Nitrozomorfolin (NMOR)’in kanserojen ve mutajenik özelliklere sahip olduğu iyi bilinmektedir ⁶. NMOR’in bebek şişeleri ve emziklerdeki kauçuklar da dahil olmak üzere kauçuk ürünlerinde bir kirletici madde olarak bulunduğu ve ayrıca çeşitli sebzelerde, peynirlerde, alkollü içeceklerde ve meyvelerde de bulunduğu gözlenmiştir. NMOR’in ABD’de ticari olarak kullanımı yasaklanmıştır. NMOR’in sağlık üzerindeki etkileri hakkında sınırlı bilgi mevcuttur. İnsanlarda NMOR’in akut, kronik, üreme, gelişimsel veya kanserojen etkileri hakkında yeterli bilgi mevcut değildir. Hayvan çalışmalarında, oral yoldan NMOR’e maruz bırakılan hayvanlarda karaciğer, nazal boşluk, akciğer ve böbrekler üzerinde etkileri olduğu bildirilmiştir ^6-8.

Normal şartlarda kararlı bir yapıya sahip olan nitrozaminlerde nitrozo grubuna bağlı karbon atomunda sitokrom P-450’ye bağlı olarak hidroksillenmesi ile başlayan reaksiyonlar çeşitli hücrelerin nükleofilik bölgelerinde etkileşime geçerek tümör oluşmasında etkili olan elektrofilik ara ürünlerin oluşmasıyla sonuçlanmaktadır. Bunu ise önemli hücresel faaliyetlerin değişmesiyle ortaya çıkan reaktif oksijen türleri (ROT)’nin artması izlemektedir ^6,9.

Günümüzde kimyasal toksik maddelere ve karsinojenlere maruziyet sonucu oluşan toksikasyonlara bağlı meydana gelen oksidatif stresin önlenmesi ya da azaltılması üzerinde çalışılan konuların başında gelmektedir. Bu amaçla antioksidan özelliği olan maddelerin araştırılması ve geliştirilmesi üzerine yapılan çalışmalara geçmişte olduğu gibi şimdide gereksinim duyulmuş ve in vitro ve in vivo çeşitli modeller kullanılmıştır ¹⁰.

Enginar (Cynara scolymus L.) güçlü antioksidan özelliğe sahip olup, içeriğinde bulunan flavonoitler (luteolin, apigenin) ve kafeoil kinik asit türevleri (sinarin ve klorogenik asit) sayesinde karaciğer koruyucu, antimikrobiyal, kolesterol düşürücü özellikleri olduğu belirtilmiştir. Bununla birlikte dispepsi ve bağırsak sendromu gibi durumlarda da sıkça kullanılmaktadır ¹¹. Etken maddelerin suda çözünürlüğünden ve acı lezzetinden dolayı tıbbi olarak daha çok çayları ve kurutulmuş yaprakların sulu ekstreleri kullanılmaktadır ^11,12. Birçok araştırmada ^13-16 enginarın antioksidan ve hepatoprotektif etkisi üzerinde durulmuş ve etkili olduğu kanıtlanmıştır.

Çalışmada; ratların plazma malondialdehid (MDA), kan redükte glutatyon (GSH) düzeyleri ile bazı antioksidan enzim aktiviteleri incelenerek, NMOR’un oluşturabileceği toksisiteye karşı enginarın etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır.

Ratlar dört gruba ayrılmış olup kontrol grubundaki ratlara herhangi bir uygulama yapılmamıştır. Diğer gruplara sırasıyla; enginar, NMOR ve NMOR+enginar uygulanmıştır. NMOR Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA, CAS No: 59-89-2), enginar yaprak ekstraktı ise Arı Mühendislik (Ankara/Türkiye) firmalarından temin edilmiş ve distile suda çözülerek hazırlanmıştır. NMOR 10 mg/kg vücut ağırlığı dozunda, enginar ise 1.5 g/kg vücut ağırlığı dozunda gavaj yoluyla 14 gün süre ile uygulanmıştır ^15,17. NMOR ve enginar uygulamalarına aynı anda başlanmış ve 14 gün süre ile devam edilmiştir. Çalışma sonunda kan dokuda MDA, GSH düzeyleri ile katalaz (KAT), glutatyon peroksidaz (GSH-Px) ve süperoksit dismutaz (SOD) gibi antioksidan enzimlerin aktiviteleri spektrofotometrik olarak belirlenmiştir.

