Koyun ham hidatik kist sıvısının SDS-PAGE analizinde moleküler ağırlığı 8 ile 205 kDa arasıda değişen 15 farklı polipeptid bandı tespit edilirken, kısmi purifiye antijenin elektroforezi neticesinde moleküler ağırlığı 16 ile 68 kDa arasında değişen 6 farklı polipeptid bandı belirlenmiş olup her iki antijende de en belirgin bandın 66 kDa’luk band olduğu dikkati çekmiştir. Ayrıca kısmi purifiye kist sıvısı antijeninin elektroforezinde AgB’nin düşük moleküler ağırlıklı (16, 24, 29 kDa) 3 subuniti elde edilmiştir.

Elde edilen her iki antijenin koyun hidatidosisinin tanısındaki etkinliğini belirlemek amacıyla yapılan ELISA testi neticesinde kısmi purifiye kist sıvısı antijeninin (AgB) sensitivitesi %91.6, spesifitesi %77.1 olarak belirlenmiş; ham kist sıvısı antijeni için ise bu oranların sırasıyla %79.1 ve %60.4 olduğu tespit edilmiştir.

Echinococosis, hem insan hem de evcil hayvanları etkileyen dünyadaki en önemli zoonozlardan birisi olup, özellikle az gelişmiş ülkelerde kırsal bölgelerdeki populasyonlarda, insan ve hayvanlarda oldukça sık rastlanmaktadır ². Klinik bulguların yeterince belirgin olmaması ve parazitolojik yoklamaların spesifik sonuçlar vermemesi nedeniyle ara konaklardaki teşhisinde sıkıntılar ortaya çıkmaktadır. Özellikle yeni oluşmakta olan kistlerin radyodiagnostik yöntemlerle tespiti güç olmaktadır. Hastalığın erken tanısı şüphesiz ki tedavideki başarı oranını da artırmaktadır ³.

Hidatidosiste serolojik tanı diğer parazit hastalıklarında olduğu gibi konağın parazite karşı göstermiş olduğu hücresel ve humoral immun yanıtı ortaya koyma esasına dayanmaktadır. Serolojik testlerin sensitivite ve spesifiteleri, kullanılan antijenin cinsi ve hazırlama şekli, değişik pozitiflik kriterleri, kistin canlılığı ve lokalizasyonu, parazitin suşu gibi birçok nedene bağlıdır ⁴.

Echinococcus granulosus’un değişik yaşam evrelerinin farlı antijenik yanıtlar verdiği, hidatik antijenlerin genel kaynağının ise kist sıvısı, kist membranı ve protoskoleksler olduğu bilinmektedir ⁵. Günümüze kadar kist sıvısı içerisinde iki farklı antijenik yapı belirlenmiş olup bunların ısıya dayanıksız bir lipoprotein olan antijen 5 ve ısıya dayanıklı bir protein olan antijen B olduğu bildirilmiştir ^6,7.

Antijen 5 ilk defa Capron ve ark. ⁸ tarafından immunoelektroforez metoduyla at kist sıvısından elde edilmiş ve hidatidosisin tanısındaki değeri üzerinde durulmuş, ayrıca antijen 5’in çimlenme zarında, protoskolekslerin parankiminde ve bunların salgılarında bulunduğu tespit edilmiştir. Antijen 5, parazitin hidatik sıvısında ve kistin somatik dokularında bulunan 10 veya daha fazla antijenden biri olup, immunoelektroforetik çalışmalar bu antijene karşı oluşmuş antikorların hastanın serumunda bulunmasının hidatidosisin tanısında kesin bir kriter olduğunu göstermiştir ⁸. Bu antijene aynı zamanda Taenia hydatigena sistiserkleri içindeki sıvıda da rastlandığı ve bu nedenle cysticercosis ile çapraz reaksiyona neden olduğu bildirilmiştir ⁹. İkinci önemli hidatik antijen Oriol ve ark ⁷ tarafından tanımlanan, lipoprotein yapıda, ısıya dayanıklı ve moleküler ağırlığı 12000 dalton olan antijen B’dir. Bu antijen, kist sıvısı kaynatıldıktan sonra geriye kalan en önemli antijenik bileşimdir ⁷. Kist membranının geçirgenliği antijen B için antijen 5’e göre 10 kat daha fazladır ⁵. Klasik elektroforetik yöntemler içerisinde modifiye edilmiş jel sistemleri olmasına rağmen sodyum dodesil sülfatpoliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) bunların en popüler olanlarından biridir. Yöntemin en önemli özellilerinden birisi çok sayıda protein karışımlarının analizine olanak sağlamasıdır ¹⁰.

