Deneylerde 28 adet erkek rat kullanıldı: Grup1 (n=7) (kontrol, 5 hafta bazal diyet alan grup), Grup2 (n=7) (5 hafta bazal diyet+oral soy izoflavon (Diyette 100mg/kg) alan grup, Grup3 (n=7) (5 hafta i.p. haftada 3 gün 0,15 ml/100g ¾ oranında zeytin yağı içinde CCL₄ uygulanan ve bazal diyet alan grup), Grup4 (n=7) (5 hafta i.p.olarak haftada 3 gün 0,15 ml/100g ¾ oranında zeytin yağı içinde CCL₄ uygulanan ve oral soy izoflavon (Diyette 100mg/kg) alan grup). Plazma malondialdehit (MDA), paraoksonaz, arilesteraz ve diğer biyokimyasal parametreler uygun metodlarla ölçüldü.

Plazma MDA düzeyleri grup3 de; grup1,2 ve grup 4’den anlamlı olarak yüksek olup (sırasıyla p<0.01, p<0.01, p<0.05). Karaciğer doku MDA düzeyleri ise grup3 de; grup 1,2 ve grup4 ile karşılaştırıldığında anlamlı olarak yüksek bulundu (p<0.01). Grup4 ile grup3 karşılaştırıldığında plazma ve karaciğer doku MDA düzeylerinde anlamlı bir azalma olduğu gözlendi (P<0.05). Plazma paraoksonaz ve arilesteraz düzeyleri grup3 de, grup1 ve grup 4 ten anlamlı olarak daha düşüktü (P<0.05). Grup3 ve grup4 arasında MDA düzeyleri ve plazma paraoksonaz düzeyleri arasında negatif bir korelasyon vardı (r:-0.5378, p<0.01, r: -487 p<0.01).

Bulgularımız soy izoflavonların antioksidatif etkinliğe sahip olduğu ve soy izoflavon uygulamasının oksidatif hasarı önlemede paraoksonaz gibi bazı antioksidan özelliğe sahip enzimleri de stimule ederek etkili olduğunu düşündürmektedir.

CCI₄’ e bağlı karaciğer hasarında meydana gelen lipit peroksidasyonu oldukça önemlidir ^3,4. Çünkü bu hasara bağlı olarak ilerleyen süreç sonunda karaciğer fibrozu ve siroz oluşabilir. Karaciğer fibrozu, ekstrasellüler matriks komponentlerinin artması ile karakterize, dinamik bir süreçtir. Ekstrasellüler matriksin yapımı ve yıkımı arasındaki denge; oluşan toksik oksijen radikallerine bağlı olarak, potent profibrojenik mediatörlerin de aktive olması ile sürekli matriks yapımı yönünde bozulmaktadır ⁵. Yapılmış olan bir çok çalışmada karaciğer hastalıklarında oksidatif stres ve buna bağlı olarak ortaya çıkan karaciğer hasarı ile fibrozis arasında ilişki olduğu gösterilmiştir ^6,7. Yapısında major olarak flavonoid ve terpenoidleri içeren Gingko biloba ekstraktı (EgB761) uygulamasının, CCI₄ ile deneysel karaciğer hasarı oluşturulmuş ratlarda lipit peroksidasyonunu inhibe ettiği rapor edilmiştir ⁸. Yine ratlarda CCI₄ ile oluşturulan hepatoksisiteye karşı Ginseng bileşiklerinin de koruyucu antioaksidan özellikler gösterdiği rapor edilmiştir ⁹.

Fitoöstrojenler ailesinden; soy izoflavonların konjuge halka yapıları ve hidroksil grupları sayesinde potansiyel antioksidan olarak, superokside anyonları ve lipid peroksid radikallerini temizledikleri ve serbest radikaller ile ilişkili olaylarda hidrojenasyon veya kompleks yapılar oluşturarak okside edici ajanları stabilize edebildikleri gösterilmiştir ^8,10,11,12. Soy izoflavonlar kanser ve çeşitli hastalıkların oluşumunda rol alan oksidan yapıları yok ederek, antioksidan enzimlerin aktivitelerini stimule ederek ^13, intraselluler oksidatif stresi azaltarak, nitrik oksit ve peroksit radikalleri de direkt olarak temizleyerek etkili olabilmektedirler ¹⁴. Ayrıca flavonoidlerin hiperkolesterolemik ratlarda antioksidan etkiler gösterdiği ve koruyucu olduğu rapor edilmiştir ¹⁵. Soy izoflavonların bu özelikleri yanı sıra düşük dansiteli lipoproteinlerin (LDL) oksidasyonunun önlenmesinde etkili oldukları ve bu etkilerini direkt veya indirekt gösterebildikleri ileri sürülmüştür. LDL oksidasyonun önlenmesinde yüksek dansiteli lipoproteinler (HDL) aracığılıyla gerçekleşen olaylarda antioksidan bir enzim olan paraoksonaz enzimi önemli bir rol oynamaktadır ^16,17.