Biyokimyasal Analizler: Uygulamaların sonunda ratlar sakrifiye edilerek kan örnekleri etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) içeren tüplerde toplanmış ve plazmaların ayrılması için tüpler 10 dk boyunca +4 °C’de 3.000 rpm’de santrifüj edilmiştir. Plazma MDA, tam kan ise GSH ve GSH-Px tayini için kullanılmıştır. EDTA’lı kan örnekleri plazmaları ayrıldıktan sonra serum fizyolojik ile 3 kez yıkanmış ve eritrositlerde KAT ve SOD aktiviteleri ile hemoglobin düzeyleri belirlenmiştir.

Plazma örneklerinde MDA düzeylerinde meydana gelen değişimler spektrofotometrik olarak Placer ve ark. ¹⁸’dan modifiye edilmiş olan yönteme göre ölçülmüştür. Bu metot lipid peroksidasyonunun aldehit ürünlerinden olan MDA ile tiyobarbitürik asit (TBA)’in reaksiyonu temeline dayanmaktadır. GSH tayini Ellman ¹⁹ tarafından bildirilen metotla yapılmıştır. Bu yöntem, 5,5'dithiobis-2-nitrobenzoik asit (DTNB) eklendiğinde sülfidril gruplarının meydana getirdiği sarı rengin spektrofotometrik olarak ölçülmesi temeline dayanan bir yöntemdir. KAT aktivitesini belirlemek için Aebi metodu ²⁰ kullanılmıştır. KAT, hidrojen peroksit (H₂O₂)’in yıkımını katalizleyen bir enzimdir. H₂O₂’in KAT enzimi tarafından yıkım hızı, 240 nm dalga boyunda H₂O₂’in ışığı absorbe etmesinden faydalanılarak spektrofotometrik olarak belirlenmiştir. GSH-Px aktivitesi ölçümü için Beutler metodu ²¹ kullanılmıştır. GSH-Px, GSH’un okside glutatyon (GSSG)’a oksidasyonunu H₂O₂ kullanarak katalizler. GSSG’un oluşum hızı glutatyon redüktaz reaksiyonu vasıtasıyla ölçülür. SOD aktivitesi Sun ve ark. ²²’nın modifiye ettikleri metoda göre tayin edilmiştir. SOD aktivite ölçümü, ksantin-ksantin oksidaz sistemi ile üretilen süperoksit radikali (O₂.-)’nin nitroblue tetrazolium (NBT)’u indirgeyerek renk oluşması esasına dayanan metot ile ölçülmüştür. Frankel ve ark. ²³’nın metodu hemoglobin düzeyi tayininde kullanılmıştır. Ferrisiyanür hemoglobindeki Fe⁺²’yi oksitleyerek +2 değerden +3 değerli demire çevirerek methemoglobine dönüşmesine neden olur. Bunu takiben potasyum siyanid ile stabil bir pigment olan siyanomethemoglobin meydana gelir. 546 nm’de siyanomethemoglobinin absorbansı okunarak hemoglobin düzeyleri belirlenmiştir.

İstatistiksel Analiz: Elde edilen veriler ortalama ± standart hata olarak belirlenmiş ve istatistiksel analizler SPSS 22 programı kullanılarak yapılmıştır. Çalışma sonucunda elde edilen verilerin Shapiro-Wilk normallik testi sonucunda normal dağılım gösterdiği belirlenmiştir. Gruplar arasındaki değerlendirme için tek yönlü varyans analizi (One-way ANOVA) ve ve ileri analizler için de Tukey’s HSD testi kullanılmıştır. P<0,05 değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir ²⁴.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: NMOR uygulanan ratlarda enginarın plazma MDA ve eritrosit GSH düzeyleri ile KAT, GSH-Px ve SOD aktiviteleri üzerine etkileri