Burgu ve ark ^11, koyun hidatik kist sıvısının SDSPAGE ile analizinde moleküler ağırlığı 8 ile 200 kDa arasında değişen dokuz farklı spesifik protein bandı elde etmişlerdir. Şimşek ve Köroğlu ¹² ise aynı yöntemle koyun kist sıvısında 29, 45, 58, 68, 98 ve 116 kDa moleküler ağırlığında altı farklı polipeptit bandı tespit etmişlerdir. Başka bir çalışmada Kanwar ve ark ^13, koyun hidatik kist sıvısında SDS-PAGE yöntemiyle moleküler ağırlığı 8-116 kDa arasında değişen 15 farklı fraksiyon belirlenmişler ve bunlar içerisinde en belirgin olanının 66 kDa’luk band olduğunu bildirmişlerdir. Sepherd ve McManus ^14, 12 ve 16 kDa’luk polipeptidlerin, Maddison ve ark. ¹⁵ ise 8 kDa’luk polipeptidin hidatik kist için spesifik olduğunu bildirmişlerdir.

Hidatidosisin tanısında kullanılan ELISA yöntemi, yüksek duyarlılıklı olup, çok az miktarda serumun yeterli olması, kesin kantitatif ölçmeyi sağlaması ve kısa zamanda çok sayıda numunenin işlenmesine imkan sağlaması bakımından rutin kullanıma uygun, duyarlı, özgül ve ekonomik bir yöntemdir ¹⁶. Yong ve ark. ^17, koyun hidatik kist sıvısından hazırladıkları antijeni kullanarak, hidatik kistle doğal enfekte altı yaşındaki 45 koyunun nekropsisi sonucu elde ettikleri serumları ELISA ile test etmişler ve 41 koyunda pozitif sonuç elde etmişlerdir. Force ve ark. ^18, hidatidosisin tanısında karşılaştırmalı olarak çalıştıkları 8 serolojik test içerisinde ELISA yönteminin %94 ile en sensitiv, %99 ile en spesifik test olduğunu saptamışlardır. Şimşek ve Köroğlu ¹² ise koyun ham kist sıvısı antijenini koyun hidatidosisinin tanısında kullanmışlar ve ELISA’nın %60 sensitiviteye ve %94 spesifiteye sahip olduğunu tespit etmişlerdir. İbrahem ve ark ¹⁹ koyun ham kist sıvısı antijeni, kısmi purifiye kist sıvısı antijeni (AgB) ve rekombinant AgB’yi kullanarak ELISA testini uygulamışlar ve bu antijenlerin koyun hidatidosisinin tanısındaki yerini araştırmışlardır. Neticede sensitivite oranlarının ham kist sıvısı antijeni için %32, kısmi purifiye AgB için %88 ve rekombinant AgB için ise %28 olduğunu belirlemişler, spesifite oranlarının ise sırasıyla %90, %95 ve %95 olarak şekillendiğini ifade etmişlerdir.

Bu çalışma ile hidatidosisin serolojik tanısında kullanılacak kist sıvısı antijeninin kısmi purifikasyonunun yapılması, antijenik bantların SDS-PAGE ile gösterilmesi amaçlanmış, ayrıca elde edilen antijenlerin sensitivite ve spesifite oranlarının ELISA kullanılarak belirlenmesi hedeflenmiştir.