Bu çalışmada taşımış oldukları fonksiyonel hidroksil grupları açısından önemli olan genistein, daidzein ve glycteinden oluşan major soy izoflovanların, ratlarda CCL₄ ile deneysel olarak oluşturulmuş karaciğer hasarı üzerindeki etkileri ve plazma paraoksonaz ile arilesteraz enzim düzeyleri arasındaki ilişkileri araştımak amaçlanmıştır.

Ratlar eşit sayıda 4 gruba bölündü: Grup1 (n=7) (kontrol, 5 hafta sadece bazal diyet alan grup), Grup2 (n=7) (5 hafta bazal diyet+oral soy izoflavon (Diyette 100mg/kg) alan grup, Grup3 (n=7) (5 hafta i.p. olarak haftada 3 gün 0,15 ml/100g ¾ oranında zeytin yağı içinde CCL₄ uygulanan ve sadece bazal diyet alan grup), Grup4 (n=7) (5 hafta i.p. olarak haftada 3 gün 0,15 ml/100g ¾ oranında zeytin yağı içinde CCL₄ uygulanan ve oral soy izoflavon (Diyette 100mg/kg) alan grup).

Çalışma gruplarına içerisine major soy isoflovanlar olan genistein (5,7,4-trihidroksi izoflavon), daidzein (7,4-dihidroksi izoflavon) ve glyctein (7,4-dihidroksi6-metoksi izoflavon) katılmış özel olarak hazırlanmış yem verilmiştir (Tablo I).

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: Çalışma gruplarına verilen yem içeriği ve soy izoflavon içerikleri

Plazma MDA ölçümleri
Plazma MDA düzeyleri Satoh ¹⁸ ve Yagi ¹⁹ tarafından modifiye edilmiş olan tiyobarbitürik (TBA) asit metodu ile ölçüldü. Metod lipid peroksidasyonunun aldehit ürünlerinden biri olan MDA ve TBA arasındaki reaksiyon sonucu oluşan pembe renkli kompleksin 532 nm dalga boyunda spektrofotometrik olarak ölçülmesi esasına dayanmaktadır. Sonuçlar nmol/ml olarak verildi.

Doku homojenizasyonu ve karaciğer doku MDA ölçümleri
Alınan doku örnekleri soğuk % 0.9 NaCl ile yıkandıktan sonra ıslaklığı alınarak tartımı yapıldı ve çalışma yapılıncaya kadar –70 Cº de derin dondurucuda saklandı. Çalışma esnasında 1 gram doku başına 9 ml % 1.15 ‘lik KCl (1/10 oranında) olacak şekilde homojenat hazırlandı. Hazırlanan homojenattan lipit peroksidasyonun son ürünlerinden olan MDA düzeyleri, Ohkawa ve ark. ²⁰ tarafından belirlenen metodla spektrofotometrik olarak ölçüldü. Ölçüm prosedüründe; 0.2 ml % 10 (w/v) doku homojenatına, 0.2 ml % 8.1 sodyum dodesil sülfat (SDS) ve 1.5 ml % 20 asetik asit solusyonundan eklendi. Ardından 1.5 ml %0.8 aköz TBA solusyonundan eklenerek son hacim 4 ml olacak şekilde distile su eklendi. 95 C sıcaklıkta kaynar su banyosunda inkubasyondan sonra çeşme suyu ile soğutularak 1 ml distile su ve 5 ml n-butanol-piridin karışımından (15:1 v/v) konuldu. Santrifüj edildikten sonra üst kısımdaki organik tabaka alınarak 532 nm dalga boyunda spektrofotometrik olarak ölçüm yapıldı. Sonuçlar nmol/g doku olarak verildi.

