for the distinction between Fasciola hepatica and Fasciola gigantica. Molecular and Cellular Probes 2002; 16: 327- 33.

6) Valero MA, Darce NA, Panova M, Mas-Coma S. Relationships between host species and morphometric patterns in Fasciola hepatica adults and eggs from the northern Bolivian Altiplano hyperendemic region. Veterinary Parasitology 2001; 102: 85-100.

7) Simsek S, Utuk AE, Balkaya I. Molecular differentiation of Turkey cattle isolates of Fasciola hepatica and Fasciola gigantica. Helminthologia 2011; 48: 3-7.

8) Euzeby J. Les Maladies Vermineuses des Animaux Domestiques et Leurs Incidences sur la Pathologie Hurnanine, Tome II. Maladies Dues aux Plathelminthes, Deuxieme Fascicule Trematodes, Livre Generalites Distomotoses Hepato-Biliaires: Vigot Freres Editeurs. Paris. 1971; 327-387.

9) Panaccio M, Trudgett A. Molecular biology. In: Dalton JP. (Editor). Fasciolosis. Wallingford: CAB International, 1999; 449-464.

10) Dixon KE. The relative suitability of sheep and cattle as hosts for the liver fluke, Fasciola hepatica. Journal of Helminthology 1964; 38: 203-212.

11) Akahane H, Harada Y, Oshima T, Takayama A, Ashizawa H. Patterns of the variation of the common liver-fluke (Fasciola sp.) in Japan Part IV. Comparative studies on the external form, size of egg and number of eggs in the uterus of fluke in pig and horse. Japan Journal of Parasitology 1974; 23: 207-212.

12) Ghavami MB, Rahimi P, Haniloo A, Mosavinasab SN. Genotypic and phenotypic analysis of Fasciola isolates. Iranian Journal of Parasitology 2009; 4: 61-670.