Koyunlar hastalığa enfekte köpeklerin meraya dışkılamaları ile etrafa yayılan yumurtaları otlarla birlikte alarak yakalanırlar ⁴. Kistlerin büyük çoğunluğu beyin ve nadiren omurilikte bulunmasına karşın az da olsa deri altı ve kas dokusunda da rastlanmıştır ². Ara konakta, yumurtalar kan dolaşımı yoluyla MSS’ye ulaşır ve yaklaşık 2 ay sonra kiraz büyüklüğünde kist teşekkül eder. Enfeksiyondan üç ay sonra, kist iyi şekillenmiş skolekslerle olgunlaşır ve 7-8 ay sonra 5-6 cm çapındaki nihai boyutuna ulaşır. Kistlerin içi şeffaf bir sıvı ve bir sapla kist duvarına bağlı onlarca skoleksten ibarettir. Son konaklar bu kistleri yiyerek enfekte olur ve 40-60 günlük bir prepatent dönemden sonra, kesin konak her biri yaklaşık 37.000 yumurta taşıyan üç veya dört gebe halka çıkarır ⁵.

Akut ve kronik olarak iki formda seyreden hastalığın akut formu yoğun köpek dışkısı ile kontamine merada otlatma sonucu 6-8 haftalık kuzularda meydana gelir ve klinik belirtilerin ortaya çıkmasının ardından 3-5 gün içinde ölüm şekillenir. Kronik form ise genellikle 6-18 aylık koyunlarda rapor edilmiş olup, 3 yaşından büyük koyunlarda nadir gözlenmiştir ⁴. Enfekte hayvanlarda kendi etrafında dönme, başın kistin bulunduğu kısma doğru yaslanması, koordinasyon bozuklukları, körlük, diş gıcırdatma, kistin bulunduğu yerde kafatasında incelme gibi klinik belirtiler hastalıktan şüphe ettirir ².

Coenurosis’in Türkiye’de koyunlarındaki yaygınlığı ve oluşturduğu kayıplar tam olarak ortaya konulamamıştır. Uslu ve Guclu ⁶’nün bildirdiğine göre, Türkiye’de yapılan çalışmalarda coenurosisin yaygınlığı %1.3 ile %36.8 arasında değişmektedir. Konya ilinde yapılan bir çalışmada 624 koyun kafası incelenmiş, bunların 102’sinin (%16.35) C. cerebralis ile enfekte olduğu bildirilmiştir ⁶. Van’da yapılan bir çalışmada incelenen 241 koyunun 156’sı C. cerebralis yönünden pozitif bulunmuş ve %64.7’lik prevalans oranı bildirilmiştir ⁷. Kars ilinde kesilen 387 koyunda C. cerebralis prevalansı 12 ay boyunca araştırılmış ve coenurosis yaygınlık oranı %15,5 (60/387) olarak rapor edilmiştir ⁸. Kırıkkale’de incelenen 100 koyunun 12’sinin beyninde C. cerebralis kisti belirlenmiş ve klinik olarak sağlıklı görünen koyunlarda bu oranın %11.1 olduğu bildirilmiştir ⁹.

Coenurosis’in tanısında enfekte hayvanın yaşı, klinik semptomlar ve nörolojik, ultrasonografik ve postmortem muayenelerin sonuçlarını da kapsayan birçok test kullanılabilir ¹⁰. Serolojik tarama amaçlı ELISA’nın kullanıldığı çok sayıdaki yeni çalışmada Tm-HSP70, Tm-GP50, Tm-GST ve Tm-HSP60 gibi rekombinant proteinler kullanılmış, ancak bu testler yeterli tanısal doğruluğa ulaşamamıştır ^11-13. Rekombinant antijenler Tm16 ve Tm18'e dayanan indirekt ELISA'nın ise aşı denemeleri sırasında bağışıklık yanıtın izlenmesi için yararlı olduğu kanıtlanmıştır ¹⁴.

ELISA’nın tanı testi olarak kullanımı basittir ve çok sayıda numune aynı anda çalışılabilir. Ancak, yüksek oranda yanlış negatif sonuç ve diğer parazit hastalıklarıyla zaman zaman çapraz reaksiyonlar vermesi nedeniyle, sensitivite ve spesifitesi, kullanılan antijenlerin saflık ve özgüllüğünden etkilenir ¹⁵. Bu nedenle, western blot (WB) gibi daha hassas tanı yöntemlerinin kullanılması önerilmektedir ¹⁶.

