Araştırma ve Yayın Etiği: Fırat Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu’nun (FÜHADYEK) 14.04.2021 tarihli ve 2021/07 oturum sayılı onayı alındı.
Hayvan Materyali: Klinik olarak sağlıklı olan, genital organ muayenesi sırasında herhangi bir patolojik bulguya rastlanmayan, ortalama 60-65 kg canlı ağırlığında 2 yaşlarında 6 adet Akkaraman ırkı koç kullanıldı. Deneysel çalışmalar başlamadan önce ve tüm çalışma boyunca koçlar kaliteli kaba yem ve konsantre yemlerle beslendi. İçme suyu ad libitum olarak sağlandı.
Ginkgo Biloba Ekstresinin Sulandırılması ve Çalışma Gruplarının Oluşturulması: Bu amaçla 2.4 g GB toz ekstresi (Nurbal Şifa Merkezi, İstanbul, Türkiye) üzerine 7.6 mL distile su ilave edilerek vortekslendi ve çözülme sağlanıp %16 GB stok solüsyonu (SS) elde edildi. Stok solüsyonlar Tris+yumurta sarısı sulandırıcısı (TYSS) ile tekrar seyreltildi [GB %8: 2 mL GB SS + 2 mL TYSS, GB %4: 1 mL GB SS + 1 mL distile su + 2 mL TYSS, GB %2: 0.5 mL GB SS + 1.5 mL distile su + 2 mL TYSS, GB %1: 0.25 mL GB SS + 1.75 mL distile su + 2 mL TYSS, GB %0.5: 0.125 mL GB SS + 1.875 mL distile su + 2 mL TYSS, Kontrol: 2 mL distile su + 2 mL TYSS].
Deneysel Dizayn ve Spermanın İşlenme Süreci: Koçlardan suni vajen yardımıyla spermalar toplandı. Laboratuvara getirilen spermaların motilite ve yoğunluk tayinleri bilgisayar destekli sperm analiz (CASA- ISASv1, Proiser, Spain) cihazı kullanılarak yapıldı. Alınan spermaların araştırmada kullanılabilmesi için total motilitesi %70’in ve yoğunluğu 2 milyarın üzerinde olma şartı arandı. Bu şartı sağlayan spermalar daha önceden hazırlanmış TYSS ile 1:1 oranında sulandırıldı. Sulandırılan spermalar pooling yapıldı. Pooling çalışma gruplarının her birine 2’şer ml olacak şekilde bölündü ve çalışma grupları ile birleştirildi. Bu sayede deney grupları [Grup 1: %4 GB, Grup 2: %2 GB, Grup 3: %1 GB, Grup 4: %0.5 GB, Grup 5: %0.25 GB ve Grup 6: Kontrol (%0 GB)] oluşturuldu. Daha sonra sulandırılmış spermaların sıcaklığı soğutma kabininde 5°C’ye düşürüldü ve aynı oranlarda GB içeren %10 gliserollü TYSS ile deney grupları kademeli bir şekilde birleştirildi. Bu işlemin akabinde spermalar soğutma kabininde 4 saatlik bir bekleme işlemine tâbii tutuldu ve spermalar 0,25 ml’lik mini payetlere çekildi. Otomatik dondurma cihazında (Microdigitcool, IMV, Fransa) donduruldu. Dondurulmuş spermalar -196°C’deki sıvı azot içeren konteynerlerde saklandı. Dondurma işleminden 24 saat sonra payetler 38°C sıcaklıktaki su içerisinde 25 saniyede çözdürüldü. Çözdürülen spermalarda spermatolojik ve akış sitometrik analizler ile vitamin ve yağ asitleri düzeyleri ölçüldü.
Spermatolojik Analizler
Motilite ve Kinematik Parametrelerin Analizi: Bu aşamada CASA sistemi kullanılarak spermalarda motilite ve kinematik parametre tayinleri yapıldı. Çözdürülen spermalar 1:4 oranında Tris buffer ile sulandırıldı ve özel lam (Spermtrack 20 µm) üzerine 3 µL koyuldu. Motilite modülü üzerinden total, progresif motilite (hızlı, orta ve yavaş hızda hareket eden spermatozoon oranları ile birlikte) oranları (%), kinematik parametre değerleri [(VCL- Eğrisel hız (μm/s); VSL-Doğrusal hız (μm/s); VAP- Ortalama yol hızı (μm/s); LIN- Doğrusallık (Eğrisel yolakların doğrusallığı, %); STR- Doğrusallık (Ortalama yolun doğrusallığı, %), WOB: Kararsızlık (Gerçek yolakta ilerlerken izlenen dalgalanmanın ölçüsü, %), ALH- Spermatozoon başının ortalama yolda ilerlerken laterale doğru saptığı uzaklık (μm); BCF- Çapraz geçiş frekans ritmi (Eğrisel yolağın ortalama yolaktan geçme frekansı, Hertz)] kaydedildi.
Membran Bütünlüğünün Belirlenmesi (HOS Test): Çözdürülen ve 1:5 oranında sulandırılan spermadan 50 µL alınıp üzerine 500 µL hipotonik solüsyon (0.49 g sitrik asit, 0.9 g fruktoz, 100 mL distile su) ilave edildi. Etüv içerisinde 38°C’de 60 dakika inkübasyona bırakılan spermalardan 15 µL alınıp lam üzerine damlatıldı ve lamelle kapatıldı. Faz-kontrast mikroskobun 400x büyütmesi kullanılarak 200 adet spermatozoon sayıldı. Şişmiş baş ve kıvrılmış kuyruklu sağlam spermatozoonların oranı % olarak ifade edildi.