Plazma Paraoksonaz ve Arilesteraz ölçümü
Plazma paraoksonaz aktivitesi ölçümü substrat olarak kulanılan paraoksonun enzimatik hidrolizi sonucu oluşan 4-nitrofenolün ölçümü esasına dayanan Ruiz ve ark ²¹ metodu ile ölçüldü. Plazma paraoksonaz düzeyleri; 2 mmol/L CaCl₂, 1 mol/L NaCl ve 2 mmol/L paraokson (O-O-dietil-O-p-nitrofenilfosfat) içeren 0.1 mol/L pH:8 Tris-HCl buffer çözeltisi kullanılarak; 1400 µl bu reaktif karışımına 40 µl serum örneğinin ilave edilmesiyle oluşan 4-nitrofenolün 412 nm’de spektrofotometrik olarak ölçülmesi ile belirlendi.

Plazma arilesteraz aktivitesi ise substrat olarak kullanılan fenilasetatın enzimatik hidrolizi sonucu oluşan fenolün ölçümü esasın dayanan Juretic ve ark ²² metodu ile ölçüldü. 2 mmol/L CaCl₂, 2 mmol/L fenilasetat içeren 0.1 mol/L pH:8 Tris-HCl buffer çözeltisi kullanılarak; 1500 µl bu reaktif karışımına 10 µl 1/50 dilüe serum örneğinin ilave edilmesiyle oluşan fenolün 270 nm’de spektrofotometrik olarak ölçülmesi ile belirlendi.

İstatistiksel değerlendirme
Çalışma sonucunda elde edilen veriler ortalama±standart sapma olarak verildi. Parametrelerin gruplar arasındaki değerlendirilmesinde tek yönlü varyans analiz testi, Kruskal Wallis, ikili karşılaştırmalarda ise Mann Whitney-U testi ile değerlendirme yapıldı. Ayrıca bazı parametreler için Pearson Spearman korelasyon testleri kullanıldı. İstatistik değerlendirmeler SPPS 11.0 paket program kullanılarak yapıldı.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 2: Çalışma gruplarında elde edilen bazı biyokimyasal parametreler

CCL₄ uygulanmış ratlarda plazma MDA düzeylerinin, kontrol grupları ve CCL₄ ile birlikte soy izoflavon verilen grupla karşılaştırıldığında anlamlı olarak yüksek olduğu gözlendi (sırasıyla b P<0.01 (grup 3-1 ve grup3-2) ve a P<0.05 (grup3-4)). (Tablo III). Karaciğer doku MDA düzeyleri de CCL₄ uygulanan grupta, kontrol gruplarına göre anlamlı olarak yüksekti (b P<0.01, (grup 3-1 ve grup3-2)). CCL₄ ile birlikte soy izoflavon uygulanan grupta karaciğer doku MDA düzeylerinin ise soy izoflavon verilen kontrol grubuna göre anlamlı olarak yüksek iken (a P<0.05, (grup 4-2)), CCL₄ uygulanan grupla kıyaslandığında ise karaciğer doku MDA düzeylerinde anlamlı bir azalma olduğu gözlendi (a P<0.05 (grup 4-3)) (Tablo III, Şekil 1, Şekil 2).

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 3: Çalışma gruplarında elde edilen plazma ve karaciğer doku MDA düzeyleri ile plazma paraoksonaz ve arilesteraz düzeyleri

Büyütmek İçin Tıklayın

Sekil 1: Çalışma gruplarında plazma MDA düzeyleri (a P<0.05 Grup 4 vs 1, 3, b P<0.01 Grup 3 vs 1, 2)

Büyütmek İçin Tıklayın

Sekil 2: Çalışma gruplarında karaciğer doku MDA düzeyleri (a P<0.05 Grup 4 vs 2, b P<0.01 Grup 3 vs 1,2)

Plazma paraoksonaz aktivite düzeylerinin kontrol grubunda, sadece CCL₄ verilen gruba göre anlamlı olarak yüksek olduğu gözlendi (a P<0.05, (grup 1-3). Plazma paraoksonaz düzeyleri, soy izoflavon verilen kontrol grubunda; kontrol grubu ve sadece CCL₄ verilen gruba göre anlamlı olarak yüksekti (b P<0.05, (grup 2-1), c P<0.001 (grup 2-3)). Sadece CCL₄ uygulanan gruptaki plazma paraoksonaz düzeyleri ise CCL₄ ile birlikte soy izoflavon verilen grup ile kıyaslandığında anlamlı olarak düşüktü (c P<0.001 (grup 3-4)) (Tablo III, Şekil 3, Şekil 4).

