Klinik yönetimdeki ilerlemeler; özellikle sisplatin ± doksorubisin içeren neoadjuvan kemoterapinin gecikmiş/definitif cerrahi rezeksiyon (gerektiğinde transplantasyon) ile kombinasyonu sayesinde, risk grubuna bağlı olarak hepatoblastomda genel sağ kalımı yaklaşık %65–95 aralığına yükseltmiştir ⁵. Ancak bu iyileşme, hasta popülasyonunun tamamına homojen bir şekilde yansımamaktadır. Özellikle tanı anında uzak metastazı olan, vasküler invazyon gösteren veya tedavi sonrası nüks gelişen yüksek riskli hasta grubunda prognoz hala kötüdür ve beş yıllık sağkalım oranları %40 düzeylerinde seyretmektedir ^6,7. Ancak hepatoblastoma araştırmaları, uygun model eksikliği ve mevcut modellerin standardizasyon sorunları nedeniyle yavaş ilerlemektedir. Deney hayvanı modelleri, hepatoblastoma (HB) dahil solid tümörlerde tümör biyolojisi, büyüme kinetiği ve tedavi yanıtının kontrollü koşullarda incelenmesini amaçlar. Özellikle ortotopik yerleşimli modellerin, subkutan modellere kıyasla tümörün doku mikroçevresi ve histopatolojik özelliklerini daha iyi yansıtabilmesi nedeniyle translasyonel açıdan üstün olabileceği bildirilmektedir ⁸.

Bununla birlikte HB alanında, hastalığın biyolojik heterojenitesini ve metastatik kapasitesini bütünüyle yakalayan modellerin sınırlı olduğu ve bu durumun preklinik sonuçların güvenilirliğini/karşılaştırılabilirliğini etkilediği vurgulanmaktadır. Ortotopik tümörler, subkutan tümörlere kıyasla daha yüksek vaskülarizasyon gösterir ve klinik tümörlere benzer gen ekspresyon profilleri (örneğin β-katenin, Glypican-3, AFP) sergiler ⁹. Preklinik hepatoblastoma çalışmalarının temel taşı olan HepG2 hücre hattı, literatürde hem kimliği hem de in vivo davranışları açısından önemli tartışmaların odağındadır. Bu tartışmalar, modelin geçerliliğini (validasyonunu) ve elde edilen verilerin yorumlanmasını doğrudan etkilemektedir. HepG2 hücre hattı, 1979 yılında Aden ve ark. ¹⁰ tarafından tanımlanmış ve köken aldığı karaciğer tümörü uzun yıllar hepatosellüler karsinom olarak raporlanmıştır. Daha sonra yapılan histopatolojik yeniden inceleme ve genetik/moleküler karakterizasyon (örn. HB ile uyumlu kromozomal anomaliler, CTNNB1/β-katenin exon 3 delesyonu ve Wnt/β-katenin aktivasyonu) bulguları, HepG2'nin hepatoblastom kökeni ile daha uyumlu olduğunu göstermiştir ¹¹.

HepG2'nin metabolik profilinin HCC ile örtüştüğünü ve Hepatoblastoma türevi yerine Hepatosellüler Karsinom olarak sınıflandırılmaya devam edilmesi gerektiğini savunan çalışmalar mevcuttur ^12,13. Bu çalışma, HepG2 hücrelerinin ortotopik karaciğer tümörü oluşturmadaki tümör başlatma kapasitesinin ve tekrarlanabilirliğinin sınırlı olduğu yönündeki literatür bulgularını dikkate alarak, HepG2'nin preklinik hepatoblastoma araştırmalarında kullanılabilir bir ortotopik model sağlayıp sağlamadığını değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Bu kapsamda HepG2'nin uygunluğu; (i) in vivo büyüme dinamiği ve görüntüleme ile izlenebilirlik, (ii) tümör dokusunun histopatolojik ve immünfenotipik doğrulaması ve (iii) aynı koşullarda uygulanan teknik/biyolojik iyileştirmelerin (örneğin; ECM desteği, hücre dozu) tutulum üzerindeki etkisi üzerinden analiz edilmiştir.