Akış Sitometrik Analizler: Bu analiz için her grupta çözdürülen spermalar 3 eşit parçaya ayrıldı. Ayrılan kısımlar PBS ile 99 kat sulandırıldı. Çözdürülen spermaların canlılık oranlarının belirlenmesi amacıyla LIVE/DEAD Sperm Viability Kit (L7011, ThermoFisher Scientific, USA) kullanıldı. Sulandırılan spermaların üzerine 5 µL SYBR-14, 5 µL PI eklendi. Bu işlemin ardından spermalar 38°C’deki etüv içerisinde karanlık ortamda 30 dakika boyunca inkübe edildi. İnkübasyon sonrası akış sitometri cihazıyla (Cytoflex, Beckman-Coulter, USA) canlılık oranı % olarak ölçüldü. Akrozomal hasar düzeyinin belirlenmesi amacıyla ise Lectin PNA from Arachis hypogaea (peanut agglutinin), Alexa Fluor™ 488 Conjugate (L21409, ThermoFisher Scientific, USA) kullanıldı. Bu işlem sırasında sulandırılan spermaya 5 µL Lectin PNA ve 3 µL PI boyası eklendi. Aynı inkübasyon süresinin ardından akış sitometri cihazıyla total akrozomal hasar düzeyi % olarak ölçüldü. Mitokondriyal membran potansiyelinin belirlenmesi amacıyla 1,1',3,3'-Tetraethyl-5,5',6,6'-tetrachloroimidacarbocyanine iodide (JC-1 Dye, Mitochondrial Membrane Potential Probe, (T3168, ThermoFisher Scientific, USA) kullanıldı. Sulandırılan sperma üzerine 2.5 µL JC-1 eklendi. Aynı inkübasyon süresinin ardından akış sitometri cihazıyla yüksek ve düşük membran potansiyeline sahip spermatozoonlar ayrı ayrı görüntülendi ve % olarak ifade edildi23.
Total lipid, Yağ Asidi, Vitaminler ile Kolesterol Analizleri
Lipidlerin Ekstraksiyonu: Sperma örneklerinden lipidlerin ekstraksiyonu, Hara ve Radin24’in bildirdiği yönteme göre yapıldı.
Total Lipid: Sperma örneklerindeki total lipid miktarları Frings ve ark.25’nın bildirdiği metoda göre fosfovanilin reaktifi ile spektrofotometrik olarak belirlendi.
Yağ Asitleri: Doku ve vücut sıvılarındaki yağ asitleri analizleri yapılırken yağ asitleri % 2’lik sülfürik asit içeren metanolde metil esterlere dönüştürülerek analiz edilmektedir. Bunun için önce lipid ekstraktlardaki yağ asitleri, yağ asidi metil esterlerine dönüştürülmekte ve daha sonra da yağ asidi metil esterlerinin analizi yapılmaktadır26.
Vitaminler ve Kolesterol: Sperma lipid ekstraktlarındaki vitaminler ve kolesterol analizi için yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) cihazı kullanıldı27-30.
Oksidatif Stres Analizleri: Dondurulan koç sperması örnekleri oda sıcaklığında çözülmeye bırakıldı. Daha sonra sperma 600 g x 10 dakika x 4°C santrifüj edildi. Hücresel pelet üç kez damıtılmış suyla yıkandı ve her seferinde santrifüj uygulandı ve pelet korundu. Daha sonra hücresel pelet ayrıldı, tartıldı ve 1:10 (ağırlık/hacim) oranında damıtılmış su ile seyreltildi. Daha sonra tüm numuneler Bullet Blender Doku Homojenizatörü (Next Advance Bullet Blender, BBY24M-CE Model, Next Advance, Inc. Averill Park, New York, ABD) ile hız 10 ve süre 4'te homojenleştirildi. Homojenat, MDA, GSH, CAT, GST, SOD'un miktarını belirlemek için 4°C'de 3.000 g'de 15 dakika boyunca ve GSH-Px miktarını test etmek için 55 dakika boyunca 10.000 g'de santrifüjlendi (Hettich Mikro 200R, Tuttleen, Almanya). MDA, GSH, CAT, GST, SOD, GSH-Px analizlerinde süpernatanlar kullanıldı.
MDA düzeyi Placer ve ark.31, tarafından açıklanan yönteme göre test edildi. GSH düzeyi Ellman ve ark.32'nın yöntemiyle belirlendi. CAT aktivitesi Aebi33 yöntemi kullanılarak ortaya çıkarıldı. GSH-Px aktivitesinin ölçümü Beutler34 yöntemiyle yapıldı. GST aktivitesini test etmek Habig ve ark.35 metodu kullanıldı. SOD aktivitesi için Sun ve ark.36 metodu kullanıldı. Protein konsantrasyonunun belirlenmesi, Lowry ve ark.37 tarafından açıklanan yöntem kullanılarak gerçekleştirildi.
İstatistiksel Analizler: Bütün istatistiksel analizler için SPSS (versiyon 22) istatistik programı kullanıldı. P<0.05 istatiksel olarak anlamlı kabul edildi. Yapılan normallik analizi sonrası grupların normal dağılım göstermediği belirlendi. Kontrol ve GB ilaveli deney grupları arasındaki farklılıkları belirlemek için non-parametrik Kruskal-Wallis varyans analizi kullanıldı ve ikili karşılaştırmalar için de non-parametrik Mann-Whitney-U testi tercih edildi.
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