Kısmi Purifiye Antijenin (AgB) hazırlanması: Hidatik kist sıvısından Antijen B bakımından zengin antijen koyun karaciğerinden elde edilen hidatik kist sıvısından hazırlanmıştır. Hidatik kist sıvısı 5000 g’de 10 dakika santrifüj edilen protoskoleks ve diğer partiküllerin çökmesi sağlanmıştır. Elde edilen 100 ml supernatant hem antijen 5 hem de antijen B’yi içermektedir. Bu supernatant 1 gece +4ºC’de 0.005 M acetat buffer (pH=5.0)’da diyaliz edilmiş, daha sonra +4ºC’de 15000 g’de 30 dakika santrifüj edilmiştir. Supernatant atılıp altta kalan pellet toplanmış ve 10 ml 0.2 M fosfat buffer (pH=8.0)’da çözdürülmüştür. Bu solüsyon 15 dakika su banyosunda tutulduktan sonra +4ºC’de 20000 g’de 1 saat süreyle santrifüj edilmiştir. Elde edilen pellet atılmış ve Antijen B’den zengin supernatant porsiyonlara ayrılıp kullanılıncaya kadar -20ºC’de saklanmıştır ²⁰.

Polipeptid analizi: Ham hidatik kist sıvısı antijeni (cAg) ve Antijen B (AgB)’den zengin kısmi purifiye kist sıvısı antijeni %12’lik seperasyon ve %3.9’luk stok jel sisteminde reducing şartlarda SDS-PAGE yöntemiyle elektroforeze tabi tutulmuştur. Seperasyon amacıyla her bir antijen fraksiyonundan 20 µl alınıp 3 µl 6X SDS örnek buffer (7 ml 4X Tris-Cl/SDS (pH=6.8), 0.93 gr dithiothreitol, 1 gr SDS, 1.2 mg bromphenol blue, 3 ml glycerol) ile karıştırılarak ikişer kuyucuğa yüklenmiştir. Ayrışan proteinlerin moleküler ağırlığını belirlemek amacıyla da bir kuyucuğa moleküler ağırlık markeri (Oncogene Research Product Prestained Protein Molecular Weight Markers, Cat No: MW03) konulmuştur. Örnekler 200 V sabit akımda proteinler jelin alt kısmına ulaşana kadar seperasyona tabi tutulmuştur. Bu sürenin sonunda jel 15 dk fikzasyon solusyonunda (%10 glacial asetik asit, %20 methanol ve %70 distile su) bekletilmiş ve takiben %5 coomassie mavisi (5 ml %1 coomassie blue, 20 ml %95 methanol, 5 ml glacial asetik asit, 20 ml distile su) ile bir gece boyanıp bantlar belli olana kadar açma solusyonunda (3 kısım methanol, 1 kısım glacial asetik asit, 6 kısım distile su) bekletilmiştir. Bantlar tamamen ortaya çıkınca jelin görüntüsü alınmıştır.

ELISA’nın Uygulanışı: Bu test, Şimşek ve Köroğlu ¹²’nun bildirdiği şekilde yapılmıştır. Antijenlerin optimum dilusyonu 0.05 M karbonat/bikarbonat tamponu ile yapılmış ve ELISA pleytinin (Linbro EIA mikrotitration plate 96 flat bottom Lot No: 805202) her bir kuyucuğuna 100 µl konularak bir gece +4ºC’de bekletilmiştir. Bloklama işlemi için 1X PBS ile sulandırılmış %5’lik yağsız süt tozu kullanılmıştır. Serumlar 1/200, konjugat (anti-sheep IgG peroxidase conjugate, Sigma Immunochemicals Cat. No: A3415) ise 1/7500 oranında sulandırılmış, yıkama ve sulandırma işlemleri için ise %0.02 Tween-20 içeren PBS kullanılmıştır. Substrat ve 15 dakika sonra durdurma solusyonu eklenen pleyt, ELISA okuyucusunda (Medispec ESR 200 ELISA Reader) 450 nm dalga boyunda okutulmuştur. Sonuçlar absorbans değerleri olarak alınmış, negatif kontrollerin absorbans değerlerinin aritmetik ortalaması +2 standart sapma (X+2SD) değerinin (eşik değer=cut-off) üstü pozitif olarak kabul edilmiştir.