Hücre Kültürü: Çalışmada kullanılan insan hepatoblastoma hücre hattı HepG2, American Type Culture Collection'dan (ATCC, Manassas, VA, ABD; Katalog No: HB-8065) temin edilmiştir. Hücreler, yüksek glikoz (4.5 g/L) içeren Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) besiyeri içerisinde kültüre edilmiştir. Besiyeri, hücre proliferasyonunu ve canlılığını desteklemek amacıyla %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin çözeltisi ile desteklenmiştir. Hücrelerin inkübasyonu 37°C sıcaklıkta %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir ortamda gerçekleştirilmiştir.

Lusiferaz Genini İfade Eden Stabil HepG2 Hattının Oluşturulması: Tümör gelişiminin in vivo ortamda boylamsal olarak izlenebilmesi amacıyla HepG2 hücreleri ateş böceği lusiferazı ifade edecek şekilde genetik olarak modifiye edilmiştir. Hücreler Lenti-luciferase-P2A-Neo (Addgene, plazmid no: 105621) plazmidini taşıyan lentiviral partiküller ile enfekte edilmiştir. Viral enfeksiyonun ardından plazmidi başarıyla genomuna entegre eden stabil hücrelerin seçimi için besiyerine 1 mg/mL konsantrasyonunda G418 Sülfat seçici antibiyotiği eklenmiştir. Seleksiyon sonrası elde edilen stabil hücre hattında lusiferaz aktivitesi, Luciferase Assay System (Promega, ABD; Kat. No: E1500) kullanılarak in vitro ortamda doğrulanmıştır.

Ortotopik Ksenograft Farelerin Oluşturulması: Bu çalışmada, 6 ila 8 haftalık outbred atimik çıplak erkek fareler (J:NU, #007850, The Jackson Laboratory, ABD) kullanılmıştır. Lusiferaz eksprese eden HepG2 hücreleri farelerin karaciğerlerine ortotopik olarak enjekte edilmiştir. Çalışma kapsamında farklı hücre dozlarının ve matrijel varlığının tümör indüksiyonu üzerindeki etkilerini incelemek amacıyla beş ana grup oluşturulmuştur. Deney, başlangıç aşaması ve bir hafta sonra eklenen Telafi Grubu olmak üzere iki aşamada sürdürülmüştür (Table 1). Hücreler, belirtilen dozlarda (2.5 ya da 3 milyon) toplam 30 µL hacimde PBS veya PBS-Matrijel karışımı içerisinde hazırlanmış ve cerrahi operasyonla doğrudan farelerin karaciğerinin sol lobuna enjekte edilmiştir.

Büyütmek İçin Tıklayın

Table 1: Grupların dağılımı ve kullanılan fare sayıları

İmplante Edilen Hücrelerin Takibi: İmplante edilen lusiferaz ifade eden HepG2 hücrelerinin karaciğerdeki yerleşimi, canlılığı ve proliferasyonu, IVIS (In Vivo Imaging System) sistemi ile enjeksiyondan 3 hafta sonra başlanarak 6 hafta boyunca haftalık olarak takip edilmiştir. Biyolüminesans sinyallerinin tespiti sırasında emisyon filtresi açık ve eksitasyon filtresi bloklanmış konumda tutulmuştur. Görüntüleme hassasiyetini optimize etmek amacıyla binning değeri 8 (High Sensitivity - HS), görüş alanı (Field of View - FOV) 10 ve diyafram açıklığı f/1 olarak sabitlenmiştir. Her bir görüntüleme seansında sinyal kaydı 60 saniyelik pozlama süresi ile gerçekleştirilmiştir. Sinyal doygunluğunu önlemek ve verilerin doğruluğunu korumak için tüm ölçümlerde bu parametreler korunmuştur. Görüntülerin elde edilme sürecinde Andor iKon (IS1629N7008) kamera sistemi kullanılmıştır. Veri toplama, görselleştirme ve kümülatif analiz işlemleri Living Image (Sürüm 4.8.2) yazılımı aracılığıyla yürütülmüştür. Görüntüleme öncesinde her fareye 150 mg/kg dozunda D-Luciferin substratı intraperitonal (i.p.) olarak enjekte edilmiş ve enjeksiyondan 15 dakika sonra %2 izofloran gazı ile anestezi altında çekimler yapılmıştır.