Büyütmek İçin Tıklayın

Sekil 3: Çalışma gruplarında plazma paraoksonaz düzeyleri (a P<0.05 Grup 1-3, b P<0.05 Grup 2 vs 1, c P<0.001 Grup 3 vs 2 ,4)

Büyütmek İçin Tıklayın

Sekil 4: Çalışma gruplarında plazma arilesteraz düzeyleri (a P<0.05 Grup 2 vs 1, b P<0.01 Grup 3 vs 2,4)

Plazma arilesteraz düzeylerinin ise sadece CCL₄ uygulanan grupta; diğer gruplara göre anlamlı olarak düşük olduğu gözlendi (sırasıyla, a P<0.05 (grup3-1), b P<0.01 (grup 3-2 ve grup3-4)).

CCL₄ uygulanmış grupta plazma MDA düzeyleri ve paraoksonaz düzeyleri arasında negatif yönde anlamlı bir korelasyonun olduğu gözlendi. (r:-0.537, p<0.01).

CCL₄ ile birlikte soy izoflavon uygulanmış grupta özellikle plazma MDA düzeyleri ve paraoksonaz düzeyleri karşılaştırıldığında da negatif yönde anlamlı bir korelasyonun olduğu gözlendi (r:-487 p<0.01)

Histopatolojik bulgular
Tablo IV de görüldüğü gibi CCL₄ uygulanmış grupta yağlanma (steatozis) derecelerine bakıldığında sadece CCL₄ verilmiş gruptaki steatozisin, soy izoflavon uygulamasıyla anlamlı olarak gerilediği görülmüştür (a P<0.05, (grup 3-4)). Ayrıca CCL₄ uygulanmış grup inflamasyon ve nekroz açısından değerlendirildiğinde artmış olan inflamasyon ve nekrozun, CCL₄ ile brlikte soy izoflavon verilen grupta anlamlı olarak azaldığı (a P<0.05 (grup3-4), b P<0.01 (grup3-4)), yine CCL₄ uygulanmış gruptaki fibrozisinde soy izoflavon uygulaması ile anlamlı olarak gerilediği gözlendi (b P<0.01 (grup3-4)) (Tablo IV, Şekil 5, Şekil 6).

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 4: Çalışma gruplarında elde edilen histopatolojik bulgular

Büyütmek İçin Tıklayın

Sekil 5: CCL4 uygulanmış ratlarda karaciğer dokusunda fibrozis ve inflamasyon hidropik dejenerasyon ve yağlanma (Massaon Trichrom X200)

Büyütmek İçin Tıklayın

Sekil 6: CCL4 uygulanmış ve soyizoflavan verilmiş ratlarda karaciğer dokusu görünümü, fibrozisde azalma (Massaon Trichrom X200).

Çalışmamızda CCL₄ uygulanmış ratlarda artmış olan lipit peroksidasyonuna bağlı karaciğer hasarı sonucunda karaciğer enzimlerinden AST ve ALT düzeyleri anlamlı olarak artarken bu artışların soy izoflavon uygulaması ile düştüğü gözlenmiştir. Ayrıca CCL₄ uygulanmış ratlarda karaciğer dokusunda artmış olan inflamasyon ve nekrozun da soy izoflavonla gerilediği görülmektedir. İnflamasyon, toksik maddeler ve ilaçlara bağlı olarak ortaya çıkan süreç karaciğer hasarında oldukça önemli bir rol oynamaktadır. Bu süreçte özellikle serbest oksijen radikalleri ve artmış hidrojen peroksit gibi prooksidan yapılar ile birlikte profibrojenik yapılı bazı mediatörlerde hasarı artırmaktadır. Bu açıdan bakıldığında hücresel oksijenazları, NADPH oksidaz veya hücresel antioksidantları aktive etmek yoluyla veya antioksidan enzimlerin aktivasyonu ile oksidatif hasarın engellenmesinde antioksidan özelliklere sahip soy izoflavonlar gibi bileşiklerin kullanılması oldukça önemlidir ²⁹.