ELISA’nın Standardizasyonu: Testi standardize etmek amacıyla antijen, serum ve sekonder antikorun (anti-sheep) optimal çalışma dilusyonu ve konsantrasyonu belirlenmiştir. Bu amaçla bilinen pozitif ve negatif serum örneklerinin seri dilusyonları yapılmıştır. Bu çalışmada kullanılan 48 adet pozitif serum örneği mezbahada kesim takip edilerek, karaciğer, akciğer veya her ikisinde birden belirgin hidatik kistlerin görüldüğü ve diğer organlarında başka bir parazitolojik ve patolojik durumun olmadığı koyunlardan alınmıştır. Aynı şekilde, 48 negatif örnek de mezbahada kesim takip edilerek elde edilmiş, özellikle 1 yaşından küçük ve organlarında hidatik kist ve başka paraziter oluşum görülmeyen kuzulardan alınmıştır. Testin sensitivite ve spesifitesi pozitif ve negatif örneklerin cut-off değerlerine göre hesaplanmıştır.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: Koyun kısmi purifiye (A) ve ham (B) kist sıvısı antijenlerinin SDS-PAGE ile elektroforetik analizi neticesinde elde edilen bandların görünümü

Burgu ve ark. ^11, koyun koyun hidatik kist sıvısının SDS-PAGE ile analizinde moleküler ağırlığı 8 ile 200 kDa arasında değişen 9 spesifik protein bandı elde etmişlerdir. Bu çalışmada da ham kist sıvısı antijeninin separasyonu sonucu 8 ile 205 kDa aralığında 15 farklı protein bandı elde edilmiştir. Kanwar ve ark. ^13, aynı yöntemle koyun hidatik kist sıvısını ayrıştırmışlar ve moleküler ağırlığı 8 ile 116 kDa arasında değişen 15 farklı protein bandı belirlemişler ve en belirgin bandın 66 kDa’luk bant olduğunu ifade etmişlerdir. Bu çalışmada kullanılan her iki antijenle de 66 kDa’luk bant en belirgin bant olarak göze çarpmıştır.

Sepherd ve McManus ^15, 12 ve 16 kDa’luk polipeptidlerin, Madison ve ark ¹⁶ ise 8 kDa’luk polipeptidlerin hidatik kist için spesifik olduğunu bildirmişlerdir. Ibrahem ve ark ¹⁹ ise kısmen purifiye ettikleri kist sıvısı antijeninde 8, 12 ve 24 kDa ağırlığındaki proteinleri elde etmişler ve koyun hidatidosisinin tanısında kullanmışlardır. Bu çalışmada Antijen B’nin 3 subunitinden (8, 16 ve 21 kDa) 8 kDa olan bant kısmi purifiye kist sıvısı antijeninde elde edilemezken, tespit edilen 16, 24 ve 29 kDa’luk bantların 16 ve 21 kDa’luk polipeptidler ile benzer olabileceği düşünülmüştür. Bunlardan 8 kDa’luk polipeptid ham kist sıvısı antijeninde gösterilmesine rağmen küçük moleküler ağırlığı nedeniyle purifikasyon aşamasında elimine olduğu düşünülmüştür. Bununla birlikte ham kist sıvısındaki yüksek moleküler ağırlıklı diğer polipeptidler purifikasyon aşamasında elimine edilerek antijenin sensitivitesi artırılmıştır.

Hidatidosisin tanısında kullanılan ELISA yöntemi, kısa zamanda çok sayıda örneğin işlenmesine olanak sağlaması, duyarlı, özgül ve ekonomik bir yöntem olması nedeniyle tercih edilmektedir ¹⁷. Yapılan değişik çalışmalar koyun hidatidosisinin tanısında ELISA yönteminin sensitivitesinin %60 ile %94 arasında, spesifitesinin ise %94 ile %99 arasında ^12,18,19 değiştiğini ortaya koymuştur. Ibrahem ve ark. ^19, koyun ham kist sıvısı antijeni, kısmi purifiye kist sıvısı antijeni ve rekombinant AgB’yi kullanarak ELISA testini koyun hidatidosisinin tanısında uygulamışlar ve sırasıyla %32, %88 ve %28 oranlarında sensitivite ve %90, %95 ve %95 oranlarında spesifite elde etmişlerdir. Bu çalışma ile kısmi purifiye kist sıvısı antijeninin ELISA ile sensitivitesi %91.6, ham kist sıvısı antijeninin ise %79.1 olarak belirlenirken spesifite oranları sırasıyla %77.1 ve %60.4 olarak tespit edilmiştir.