Histopatolojik Değerlendirme: Deney hayvanlarının sakrifikasyonunu takiben elde edilen karaciğer doku örnekleri yapısal bütünlüğün korunması amacıyla %10 nötral tamponlu formalin solüsyonunda fikse edilmiştir. Fiksasyon işlemi sonrasında dokular standart histolojik doku takip protokollerine uygun olarak artan alkol serilerinden geçirilerek dehidrate edilmiştir. Ardından ksilen ile şeffaflandırma işlemi uygulanmış ve parafin ile infiltrasyonun ardından parafin bloklar haline getirilmiştir. Hazırlanan parafin bloklardan mikrotom kullanılarak 5 µm kalınlığında seri kesitler alınmıştır. Kesitler, genel doku morfolojisinin ve tümör odaklarının değerlendirilmesi amacıyla hematoksilen-eozin (H&E) yöntemi ile boyanarak ışık mikroskobunda incelenmiştir.

Örneklem Büyüklüğünün Belirlenmesi ve İstatistiki Analiz: Bu çalışmada, hücre dozu ve matrijel varlığının ana ve kombinasyon etkilerini istatistiksel olarak test etmek üzere 2x2 faktöriyel tasarım kurgulanmıştır. Örneklem büyüklüğü 3R ilkeleri gözetilerek hayvan sayısını minimize etmek amacıyla taşıyıcı kontrol grubu dahil toplam 5 gruptan oluşan deney planı için GPower yazılımında (3.1.9.4), ana etkilerin ve faktörler arası etkileşimlerin değerlendirildiği sabit etkili Varyans Analizi (ANOVA) temel alınarak A priori güç analizi ile hesaplanmıştır. İstatistiksel gücün en az %80 (Power=0.80) ve α=0.05 anlamlılık düzeyinde olduğu, büyük bir etki büyüklüğü (η2=0.24) hedeflenerek hesaplanan toplam 28 adet farenin bu tasarım için yeterli olacağı saptanmıştır.

Çalışma kapsamında elde edilen sayısal verilerin analizi ve görselleştirilmesi GraphPad Prism (Deneme Sürümü 10.6.1.892) ile R istatistiksel yazılım ortamında (v4.5.1) tidyverse paket ailesi kullanılarak gerçekleştirilmiştir ^14,15. In vitro lusiferaz aktivite verileri, teknik varyasyonları ortadan kaldırmak amacıyla modifiye edilmemiş kontrol grubu (HepG2) ortalamasına normalize edilmiştir. Normalize edilen veriler, biyolojik sinyallerin geniş dinamik aralığını stabilize etmek ve varyans homojenliğini sağlamak amacıyla y=Log(Y) formülü ile logaritmik olarak transforme edilmiştir. Verilerin normal dağılıma uygunluğu Shapiro-Wilk testi ile, varyansların homojenliği (eşitliği) ise F-testi ile kontrol edilmiştir. İki grup arasındaki farklar, transforme edilmiş veriler üzerinden Bağımsız Örneklem t-testi (iki kuyruklu) kullanılarak analiz edilmiştir. IVIS görüntüleme sisteminden elde edilen toplam sayım değerleri 6 haftalık ölçüm süresince sabit tutulan 60 saniyelik pozlama süresine bölünerek hesaplanmıştır. Her ölçüm noktasında kontrol grubuna ait arka plan sinyalleri çıkarılmıştır. Her bir deneğin 6 haftalık kümülatif biyolüminesans yükünü belirlemek amacıyla, zaman-sinyal grafiği üzerinden Eğri Altında Kalan Alan (EAA/AUC) değerleri trapezoidal yöntem kullanılarak hesaplanmıştır. Tüm analizlerde p<0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Veriler grafiklerde ortalama ± standart hata (SEM) olarak ifade edilmiştir.