Bu çalışmanın amacı, C. cerebralis kist sıvısı antijeninin koyunlarda coenurosisin tanısındaki etkinliğinin WB yöntemiyle değerlendirilmesidir.

Serum örneklerinin toplanması: Bu çalışmanın materyalini oluşturan koyun serumları, Elazığ ilindeki koyun çiftliklerinde tipik coenurosis klinik belirtileri gösteren (dönme, bir veya iki gözde körlük, başı yana yaslama vs) koyunların kesimleri takip edilerek elde edildi. Mezbahanede, kesim sonrası bu koyunlardan serum tüplerine 5 mL kan örnekleri alındı, takiben de koyunların kafaları alınarak laboratuvara ulaştırıldı. Laboratuvarda, koyunun parietal kemiği frontal kemiğin hemen kaudalinden iki paralel kesiyle kesildi ve kafa kemiği bir keski ve çekiç yardımıyla çıkarıldı. Beyni ortaya çıkarmak için meninksler bir bistüri ile kesildi. Bireysel kist örnekleri çıkarıldıktan sonra coenurosis olduğu teyit edildi. Elde edilen kistlerin içinde bulunan kist sıvısı steril bir enjektör yardımıyla toplandı ve kist sıvısı antijeni hazırlanmasında kullanıldı. Kesim sonrası alınan kan örnekleri 4000 rpm’de 5 dakika santrifüj edilerek serumlar çıkarıldı ve kullanılıncaya kadar -20ºC’de saklandı. Ayrıca negatif kontrol grubu olarak da Fırat Üniversitesi Veteriner Fakültesi Hayvan Hastanesi’ne güç doğum/sezaryen amacıyla getirilen koyunların yeni doğmuş kuzularından kolostrum emmeden önce v. jugularis’lerinden 5 mL kan örnekleri alınıp serumları ayrıldıktan sonra kullanılıncaya kadar -20ºC’de saklandı.

Serolojik olarak olası çapraz reaksiyonların kontrolü amacıyla da mezbahanede kesimler takip edilerek hidatik kist ve Cysticercus tenuicollis ile enfekte olduğu teyid edilen koyunlardan kan örnekleri alınıp serumları ayrılarak kullanılıncaya kadar -20ºC’de muhafaza edildi.

Ham kist sıvısı antijeninin hazırlanması: Bireysel C. cerebralis kistlerinden alınan bir kiste ait sıvı, skoleks ve diğer doku parçalarının ayrıştırılması için 4000 rpm’de 10 dakika boyunca santrifüj edildi ve süpernatant toplanıp steril effendorf tüplerine porsiyonlandı ve içerisine protein koruyucu olarak 0.1 μg/mL sodyum azid eklenip kullanılıncaya kadar -80ºC’de muhafaza edildi ¹⁷.

Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE): Kist sıvısı antijeni %10’luk separasyon ve %5’lik stok jel sisteminde SDS-PAGE yöntemiyle elektroforeze tabi tutuldu. Separasyon amacıyla antijenden 15 μL alınıp 5 μL 4X Laemmli Sample Buffer ile karıştırıldı ve 10 dakika kaynatılıp (reducing şartlarda) kuyucuklara yüklendi. Ayrışan proteinlerin moleküler ağırlığını belirlemek amacıyla da bir kuyucuğa moleküler ağırlık markeri (PageRuler Prestained Protein Ladder, Thermo) konuldu. Örnekler 160 V sabit akımda proteinler jelin alt kısmına ulaşana kadar separasyona tabi tutuldu. Bu sürenin sonunda jelin üzerine 20 mL fiksasyon solüsyonu (%10 asetik asit, %50 methanol ve %40 dH2O) eklenerek 37ºC’de 45 dk oda ısısında orbital çalkalayıcıda düşük devirde inkübe edildi. Takiben 20 ml Coomassie blue boya solüsyonu (%40 dH2O, %10 asetik asit, %50 methanol, %0.25 Coomassie Brillant Blue R-250) ile bir gece boyanıp bandlar belli olana kadar boya giderici solüsyonda (%67.5 dH2O, %7.5 asetik asit, %25 methanol) yıkandı ¹⁸. Bandlar tamamen ortaya çıkınca jelin görüntüsü alındı.