KAT ve GSH-Px gibi antioksidan enzimler ROT’lerine karşı ilk savunma hattını oluşturan enzimler olup, NMOR uygulaması ile enzim aktivitelerinde düşüş belirlenmiştir. NMOR’in neden olduğu oksidatif stresin KAT ve GSH-Px aktivitelerini düşürmesi, NMOR’in sebep olduğu ROT’nin bu enzimler üzerine göstermiş olabileceği inhibisyon etkisi ya da GSH-Px’ın, GSH varlığında lipid peroksidin hidroksi asitlere dönüşümünü katalize etmesi esnasında substrat olarak GSH kullanılabilirliğinin azalması nedeniyle olabilir ^29-31. Çalışmada enginar takviyesinin, kan antioksidan aktivitelerini artırdığı ve böylece peroksidasyon ürünlerinin zararlı etkilerini önlediği tespit edilmiştir.

Farklı nitrozamin bileşiklerinin uygulandığı çalışmalarda plazma MDA düzeylerinde önemli artış, eritrosit antioksidan enzim aktivitelerinde ise genel olarak düşüş belirlenmiştir. Araştırmacılar nitrozo bileşiklerinin oksidatif strese neden olabileceğini ve artan ROT’nin doku ve hücrelerde hasar oluşturabileceğini belirtmişlerdir ^32,33. Kim ve Choi ³⁴ NMOR’in sebep olabileceği hepatokarsinogeneze karşı Kamicheonggan-tang’ın etkilerini inceledikleri çalışmalarında NMOR uygulaması sonrası MDA düzeylerinin arttığını, GSH düzeylerinde ise belirgin değişikliklerin olmadığını saptamışlardır. Araştırmacılar NMOR’un lipid peroksidasyonuna sebep olarak MDA düzeylerini artırdığı sonucuna varmışlardır. Robichová ve ark. ³⁵ memeli hücrelerinde NMOR’in genotoksik etkilerini araştırdıkları çalışmalarında NMOR ile muamele edilmiş Caco-2 hücrelerinde reaktif oksijen / nitrojen türlerinin (ROT/ RNT) oluşumunu floresan analizleri ile belirlemişler ve NMOR ile muamele edilmiş model hücrelerde mutasyon artışı gözlemlemişlerdir. Elde edilen veriler sonucunda NMOR'in ROT / RNT oluşumuna neden olduğunu doğrulamışlar ve NMOR'in DNA hasarını sadece ilaç metabolize edici enzimler tarafından aktivasyonu ile dolaylı olarak değil, ayrıca doğrudan ROT / RNT oluşumu yoluyla da indükleyebileceğini göstermişlerdir. Robichová ve Slameňová ³⁶ NMOR ve N‐metil‐N′‐nitro‐N‐nitrosoguanidin (MNNG) gibi iki farklı nitrozo bileşiğinin hamster V79 hücreleri ve insan kolon karsinoma (Caco-2) hücreleri üzerindeki sitotoksik etkileri ile bu etkilere karşı E ve C vitaminlerinin etkilerini değerlendirdikleri çalışmalarında NMOR’in her iki hücre hattında doza bağlı canlı hücrelerin azalmasına neden olduğunu; MNNG’in ise sadece V79 hücrelerinde doza bağlı bir sitotoksik etki yarattığını saptamışlardır. Araştırmacılar bu sonuçlar ile farklı nitrozo bileşiklerinin, hücresel makromoleküllerle farklı tepki gösterebileceğini ortaya koymuşlardır. Ratlarda ve hamsterlerde NMOR buharlarının kanserojen potansiyelini değerlendirmek amacıyla yapılan bir inhalasyon çalışması ile NMOR buharının inhalasyonu sonucu da toksik etkiler meydana getirebileceği gösterilmiştir ³⁷. Mevcut çalışmada da NMOR uygulaması sonrası MDA ve GSH düzeyleri ile antioksidan enzim aktivitelerinde istatistiki olarak anlamlı değişimler saptanmış olup NMOR toksisitesinde radikallerin büyük bir rol oynadığı hipotezi desteklenmiştir. Çalışmadaki bulgular NMOR’in meydana getirdiği oksidatif stresteki yükseliş nedeniyle aktif serbest radikallerin oluşumuna sebep olabileceğini düşündürmektedir.