Büyütmek İçin Tıklayın

Figure 1: Stabil HepG2-Luc hücre hattının in vitro lusiferaz aktivitesinin doğrulanması. Grafik, parental HepG2 (kontrol) ve lusiferaz ile transdükte edilmiş HepG2-Luc hücrelerinin normalize edilmiş ve Log10 dönüştürülmüş biyolüminesans sinyallerini göstermektedir.

Boylamsal Biyolüminesans Sinyal Kinetiği ve Heterojen Tümör Gelişiminin Değerlendirilmesi: Ortotopik HepG2 enjeksiyonu yapılan farelerde tümör gelişimi hücrelerin enjeksiyonunun 3 hafta sonrasında başlanarak 6 hafta boyunca haftalık olarak IVIS görüntüleme sistemi ile takip edilmiştir. Her bir deney grubundan seçilen temsili farelere ait 1, 3 ve 6. haftalardaki boylamsal biyolüminesans görüntüleri Figure 2'de sunulmuştur. IVIS görüntüleme sisteminden elde edilen veriler, İlgi Alanı (ROI) ölçümleri ile sayısal hale getirilerek her bir deneğin 6 haftalık sinyal yörüngesi/gidişatı analiz edilmiştir. Farklı hücre dozları ve matrijel varlığının sinyal kinetiği üzerindeki etkileri incelendiğinde, gruplar arasında heterojen bir dağılım gözlemlenmiştir (Figure 3).

Büyütmek İçin Tıklayın

Figure 2: Farklı deney gruplarındaki ortotopik tümör gelişiminin in vivo biyolüminesans görüntüleme (IVIS) ile takibi. Panelde, her bir deney grubunu ve 6 haftalık ölçüm sürecinin başını, ortasını ve sonunu temsil eden boylamsal görüntüler yer almaktadır. Görüntüler karaciğer bölgesindeki lusiferaz aktivitesini yansıtan biyolüminesans sinyallerini göstermektedir. Renk skalası foton sayısını ifade etmektedir. Kırmızı renk yüksek sinyal yoğunluğunu, mavi renk ise düşük sinyal yoğunluğunu belirtmektedir.

3(+) grubunda 2 farenin (kırmızı hat) sinyal şiddetinin 2. haftadan itibaren istikrarlı bir artış gösterdiği ve 6. haftada pik seviyeye ulaştığı belirlenmiş olup tümörün varlığı yalnızca kırmızı ile gösterilen tek bir farede histopatolojik değerlendirmeler sonucunda doğrulanabilmiştir. 2.5(-) grubunda da benzer şekilde bir farenin (kırmızı hat) sinyal seviyesinin diğer grup üyelerinden belirgin şekilde ayrışarak 5. haftada maksimum seviyeye (2000+sayım/sn) ulaştığı saptanmıştır. Yine histolojik değerlendirmeler ışığında 2.5(-) grubunda yalnızca bir farede tümör tespit edilebilmiştir. Diğer gruplardaki farelerin büyük çoğunluğunda sinyal şiddetinin zamanla bazal seviyeye indiği veya spesifik olmayan düşük genlikli dalgalanmalar sergilediği görülmüştür. Sinyal artışı gözlenen kırmızı ile işaretli bu iki fare, aynı zamanda doku kesitlerinde tümör odağı saptanan farelerdir.