Western Blotting (WB): Jelde yürütülen antijenin immunolojik olarak aktif olup olmadığını göstermek amacıyla C. cerebralis ile enfekte ve enfekte olmayan koyun serumları ile beraber çapraz reaksiyonların kontrolü için de hidatik kist ve C. tenuicollis ile enfekte koyun serumları kullanılarak WB işlemi yapıldı. Bu amaçla, SDS-PAGE elektroforez işlemi bittikten sonra blotlama tankının içi transfer buffer ile doldurulup içine jel-membran (nitroselüloz membran) sistemi yerleştirildi ve 1 saat süreyle 70 volt sabit akım uygulanarak jel üzerinde bulunan proteinler membrana transfer edildi. Daha sonra membran nonspesifik bağlanmaları önlemek için %5’lik yağsız süt tozu içine bırakılarak +4ºC’de 1 gece bekletildi (bloklama). Bloklanan membran %0.1’lik Tween-20 içeren PBS ile bir kez yıkanıp pozitif, negatif ve çapraz kontrol koyun serumları (primer antikor) %0.02 Tween-20 içeren PBS ile 1/200 oranında sulandırılarak membrana eklendi ve 2 saat 37ºC’de bekletildi. Sürenin sonunda membran %0.1 Tween-20 içeren PBS ile 5’er dakika süreyle dört kez yıkandı. Sekonder antikor (peroksidaz ile işaretli anti-sheep IgG, Lot No: A3415, Sigma) %0.02 Tween-20 içeren PBS ile 1/5000 oranında sulandırılıp membrana eklendi ve bu şekilde 37ºC’de 2 saat inkübe edildi. Sürenin bitiminde 4 kez 5’er dakika yıkama işlemi yapıldı ve membranlara substrat solüsyonu (DAP substrat, Thermo) eklenip oluşan bandlar değerlendirildi ¹⁸.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: SDS-PAGE jelinde ayrıştırılan koyun C. cerebralis kist sıvısı antijeninin oluşturduğu bandların görünümü

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 2: Western blot sonucunda elde edilen bandların görünümü. M: Marker, 1-15: Kesim sonrası C. cerebralis olduğu teyid edilmiş pozitif kontrol serumlar, 16-22: Negatif kontrol serumlar

Kesin olarak pozitif ve negatif olduğu bilinen serumlar işlenerek tanımlayıcı band tespit edildi. Bunlardan 68 kDa olan band, bütün örneklerde (hem negatif hem de pozitif serumlarda) belirlenirken 24 kDa’luk band daha çok pozitif örneklerde tespit edildi. Buna göre, her iki bandın da gözlendiği örnekler pozitif, sadece 68 kDa’luk bandın gözlendiği örnekler ise negatif olarak değerlendirildi. Bu değerlendirme sonucunda, kesin olarak C. cerebralis pozitif olduğu bilinen 40 koyun serumunun 17 (%42,5)’si pozitif olarak değerlendirildi. Öte yandan kesin olarak negatif olduğu bilinen 40 serumun tamamı (%100) negatif sonuç verdi. Çapraz reaksiyonların belirlenmesi amacıyla işlenen 20 adet hidatik kist pozitif serumun 9 (%45)’u pozitif yanıt verirken, 20 adet C. tenuicollis’li serumun 3 (%15)’ü pozitif yanıt verdi.

Bu çalışmada, C. cerebralis kist sıvısı antijeninin tanısal değerini belirlemek amacıyla, kesim sonu inceleme ile C. cerebralis olduğu kanıtlanmış koyunların serumlarında, enfekte olmayan kontrol koyunlarında ve diğer parazitlerle enfekte koyunlardan toplanan serumlarda anti-C. cerebralis antikorlarını yakalamada bu antijenin tanısal sensitivite ve spesifitesini test etmek için WB kullanıldı. Neticede, C. cerebralis kist sıvısı antijeninin koyun serumları ile WB analizi neticesinde hem pozitif hem de negatif örneklerde 68 kDa’luk band tespit edilirken bununla birlikte 24 kDa’luk bandın gözlendiği örnekler pozitif olarak kabul edildi. Başka bir çalışmada hiperimmun koyun serumları ile muamele edilen C. cerebralis kist sıvısı antijeninin 68, 106 ve 202 kDa büyüklüğünde üç polipeptid ile reaksiyona girdiği ifade edilmiştir ²⁰. Araştırıcıların tanısal polipeptid olarak kabul ettikleri 68 kDa’luk bandın bu çalışmada da tespit edilmesine rağmen mevcut çalışmada pozitiflik tanı kriteri olarak 24 kDa’luk band seçilmiştir. Tanısal bandlardaki bu farklılığın sebebi, antijen hazırlama ve saklama koşullarındaki farklılığın yanısıra farklı suş oluşumu ile de ilişkili olabilir.