NMOR’in indüklediği toksisiteyi engellemek amacıyla bazı antioksidan özelliği olduğu düşünülen bileşikler denenmiş olup ^34,36, ratlarda NMOR’in indüklediği toksisite modellerinde enginar tedavisi verilen çalışmaya rastlanılmamıştır. Enginar yaprak ekstraktının onkojenik önemi olan sinyal yolakları üzerindeki etkisi nedeniyle antitümöral aktivitesi deneysel testlerle gösterilmiştir ³⁸. Çalışmada oluşan toksisite NMOR ve metabolitlerinin direkt ya da dolaylı etkileri ile hücre membranında meydana gelen hasara bağlı olarak oluşmaktadır. NMOR ile birlikte uygulanan enginarın MDA düzeyini azaltması, antioksidan enzim aktivitelerini artırması oksidatif hasara karşı bir koruma oluştuğu anlamına gelmektedir. Çeşitli çalışmalarda, enginarın antioksidan etkisi sinarin, klorojenik asit ve flavonoidler gibi bileşenlerin metalik iyonu şelatlama ve radikal süpürme etkilerine bağlanmıştır. Enginarın antioksidan etkisi, inflamatuvar yolların gen ifadesine müdahale ve oksidatif stresi indirgemesi ile sonuçlanan antioksidan enzim sentezinin indüksiyonu ile ilişkilendirilmektedir ³⁹.

Kaymaz ve ark. ¹⁶ alfa-amanitin ile oluşturulmuş toksisite üzerine enginarın etkilerini inceledikleri çalışmalarında enginar uygulaması sonrası artmış olan MDA düzeylerinde azalma, GSH düzeyleri ile SOD, GSH-Px, KAT gibi antioksidan enzim aktiviteleri ile histopatolojik bulgularda iyileşme olduğunu belirlemişlerdir. Araştırmacılar enginar uygulaması sonrası meydana gelen değişikliklere dayanarak enginarın güçlü bir antioksidan etkisi olduğunu belirtmişlerdir. Ben Salem ve ark. ⁴⁰ enginar yaprağı ekstraktının yüksek yağlı diyet kaynaklı hücresel obezite ve kardiyak hasardaki etkisini değerlendirdikleri çalışmalarında farklı dozlarda uygulanan enginarın lipid peroksidasyon düzeyleri ile antioksidan enzim aktivitelerinin kontrol grubu değerlerine yaklaştırdığını belirlemişlerdir. Yapılan birçok çalışmada farklı uygulamalar sonrası meydana gelen oksidatif strese karşı enginarın etkilerini incelenmiştir ^13-16. Araştırmacılar enginar uygulaması sonrası lipid peroksidasyon düzeyleri ile antioksidan enzim aktivitelerinde belirgin düzelmeler tespit etmiş ve bunu enginardaki bazı aktif bileşenlerin radikalleri süpürme özelliğine bağlamışlardır.

Bu çalışmada, plazma MDA konsantrasyonu ve antioksidan enzim aktivitelerinin düzelmesi enginarın NMOR kaynaklı oksidatif stresi ve hasarını önleyici bir rol oynadığını göstermektedir. Bu durum enginarın serbest radikal üretilmesini sınırlayarak, antioksidan savunma sistemini artırarak oksidatif stres ve serbest radikalleri önleme yeteneğine sahip olması ile açıklanabilir. Bu sonuçlar, enginarın NMOR toksisitesini önleyebileceğini düşündürmektedir.

Sonuç olarak; mevcut çalışma, enginarın farklı hücresel süreçlerde çeşitli mekanizmalar yoluyla NMOR ile indüklenen toksisiteye karşı potansiyel önleyici etkiye sahip olduğunu göstermiştir.