Aneja ve ark ³⁰ tarafından yapılan bir çalışmada, fitoöstrojenlerden Genistein ve daidzein uygulaması sonucunda CCL₄’e bağlı karaciğer hasarından hepatik glutatyon-S transferaz ve antioksidan hepatik glutatyon aracılığı ile korunduğu ve lipid peroksidasyonunu önlediği rapor edilmektedir. Belinky ve ark ³¹ bir soy izoflavon olan Glabridinin,bakır iyonları ve 2,2 %-azobis (2-amidino-propane) dihydrochloride (AAPH) gibi bileşikleri indükleyerek lipid peroksidasyonunu ve oksisterol oluşumunu inhibe ettiğini,bu şekilde LDL oksidasyonunu önlediğini bildirmektedirler.

De Whalley ve ark ³² ise diyette bulunan flavon ve flavonol türevlerinin makrofajlar aracılığıyla meydan gelen LDL oksidasyonunu önemli ölçüde inhibe ettiğini bildirmektedir. Mangiapane ve ark.³³ da doğal olarak oluşan ve bir flavonol türevi olan kateşinin arterial hücre duvarında bakır iyonları ile oluşan LDL oksidasyonunu inhibe ettiğini rapor etmektedir. Bütün bu çalışmalara bakıldığında; soy izoflavonların oksidatif hasarı geriletmesi yanında LDL oksidasyonunu da önlediği, ancak bunun tam olarak hangi mekanizmalar ile olduğu konusunun net olmadığı görülmektedir. Bu açıdan ele alındığında; kalsiyum bağımlı, HDL kolesterol içeren bir enzim olan ve başta LDL kolesterol olmak üzere plazma lipoproteinlerini serbest oksijen radikallerine bağlı oksidasyondan koruyan antioksidan bir enzim olan paraoksonaz enzimi üzerinde durmak gerekir. Paraoksonaz, lipit peroksitleri ve hidrojen peroksit (H₂O₂) gibi potent oksidant yapıları enzimatik reaksiyonlarda substrat olarak kullanabilir. H₂O₂ özellikle aterogenezis sırasında arter duvarı endotelde oluşan major bir reaktif oksijen bileşikleri (ROS) türüdür ve LDL oksidasyonuna yol açarak daha potent oksidatif ürünler oluşumuna yol açabilmektedir. Bu yüzden paraoksonaz enziminin H₂O₂ hidrolize edebilme yeteneği özellikle potent antioksidan yapıların ortadan kaldırılmasında önemli bir rol oynamaktadır ²⁷.

Çalışmamızda da yoğun olarak HDL kolesterole bağlı olarak bulunan ve özellikle lipid peroksidleri hidrolize eden bir antioksidant enzim olarak tanınan paraoksonaz düzeyleri ve plazma arilesteraz düzeylerinin CCL₄ uygulanan grupta azaldığı, soy izoflavon uygulaması sonucunda ise bu enzimlerin plazma düzeylerinde anlamlı artışlar olduğu ve stimule olduğu gözlendi.

Bazı çalışmalarda doğal antioksidan yapılar olan Vitamin C ve folik asit eklenmesinin paraoksonaz aktivitesini ve arilesteraz aktivitesini arttırdığı rapor edilmektedir ³⁴. Bir başka çalışmada Jesup ve ark ³⁵ LDL oksidasyonunun endojen lipofilik antioksidan yapılı bileşiklerin (vitE, beta- karoten ve likopen vb) azalmasından sonra başladığını bildirmektedirler. Ayrıca yüksek kolesterol içeren diyetle beslenme ve buna bağlı olarak artan lipit peroksid düzeylerinin paraoksonaz enzim aktivitesinde inaktivasyona neden olduğunu belirten çalışmalar da bulunmaktadır ³⁶. Karaciğer hasarı oluşumu sırasında ROS üretiminde meydana gelen aşırı artış ve buna bağlı olarak antioksidan enzimler olan SOD ve GSH-Px düzeylerinde anlamlı azalmalar olmaktadır. Dolayısı ile antioksidan enzimler ile karaciğer hasarı, fibrosiz ve lipid peroksidasyon düzeyleri arasında ters bir korelasyon olduğu gözlenmektedir ^37,38. Çalışmamızda da CCL₄ uygulanmış grupta artmış olan MDA düzeylerinin plazma paroksonaz düzeyleri ile ters bir korelasyon gösterdiği ve soy izoflavon uygulanmış grupta stimule edilmiş olan paraoksonaz enziminin artmış MDA düzeylerini anlamlı olarak düşürdüğü gözlenmiştir.