Biyolüminesans sinyalinin zaman içerisindeki değişim kinetiğini ve büyüklüğünü eş zamanlı değerlendirmek amacıyla veriler polar koordinat sisteminde görselleştirilmiştir (Figure 4). Bu gösterimde, grafiklerin merkezi "0" sinyal noktasını (sinyalin yokluğu), dış çeperler ise artan sinyal yoğunluğunu temsil etmektedir. Zaman değişkeni (1.-6. Haftalar) ise dairesel eksende saat yönünde ilerlemektedir. 3(+) ve 2.5(-) gruplarında histopatolojik olarak doğrulanan tümörlü farelere ait sinyal yörüngelerinin (kırmızı çizgiler), haftalar ilerledikçe merkezden dışarıya doğru genişleyen bir spiral çizdiği görülmektedir. Bu dışa açılma hareketi, tümör yükünün kümülatif artışını görsel olarak doğrulamaktadır. Buna karşın tümör gelişiminin gözlenmediği diğer farelerde sinyal yörüngeleri merkeze (orijin noktasına) çakılı kalmış veya merkeze yakın dar bir alanda sınırlı dalgalanmalar göstermiştir.

Büyütmek İçin Tıklayın

Figure 3: Deney gruplarındaki bireysel farelerin 6 haftalık biyolüminesans sinyal değişimleri. Grafikler, dört farklı deney grubundaki her bir farenin "Haftalar" (X-ekseni) boyunca ölçülen biyolüminesans sinyal şiddetini (Y-ekseni, Sayım/sn) göstermektedir. Kırmızı çizgiler zamanla sinyal şiddeti artan ve tümör gelişiminin sürdüğü patoloji ile doğrulanan başarılı modelleri temsil etmektedir. Siyah çizgiler sinyalin zamanla kaybolduğu (regresyon) veya hiç oluşmadığı fareleri temsil eder. Düşük sinyal değişimlerinin görülebilmesi amacıyla Y-ekseni ölçekleri her grup için verinin aralığına göre (bağımsız olarak) ayarlanmıştır. 6 haftalık ölçüm boyunca sayım/sn değeri 0 olan farelerin hepsi gösterim kolaylığı açısından tek bir çizgi ile sunulmuştur.

Büyütmek İçin Tıklayın

Figure 4: Biyolüminesans sinyal yoğunluğunun zamana bağlı değişimini gösteren polar (radar) grafikler. Her bir deney grubu için oluşturulan grafiklerde dairesel eksen (1-6 arası numaralar) implantasyon sonrası haftaları; radyal eksen (merkezden dışa doğru) ise ölçülen sinyal şiddetini (Sayım/sn) temsil etmektedir.

Eğri Altında Kalan Alan (EAA/AUC) Analizi ile Kümülatif Tümör Yükünün Karşılaştırılması: Deney süresince (1-6. Haftalar) elde edilen boylamsal biyolüminesans sinyallerinin toplam büyüklüğünü karşılaştırmak amacıyla her bir fare için Eğri Altında Kalan Alan (EAA/AUC) değerleri hesaplanmıştır. Toplam sayım/sn üzerinden yapılan bu hesaplama, anlık ölçümlerden ziyade sürecin bütünündeki toplam tümör yükünü yansıtmaktadır (Figure 5). Özellikle 2.5(-) ve 3(+) gruplarında ortalama EAA değerlerinin diğer gruplara göre sayısal olarak daha yüksek olduğu ancak standart hataların büyük olduğu görülmüştür. Bu durum, ilgili gruplarda tümör geliştiren tekil farelerin (yüksek sinyal) ve geliştirmeyen farelerin (sıfır sinyal) bir arada bulunmasından kaynaklanan yüksek heterojeniteyi doğrulamaktadır. 2.5(+) grubunda yüksek EAA değerine sahip tekil bir fare olmakla beraber bu farede tümör tespit edilememiştir.

Büyütmek İçin Tıklayın

Figure 5: Deney gruplarının kümülatif potansiyel tümör yükünü gösteren EAA (Eğri Altında Kalan Alan) analizi. Grafik, 6 haftalık toplam biyolüminesans sayımının EAA değerlerini göstermektedir. Her bir nokta bireysel bir fareyi temsil etmektedir.