Bu çalışmada kullanılan antijenin sensitivitesi %42.5 (17/40) iken spesifitesi %100 (40/40) olarak belirlendi. Kist sıvısı ve skoleks antijenlerinin kist duvarı antijenine kıyasla daha yüksek tanısal hassasiyet ve özgüllüğe sahip olduğunu bildiren çalışmalar olmasına ^12,16,22 rağmen Carmena ve ark. ²³ sıvı antijenlerin skoleks antijeninden daha üstün olduğunu vurgulamışlar ve sıvı antijenlerini diğer antijenlerden daha spesifik ve yüksek protein içerikli olarak tanımlamışlardır. Ancak, metasestodların sıvı antijenleri genellikle enfekte konak serumlarında bulunan spesifik immünoglobülin ile çapraz reaksiyona girdiği için teşhisin doğruluğunu sınırlayabilmektedirler. Nitekim bu çalışmada da kist sıvısı antijeninin sensitivitesi oldukça düşük (%42.5) olarak belirlenmiştir. Bu nedenle, tanısal antijen olarak ham antijenlerin kullanılması, seri üretim aşamasında dengesiz termal stabilite gösterdikleri için ham antijen kullanılan çalışmalar çok ileri gidememiştir. Sonuç olarak, rekombinant antijenlere dayanan yönelim artmış ve paraziter hastalıkları teşhis etmek için giderek daha fazla kullanılmaya başlanmıştır ²⁴.

Coenurosis’in erken dönem tanısı amacıyla rekombinant TmGP50 proteini kullanılarak dizayn edilen indirekt ELISA sonuçlarına göre protein %95 sensitivite ve %92.6 spesifite sergilemiştir ¹². Başka bir çalışmada, koyun kökenli T. multiceps HSP70 klonlandıktan sonra eksperese edilip rekombinant TmHSP70 proteini elde edilmiştir. Bahsi geçen rekombinant proteinin WB analizinin sensitivite ve spesifite değerleri %100 olarak belirlenirken ELISA testinin sensitivite ve spesifite oranları sırasıyla %66.6 ve %52.6 olarak belirlenmiştir. Bu araştırmada testler arasındaki ikili karşılaştırmalar sonucunda elde edilen doğruluk oranlarına bakıldığında, ELISA testinin sensitivite ve spesifite değerlerinin WB testine kıyasla daha düşük olduğu görülmektedir. Bu durumun sebebi WB testinde hem pozitif hem de negatif serumlarda gözlenen 17 kDa’luk bandın ELISA testinde bir arka plan oluşturması ve OD değerlerinin yüksek çıkmasına yol açarak yanlış yorumlamalara yol açması olabilir diye yorumlanmıştır ¹³.

Bu çalışma ile elde edilen veriler, C. cerebralis’in teşhisi amacıyla ham kist sıvısı antijeninin WB’daki kullanımının yeterli tanısal doğruluğa ulaşamadığını göstermiştir. Bu nedenle özellikle rekombinant antijen temelli tanı metodlarının geliştirilmesi faydalı olacaktır.

1) Oryan A, Goorgipour S, Moazeni M, Shirian S. Abattoir prevalence, organ distribution, public health and economic importance of major metacestodes in sheep, goats and cattle in Fars, southern Iran. Trop Biomed 2012; 29: 349-359.

2) Sharma DK, Chauhan, PPS. Coenurosis status in Afro-Asian region: A review. Small Rum Res 2006; 64: 197-202.

3) Yılmaz R, Özyıldız Z, Yumuşak N, Koyunlarda Coenurus cerebralis’in patomorfolojik bulguları. Harran Üniv Vet Fak Derg 2014; 3: 73-77.

4) Scott PR. Diagnosis and treatment of coenurosis in sheep. Vet Parasitol 2012; 189: 75-78.

5) Scala A, Varcasia, A. Updates on morphobiology, epidemiology and molecular characterization of coenurosis in sheep. Parassitologia 2006; 48: 61-63.

6) Uslu U, Guclu F. Prevalence of Coenurus cerebralis in sheep in Turkey. Med Weteryn 2007; 63: 678-680.