Bu sonuçlarla soy izoflavonların deneysel olarak oluşturulmuş CCL₄ hasarına bağlı olarak gelişen karaciğer harabiyetini önlemede etkili olduğu, artmış olan lipit peroksidasyon ürünlerini azalttığı ve soy izoflavonların antioksidan özelliğe sahip paraoksonaz enzimini stimule edici bir etkisi olduğu da görülmektedir.

1) Recknagel R, Glende EA, Dolak JA, Waller RL. Mechanisms of carbon tetrachloride toxicity. Pharma Ther 1989; 43: 139-154.

2) Slater TF. Free radicals as reactive intermediates in injury. In: R Snyder, DV Parke, JJ Kocsis, DJ Jollow, GG Gebson, CM Witmer (Eds). Biological Reactive Intermediates II: Chemical Mechanisms and Biological Effects. New York, Plenum Press, 1982: 575-589.

3) Nadkarni GD, Souza NB. Hepatic antioxidant enzymes and lipid peroxidation in carbon tetrachloride-induced liver cirrhosis in rats. Biochem Med and Met Biol 1988; 40: 42-5.

4) Parola M, Rubio M, Varela G, et al. Effects of S-adenosylmethionine on lipid peroxidation and liver fibrogenesis in carbon tetrachloride-induced cirrhosis. J Hepatol 1996; 25: 2000- 2005.

5) Lee RG. Fibrosis and cirrhosis. Diagnostic Liver Pathology.First Ed. Mosby-ear Book Inc 1994; 280-304.

6) Shimiziu I. Antifibrogenic therapies in Chronic HCV infection. Current Drug Targets Infectious Disorders. 2001; 1 (2): 227-240.

7) Shimiziu I. Impact of estrogens on the progression of liver disease. Liver International 2003; 23 (1):63-69.

8) Bahcecioglu IH, Ustundag B, Ozercan IH et al. Protective effect of Ginkgo Biloba extract on CCl₄- induced liver damage. Hepatology Research 1999; 15: 215-224.

9) Jeong TC, Kim HJ, Park J, Ha CS, et al. Protective effects of red ginseng saponins against carbon tetrachloride induced hepatotoxicity in sprague dawley rats. Planta Med 1996; 63:136-140.

10) Nagata H, Takekoshi S, Takagi T, Honma T &Watanabe K. Antioxidative action of flavonoids quarcetin and catechin mediated by the activation of glutathione peroxidase. Tokai J Expe Clin Med. 1999; 24 (1),1-11.

11) Kelly E. Heim, Anthony R. Tagliaferro, Dennis J. Bobilya. Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and structure-activity relationships J of Nutritional Biochemistry 2002; 13: 572–584.

12) Kulling SE, Lehmann L, Metzler M. Oxidative metabolism and genotoxic potential of major isoflovane phytoestrogens. J of Chromotoghraphy 2002; 777: 211-218.

13) Cai Q and Wei H. et al. Effect of dietary gensitein on antioxidant enzyme activities in SENCAR mice . Nutrition Cancer 1996; 25: 1-7.

14) Chunyeon Choi, Hyeyeon Cho. et al. Supressive effects of genistein on oxidative stres and NF-kB activation in RAW 264.7 Macrophages. Biosci Biotech Biochem 2003; 67 (9): 1916-1922.

15) L.Anila, N.R. Vijayalakshmi. Antioxidant action of flavonoids from Mangifera indica and Emblica officinialis in hypercholesterolemic rats, Food and Chemistry , 2003; 83: 569-574.

16) Mackness MI, Mackness B, Durrington PN, Connelly PW, Hegele RA. Paraoxonase: biochemistry, genetics and relationship to plasma lipoproteins. Curr Opin Lipidol 1996; 7:69–76.

17) Watson A, Berliner JA, Hama SY, et al. Protective effect of high density lipoprotein associated paraoxonase: inhibition of the biological activity of minimally oxidized low density lipoprotein. J Clin Invest 1995; 96: 2882–2891.