Histopatolojik Değerlendirme ve Tümör Morfolojisi: Mikroskobik analizler sonucunda 3(+) grubundaki 5 fareden 1'inde (%20) ve 2.5(-) grubundaki 6 fareden 1'inde (%16.7) karaciğer parankimi içerisinde tümör odağı tespit edilmiştir (Table 2). Tümör gelişimi saptanan olguların H&E ile boyanan karaciğer kesitlerinin ışık mikroskobik incelemesinde; normal karaciğer dokusu içerisinde sınırları seçilebilen, solid tabakalar ve düzensiz adalar oluşturan malign tümöral hücre proliferasyonu izlenmiştir (Figure 6). Tümör morfolojisi hücresel düzeyde incelendiğinde hücrelerin koyu eozinofilik boyanma gösteren orta genişlikte sitoplazmalara, hiperkromatik pleomorfik nukleuslara ve belirgin nukleollere sahip olduğu görülmüştür. Ayrıca tümöral alanlarda mitotik aktivitenin arttığı ve yer yer atipik mitozların varlığı dikkat çekmiştir.

Büyütmek İçin Tıklayın

Figure 6: H&E ile boyanmış karaciğer kesitinde solid paternli malign tümöral alanlar ve artmış mitotik aktivite izlenmektedir. Oklar mitozları göstermektedir.

Büyütmek İçin Tıklayın

Table 2: Ortotopik HepG2 Enjeksiyonu sonrası histopatolojik olarak doğrulanan tümör tutulum oranları.

Çalışmanın in vivo görüntüleme aşamasında, özellikle 2.5(+) ve 3(+) gruplarındaki bazı farelerde belirli zaman noktalarında lüminesans sinyali tespit edilmesine rağmen deneyin sonlandırılmasının ardından yapılan histopatolojik incelemelerde tümör dokusuna rastlanmamıştır. Radyometrik veriler ile histopatolojik bulgular arasındaki bu uyumsuzluk birkaç temel biyolojik ve teknik faktörle açıklanabilir. İlk olarak, biyolüminesans görüntüleme teknolojisi canlı hücrelerin metabolik aktivitesine dayalı son derece hassas bir yöntemdir ve çok düşük sayıda canlı hücre kümesini dahi tespit edebilir ¹⁶. Enjekte edilen hücrelerin solid bir kitle oluşturmak yerine karaciğer parankimi içerisinde mikro-odaklar halinde dağılması veya histolojik kesit düzleminin dışında kalan milimetrik boyutlarda kalması sinyal alınan farelerde dokunun negatif olarak raporlanmasına neden olabileceği düşünülmektedir. Ya da enjeksiyon hattından batın boşluğuna sızan az sayıdaki hücre periton sıvısı içinde canlılığını koruyarak IVIS görüntülemede karaciğer bölgesi de dahil olmak üzere sinyal verebilmekte ancak dokuya invaze olmadıkları için organın histopatolojik incelemesinde tespit edilememektedir ^17,18. Sonuç olarak bu gözlem tümör yükünün kesin tanısı için sadece radyometrik verilerin yeterli olmadığını, sinyal varlığının canlı hücreye işaret ettiğini ancak tümör varlığının mutlaka histopatolojik olarak doğrulanması gerektiğini bir kez daha ortaya koymaktadır.