7) Biçek K, Karakuş A, Değer MS. Van ilinde Coenurus cerebralis’in yaygınlığı ve Coenurosis’in teşhisinde yardımcı bir parametre olarak enolaz (NSE) enziminin önemi. Atatürk Üniv Vet Bil Derg 2019; 14: 185-192.

8) Karakurt E, Nuhoğlu H, Barış S, et al. Clinical, histopathological and parasitological evaluation of Coenurus cerebralis infecting domesticated and wild ruminants from Kars Province, Turkey. Dicle Üniv Vet Fak Derg 2019; 12: 122-127.

9) Gökpinar S, Yildiz K. Klinik bakımdan sağlıklı görünümlü koyunlarda Coenurosisin yaygınlığı. Kafkas Üniv Vet Fak Derg 2012; 18: A187-A191.

10) Varcasia A, Tamponi C, Ahmed F, et al. Taenia multiceps coenurosis: A review. Parasites Vectors 2022; 15: 84.

11) Wang Y, Nie H, Gu X, et al. An ELISA using recombinant TmHSP70 for the diagnosis of Taenia multiceps infections in goats. Vet Parasitol 2015; 212: 469-72.

12) Huang X, Xu J, Wang Y, et al. GP50 as a promising early diagnostic antigen for Taenia multiceps infection in goats by indirect ELISA. Parasites and Vectors 2016; 9: 618.

13) Gunyakti Kilinc S, Simsek S, Celik F, Kesik HK. Cloning, expression and serodiagnostic potential of HSP70 of Taenia multiceps in sheep. Mol Biochem Parasitol 2021; 245: 111397.

14) Varcasia A, Tosciri G, Coccone GS. Preliminary field trial of a vaccine against coenurosis caused by Taenia multiceps. Vet Parasitol 2009;162: 285-289.

15) . Sun GG, Wang ZQ, Liu CY, et al. Early serodiagnosis of trichinellosis by ELISA using excretory-secretory antigens of Trichinella spiralis adult worms. Parasites and Vectors 2015; 8: 1-8.

16) Mahdy OA, Mousa WM, Abdel-Maogood SZ, Abdel-Radi S, El-Bahy MM. Characterization of immunogenic protein fractions of sheep cysticercosis in Cairo, Egypt. J Hel Vet Med Soc 2017; 68: 291-298.

17) El Akkad DMH, Ramadan RM, Auda HM, et al. Improved Dot-ELISA assay using purified sheep Coenurus cerebralis antigenic fractions for the diagnosis of zoonotic coenurosis. World’s Vet J 2022; 12: 237-249.

18) Kesik HK, Simsek S, Gunyakti Kilinc S, Koroglu E. Identification of antigen B (AgB) gene polymorphism in cattle and sheep isolates of Echinococcus granulosus and investigation of effects on serological diagnosis. Acta Tropica 2019; 199: 105099.

19) Kordafshari S, Hosseini SH, Meshgi B, Youssefi MR. Comparison of electrophoretic patterns of larval stages of Taeniidae and determination of specific antigens of hydatid cyst by western blotting technique. Global Vet 2010; 4: 601-606.

20) Jeyathilakan N, Basith SA, John L, Chandran NDJ, Dhinakarraj G. Immunochemical localization of cross-reactive proteins of bladderworms with special reference to detection of specific antigen in cystic echinococcosis of sheep: Immunochemical localization of cross-reactive proteins of cystic echinococcosis of sheep. Indian J Vet Anim Sci Res 2021; 50: 37-47.

21) Ahmad G, Nizami WA, Saifullah MK. Analysis of potential antigens of protoscolices isolated from pulmonary and hepatic hydatid cysts of Bubalus bubalis. Comp Immunol, Microbiol Inf Dis 2001; 24: 91-101.

22) Ramadan RM, Khalifa MM, El-Akkad DM, Abdel-Wahab AM, El-Bahy MM. Animal hydatid cyst genotypes as a potential substitute for human hydatid cyst as a source of antigen for diagnosis of zoonotic hydatidosis. J Parasit Dis 2021; 45: 424-434.

23) Carmena D, Benito A, Eraso E. Antigens for the immuno diagnosis of Echinococcus granulosus. An update. Acta Tropica 2006; 98: 74-86.

24) Ndao M. Diagnosis of parasitic diseases: Old and new approaches. Interdisp Persp Inf Dis 2009: 278246.