1) Lijinsky W. Chemistry and biology of n-nitroso compounds. Cambridge monographs on cancer research. J Clin Pathol 1993; 46: 95.

2) Cantwell M, Elliott C. Nitrates, nitrites and nitrosamines from processed meat intake and colorectal cancer risk. J Clin Nutr Diet 2017; 3: 27.

3) Mitacek EJ, Brunnemann KD, Suttajit M, et al. Exposure to N-nitroso compounds in a population of high liver cancer regions in thailand: Volatile nitrosamine (VNA) levels in thai food. Food Chem Toxicol 1999; 37: 297-305.

4) Sasazuki S, Sasaki S, Tsugane S. Cigarette smoking, alcohol consumption and subsequent gastric cancer risk by subsite and histologic type. Int J Cancer 2002; 101: 560-566.

5) Proksch E. Review toxicological evaluation of nitrosamines in condoms. Int J Hygiene Environ Health 2001; 204: 103-110.

6) Oberemm, A, Ahr HJ, Bannasch P, et al. Toxicogenomics analysis of N-nitrosomorpholine induced changes in rat liver: Comparison of genomic and proteomic responses and anchoring to histopathological parameters. Toxicol Appl Pharmacol 2009; 241: 230-245.

7) Song P, Wu L, Guan W. Dietary nitrates, nitrites, and nitrosamines intake and the risk of gastric cancer: A meta-analysis. Nutrients 2015; 7: 9872-9895.

8) Glover CM, Verdugo EM, Trenholm RA, Dickenson ER. N-nitrosomorpholine in potable reuse. Water research 2019; 148: 306-313.

9) Mallik MAB, Tesfai K, Pancholy SK. Formation of carginegenic nitrosamines in soil treated with pesticides, and in sewage amended with nitrogen compounds. Pro Oklahoma Acad Sci 1981; 61: 31-35.

10) Klaunig JE, Wang Z, Pu X, Zhou S. Oxidative stress and oxidative damage in chemical carcinogenesis. Toxicol Appl Pharmacol 2011; 254: 86-99.

11) Holtmann G, Adam B, Haag S, et al. Efficacy of artichoke leaf extract in the treatment of patients with functional dyspepsia: a six‐week placebo‐controlled, double‐blind, multicentre trial. Aliment Pharmacol Ther 2003; 18: 1099-1105.

12) Tanker M, Tanker N. Farmakognozi, Cilt 1. Ankara: Ankara Üniversitesi Basımevi, 1991.

13) Adzet T, Camarasa J, Laguna JC. Hepatoprotective activity of polyphenolic compounds from Cynara scolymus against CCl4 toxicity in isolated rat hepatocytes. J Nat Prod 1987; 50: 612-617.

14) Speroni E, Cervellati R, Govoni P, et al. Efficacy of different Cynara scolymus preparations on liver complaints. J Ethnopharmacol 2003; 86: 203-211.

15) Mehmetçik G, Ozdemirler G, Koc NT, Cevikbas U, Uysal M. Effect of pretreatment with artichoke extract on carbon tetrachloride-induced liver injury and oxidative stress. Exp Toxicol Pathol 2008: 60; 475-480.

16) Kaymaz MB, Kandemir FM, Pamukcu, E, Eröksüz Y, Özdemir N. Effects of aqueous artichoke (Cynara scolymus) leaf extract on hepatic damage generated by alpha-amanitine. Kafkas Univ Vet Fak Derg 2017; 23: 155-160.

17) Ashby J, Lefevre PA. The rat-liver carcinogen N-nitrosomorpholine initiates unscheduled DNA synthesis and induces micronuclei in the rat liver in vivo. Mutat Res Lett 1989; 225: 143-147.

18) Placer ZA, Cushmann LL, Johnson BG. Estimation of products of lipid peroxidation in biological systems. Anal Biochem 1960; 16: 359-364.

19) Ellman GL. Tissue sulfhydryl groups. Arch Biochem Biophys 1959; 82: 70-77.

20) Aebi H. Catalase. In: Bergmeyer HU (Editor). Methods of Enzymatic Analysis. 2nd Edition, Weinheim: Verlag Chemie, 1974: 673-678.