Düşük engraftman oranı literatürde HepG2 hücre hattının in vivo tümör oluşturma kapasitesi üzerine süregelen tartışmalı verilerle örtüşmektedir ^19-22. HepG2 hücreleri, iyi diferansiye morfolojileri ve düşük metastatik potansiyelleri nedeniyle in vitro çalışmalar için standart bir model kabul edilse de in vivo ksenograft modellerinde değişken ve genellikle düşük tümör oluşturma başarısına sahip olduğu çeşitli araştırmacılar tarafından rapor edilmiştir ^23,24. Bu bağlamda çalışmadan elde edilen bulgular, HepG2 kaynaklı ortotopik modellerin kurulumundaki doğal zorlukları deneysel olarak doğrulamaktadır. Çalışmada matrijel kullanımı tümör tutulum oranlarında veya tümör büyüme kinetiğinde bir artış sağlayamamıştır. Literatürde matrijelin büyüme faktörleri açısından zengin içeriği sayesinde tümör mikroçevresini desteklediği ve engraftman başarısını artırdığı bilinse de bu etkinin hücre hattının içsel invazyon kapasitesine sıkı sıkıya bağlı olduğu görülmektedir ^25,26. HepG2 hücre hattının in vivo modellerdeki davranışı üzerine yapılan karşılaştırmalı çalışmalar, bu hücrelerin yüksek oranda diferansiye epitelyal fenotipe sahip olduğunu ve E-kadherin ekspresyonunun yüksekliği nedeniyle hücre-hücre yapışıklığının korunup dokuya invaze olma yeteneğinin kısıtlandığını göstermektedir ²⁷. Bulgularımızdaki düşük tutulum oranı HepG2 hücrelerinin non-tümörijenik ile düşük tümörijenik arasındaki gri bölgede yer aldığına dair literatürdeki tartışmalı görüşleri destekler niteliktedir ^24,28. Bazı araştırmacılar, HepG2 ile başarılı ksenograft modelleri oluşturabilmek için çok daha ağır immün yetmezlikli farelerin (NOD/SCID veya NSG gibi) veya cerrahi implantasyon tekniklerinin (solid tümör parçasının dikilmesi gibi) gerekliliğini savunmaktadır ²⁹. Bizim bulgularımız süspansiyon enjeksiyon yöntemiyle HepG2 kullanımının, J:NU outbred atimik çıplak farelerinde ortotopik hepatoblastoma modellemesi için verimli bir yaklaşım olmadığını, bunun yerine agresif fenotipe sahip alternatif hatların tercih edilmesi gerektiğini literatürde ilk defa deneysel olarak ortaya koymaktadır.

Teşekkür: Bu çalışmada kullanılan Lenti-luciferase-P2A-Neo (Addgene, plazmid no: 105621) plazmidini sağlayan Dr. Öğr. Üyesi Gözde KORKMAZ'a ve IVIS Biyolüminesans ölçümlerindeki teknik desteğinden dolayı Özlem BEYDİLLİ'ye teşekkür ederiz.

1) Danpanichkul P, Pang Y, Auttapracha T, et al. Rising incidence of early-onset liver cancer and intrahepatic bile duct cancer: Analysis of the national childhood cancer registry database. Cancers (Basel) 2025; 17: 1133-1144.rn

2) Choi JH, Ro JY. Combined hepatocellular-cholangiocarcinoma: An update on pathology and diagnostic approach. Biomedicines 2022; 10: 1826-1843.rn

3) Pio L, O'Neill AF, Woodley H, et al. Hepatoblastoma. Nat Rev Dis Primers 2025; 11: 36-53.rn

4) Litten JB, Tomlinson GE. Liver tumors in children. Oncologist 2008; 13: 812-820.rn

5) Zsíros J, Maibach R, Shafford E, et al. Successful treatment of childhood high-risk hepatoblastoma with dose-intensive multiagent chemotherapy and surgery: Final results of the SIOPEL-3HR study. J Clin Oncol 2010; 28: 2584-2590.rn

6) Meyers RL, Rowland JR, Krailo M, et al. Predictive power of pretreatment prognostic factors in children with hepatoblastoma: A report from the children's oncology group. Pediatr Blood Cancer 2009; 53: 1016-1022.rn

7) Espinoza AF, Patel KR, Shetty PB, et al. Navigating relapsed hepatoblastoma: Predictive factors and surgical treatment strategy. Cancer Med 2023; 12: 21270-21278.rn

8) Stribbling SM, Beach C, Ryan AJ. Orthotopic and metastatic tumour models in preclinical cancer research. Pharmacol Ther 2024; 257: 108631-108646.rn

9) Ellerkamp V, Armeanu-Ebinger S, Wenz J, et al. Successful establishment of an orthotopic hepatoblastoma in vivo model in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull Mice. PLoS One 2011; 6: e23419.rn

10) Aden DP, Fogel A, Plotkin S, Damjanov I, Knowles BB. Controlled synthesis of HBsAg in a differentiated human liver carcinoma-derived cell line. Nature 1979; 282: 615-616.rn