18) Satoh K. Serum lipid peroxide in cerebrovascular disorders determinde by a new colorimetric method. Clin Chim Acta. 1978; 90:37-43.

19) Yagi K.Assay of lipide peroxidation in blood plasma and serum.Methods Enzmology 1984;105; 328-363.

20) Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Analytical Biochemistry 1979; 95; 351-358.

21) Ruiz J, Blanche H, James RW, et al. Gln-Arg 192 polymorphysm of paraoxonase and coronary heart disease in y-type 2 diabetes. Lancet 1995, 346;869-872.

22) Juretic D, Tadjanovic M, Rekic B, et al. Serum paraoxonase activities in hemodialyzed uremic patients. Cohort study Croat Med J 2001; 42: 146-150.

23) Muriel P, Escobar Y. Kupffer cells are responsible for liver cirrhosis induced by carbon tetrachloride .Journal of Applied Toxicology 2003; 23 (2): 103-108.

24) Luckey SW, Peterson DR. Activation of kupffer cells during the course of carbon tetrachloride induced liver injury and fibrosis in rats. Experimental and Molecular Pathology 2001; 71 (3): 226-240.

25) Wang H, Wei W, Wang NP, et al.Melatonin ameliorates carbontetrachloride-induced hepatic fibrogenesis in rats via inhibition of oxidative stres. Life Sci 2005; 77:1902-1915.

26) Jeon Tae IL, Hwang SG, Park NG, et al. Antioxidative effect of Chitosan on chronic carbon tetrachloride induced heaptik injury in rats. Toxicology 2003; 187: 67-73.

27) Me Kyung Lee, Hae Bok S, Jeong TS, et al. Supplemnetation of Naringenin and its synthetic derivative alters antioxidant enzyme activities of erythrocyte and liver in high Cholesterol fed rats. Biorganic and Medicinal Chemistry 2002; 10: 2239-2244.

28) Rodriguez RJ, Miranda CL, Stevens JF, Deinzer ML, Buhler DR. Influence of prenylated and non prenylated flavonoids on liver microsomal lipid peroxidation and oxidative injury in rat hepatocytes. Food and Chemical Toxicology 2001; 39: 437-445.

29) Fuhrman B and Aviram M. Flavonoids protect LDL from oxidation and attenuate atherosclerosis. Current Opinion in Lipidology 2001; 12 (1); 41-48.

30) Aneja R and Upadhyaya G. Ameliorating effect of Phtoestrogens on CCl₄-induced oxidative stres in the livers of male wistar rats. Artificial Cells, Blood substitues and Biotechnology 2005; 201-213.

31) Belinky PA, Aviram M, Fuhrman B, Rosenblat M, Vaya J.The antioxidative effects of the isoflaglabridin on endogenous constituents of LDL during its oxidation. Atherosclerosis 1998;137: 49-61.

32) De Whalley C, Rankin SM, Hoult JR, Jessup W, Leake D. Flavonoids inhibit the oxidative modification of low density lipoproteins by macrophages. Biochem Pharmacol 1990; 39: 1743.

33) Mangiapane H, Thomson J, Salter A, et al. The inhibition of the oxidation of low density lipoproteins by catechin, a naturally occurring flavonoid. Biochem Pharmacol 1992; 43: 445.

34) Jarvik GP, Tsai NT, McKintry LA, et al. Vitamin C and E intake is associated with increased paraoxonase activity. Arteioscler Thromb Vasc Biol 2002; 22:1329–1333.

35) Jessup W, Rankin SM, De Whalley CV, et al. Alpha-tocopherol consumption during low density lipoprotein oxidation. Biochem J 1990;265: 399.

36) Aviram M, Rosenblat M, Scott B, et al. Human serum paraoxonase (PON1) is inactivated by oxidised low density lipoprotein and preserved by antioxidants. Free Radic Biol Med 1999;26:892–904.

37) Castilla Cortazar I, Garcia M, Muguerza B, et al. Hepatoprotective effects of insuline like growth factor I in rats with carbon tetrachloride induced cirrhosis. Gastroenterology. 1997; 113 (5): 1682-1691.

38) Polavarapu R, Spitz DR, Sim JE, et al. Increased lipide peroxidation and impaired antioxidant enzyme function is associated with pathologicall liver injury in experimental alchocolic liver disease in rats fed diets high in corn oil and fish oil. Hepatology 1998; 27 (5): 1317-1323.