21) Beutler E. Red Cell Metabolism. A Manual of Biochemical Methods, 3rd Edition, Orlando: Grune & Stratton, 1984.

22) Sun Y, Oberly LW, Ying LA. Simple method for clinical assay of superoxide dismutase. Clin Chem 1988; 34: 497-500.

23) Frankel S, Reitman S, Sonnen AC. A textbook on laboratory procedure and their interpretation. In: Gradwohl RBH. (Editor). Gradwohl's Clinical Laboratory Methods and Diagnosis. 1st Edition, USA, St. Louis: The C.V. Mosby Company, 1970; 403-404.

24) Karagöz Y. SPSS 22 Uygulamalı Biyoistatistik. Güncellenmiş 2. Basım, Ankara: NOBEL Akademik Yayıncılık, 2015.

25) Brown JL. N-Nitrosamines. Occup Med (Philadelphia, Pa.) 1999; 14: 839-848.

26) Jalili C, Moradi D, Roshankhah S, Salahshoor MR. Effect of pentoxifylline on kidney damage induced by nitrosamine in male rats. Res Pharm Sci 2019; 14: 64-73.

27) Tricker AR, Spiegelhalder B, Preussmann R. Environmental exposure to preformed nitroso compounds. Cancer Surv 1989; 8: 251-272.

28) Siems WG. Lipid peroxidation and pharmaceutical drugs. Free Radic Biol Med 2018; 124: 565.

29) Farombi EO, Fakoya A. Free radical scavenging and antigenotoxic activities of natural phenolic compounds in dried flowers of Hibiscus sabdariffa L. Mol Nutr Food Res 2005; 49: 1120-1128.

30) Halliwell B, Gutteridge JM. Free Radicals in Biology and Medicine. USA: Oxford University Press, 2015.

31) Kaya E, Yılmaz S. Ratlarda siklofosfamid ile oluşturulmuş hemorajik sistitte propolis ve enginarın koruyucu etkileri. FÜ Sağ Bil Vet Derg 2018; 32: 93-98

32) Tahan V, Ozaras R, Canbakan B,et al. Melatonin reduces dimethylnitrosamine‐induced liver fibrosis in rats. J Pineal Res 2004; 37; 78-84.

33) Kaya E, Yılmaz S, Çeribaşı AO, Telo S. Protective effect of lycopene on diethylnitrosamine-induced oxidative stress and catalase expression in rats. Ankara Üniv Vet Fak Derg 2019; 66: 43-52.

34) Kim DH, Choi JM. Effect of kamicheonggan-tang on pre-hepatocarcinogenesis induced by N-nitrosomorpholine. J Physiol Pathol Korean Med 2002; 16: 734-744.

35) Robichová S, Slameňová D, Gábelová A, Sedlák J, Jakubı́ková J. An investigation of the genotoxic effects of N-nitrosomorpholine in mammalian cells. Chem Biol Interact 2004; 148: 163-171.

36) Robichová S, Slameňová D. Effects of vitamins C and E on cytotoxicity induced by N-nitroso compounds, N-nitrosomorpholine and N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine in Caco-2 and V79 cell lines. Cancer Lett 2002; 182: 11-18.

37) Klein RG, Spiegelhalder B, Preussmann R. Inhalation carcinogenesis of N-nitrosomorpholine (NMOR) in rats and hamsters. Exp Pathol 1990; 40: 189-195.

38) Pulito C, Mori F, Sacconi A, et al. Cynara scolymus affects malignant pleural mesothelioma by promoting apoptosis and restraining invasion. Oncotarget 2015; 6: 18134-18150.

39) Toreti VC, Sato HH, Pastore G, et al. Recent progress of propolis for its biological and chemical compositions and its botanical origin. Evid Based Complement Alternat Med 2013: 1-13.

40) Ben Salem M, Affes H, Dhouibi R, et al. Effect of Artichoke (cynara scolymus) on cardiac markers, lipid profile and antioxidants levels in tissue of HFD-induced obesity. Arch Physiol Biochem 2019; 1-11.