11) Arzumanian VA, Kiseleva OI, Poverennaya EV. The curious case of the HepG2 cell line: 40 years of expertise. Int J Mol Sci 2021; 22: 13135.rn

12) Chen Y, Chen Z, Feng JH, et al. Metabolic profiling of normal hepatocyte and hepatocellular carcinoma cells via 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy. Cell Biol Int 2018; 42: 425-434.rn

13) Ao L, Guo Y, Song X, et al. Evaluating hepatocellular carcinoma cell lines for tumour samples using within-sample relative expression orderings of genes. Liver Int 2017; 37: 1688-1696.rn

14) Chambers JM. Object-oriented programming, functional programming and R. Stat Sci 2014; 29: 167-180.rn

15) Wickham H, Averick M, Bryan J, et al. Welcome to the tidyverse. J Open Source Softw 2019; 4(43): 1686.rn

16) Mezzanotte L, van 't Root M, Karatas H, Goun EA, Löwik CWGM. In vivo molecular bioluminescence imaging: New tools and applications. Trends Biotechnol 2017; 35: 640-652.rn

17) Rao Q, You A, Guo Z, et al. Intrahepatic tissue implantation represents a favorable approach for establishing orthotopic transplantation hepatocellular carcinoma mouse models. PLoS One 2016; 11: e0148263.rn

18) Zeamari S, Rumping G, Floot B, Lyons S, Stewart FA. In vivo bioluminescence imaging of locally disseminated colon carcinoma in rats. Br J Cancer 2004; 90: 1259-1264.rn

19) Woodfield SE, Shi Y, Patel RH, et al. A novel cell line based orthotopic xenograft mouse model that recapitulates human hepatoblastoma. Sci Rep 2017; 7: 17751-17761.rn

20) Wu Y, Ma Y, Xu Z, et al. Sodium orthovanadate inhibits growth of human hepatocellular carcinoma cells in vitro and in an orthotopic model in vivo. Cancer Lett 2014; 351: 108-116.rn

21) Wang W, Iyer NG, Tay HT, et al. Microarray profiling shows distinct differences between primary tumors and commonly used preclinical models in hepatocellular carcinoma. BMC Cancer 2015; 15: 828-837.rn

22) Li H, Feng Z, Tsang TC, et al. Fusion of HepG2 cells with mesenchymal stem cells increases cancer-associated and malignant properties: An in vivo metastasis model. Oncol Rep 2014; 32: 539-547.rn

23) Song Y, Lu Q, Jiang D, Lan X. Validation and utility of HepG2 xenograft model for hepatocellular carcinoma. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2022; 50: 639-641.rn

24) Shouval D, Schuger L, Levij IS, et al. Comparative morphology and tumourigenicity of human hepatocellular carcinoma cell lines in athymic rats and mice. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol 1988; 412: 595-606.rn

25) Benton G, Kleinman HK, George J, Arnaoutova I. Multiple uses of basement membrane-like matrix (BME/Matrigel) in vitro and in vivo with cancer cells. Int J Cancer 2011; 128: 1751-1757.rn

26) Fliedner FP, Hansen AE, Jørgensen JT, Kjær A. The use of matrigel has no influence on tumor development or PET imaging in FaDu human head and neck cancer xenografts. BMC Med Imaging 2016; 16: 5-12.rn

27) Jiao W, Miyazaki K, Kitajima Y. Inverse correlation between E-cadherin and Snail expression in hepatocellular carcinoma cell lines in vitro and in vivo. Br J Cancer 2002; 86: 98-101.rn

28) Labonté P, Kadhim S, Bowlin T, Mounir S. Inhibition of tumor growth with doxorubicin in a new orthotopically implanted human hepatocellular carcinoma model. Hepatol Res 2000; 18: 72-85.rn

29) Zhang W, Sun HC, Wang WQ, et al. Sorafenib down-regulates expression of HTATIP2 to promote invasiveness and metastasis of orthotopic hepatocellular carcinoma tumors in mice. Gastroenterology 2012; 143: 1641-1649.