Neticede özellikle yeterli laboratuvar alt yapısının olmadığı durumlarda koyunlarda hidatidosisin seroprevalansının belirlenmesinde ham kist sıvısı antijeni yerine hazırlaması oldukça basit olan kısmi purifiye kist sıvısı antijeninin kullanılması faydalı olacaktır. Yine bu tür çalışmalarda çok sayıda örneğin kısa zamanda işlenmesine imkan sağlayan basit, ekonomik ve özgül bir test olan ELISA’nın kullanılması da yararlı olacaktır.

1) Güralp N. Helmintoloji. İkinci baskı. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Yayınları. No: 368, Ankara, 1981.

2) Rickard MD, Lightowlers MW. Immunodiagnosis of Hidatid Disease. In: Thompson RCA (Editor). The Biology of Echinococcus and Hydatid Disease. George Allen and Unwin, London: 1986, 217-249.

3) Hira PR, Bahr GM, Shweiki HM, Behbehani K. An enzymelinked immunosorbent assay using an arc 5 antigen for the diagnosis of cystic hydatid diseases. Ann Trop Med Parasitol 1990; 84: 157-162.

4) Mattosian RM. The immunological diagnosis of human hydatid disease. Trans R Soc Trop Med Hyg 1977; 71:101-

104)

5) Musiani P, Piantelli M, Lauriola L, Arru E, Pozzuoli R. Echinococcus granulosus spesific quantification of the two most immunoreactive antigens in hydatid fluids. J Clin Pathol 1978; 31:475-478.

6) Altıntaş N. Echinococus sp. ve Kist hidatiğin immunolojisi. İnsanlarda ve Hayvanlarda Kist Hidatik (Echinococcosis). Türkiye Parazitololoji Derneği Yayın No:10, Ege Üniv. Ofset Basımevi, Bornova-İzmir, 1991, 89-95.

7) Oriol C, Oriol R. Physicochemical properties of a lipoprotein antigen of Echinococcus granulosus. Am J Trop Med Hyg 1975; 24: 96-100.

8) Capron A, Yarzabal LA, Vernes A, Fruit J. Le diagnostic immunologique de I’echinococcose humaine. Pathologie Biologie 1970; 18: 357-365.

9) Varela-Diaz VM, Coltorti EA, Rickard MA, Torres JM. Comperative antigenic charecterization of Echinococcus granulosus and Taenia hydatigena cyst fluids by immunoelectrophoresis. Res Vet Sci 1997; 23: 213-216.

10) Bulut H, Doymaz MZ. Blotlama Teknikleri ve Mikrobiyolojide Kullanımı. In: Durmaz R (Editor). Uygulamalı Moleküler Mikrobiyoloji, 2. baskı, 2001, 123-

137)

11) Burgu A, Doğanay A, Güvenç B, Sarımehmetoğlu HO, Kalınbacak F. Analysis of fluids of hydatid cysts from sheep by SDS-PAGE and determination of specific antigens in protein structure by Western Blotting. Turk J Vet Anim Sci 2000; 24: 463-500.

12) Şimşek S, Köroğlu E. Evaluation of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and enzyme-linked immunoelectrotransfer blot (EITB) for immunodiagnosis of hydatid diseases in sheep. Acta Tropica 2004; 92:17-24.

13) Kanwar JR, Kaushik SP, Sawhney IM, Kamboj MS, Mehta SK, Vinayak VK. Specific antibodies in serum of patients with hydatidosis recognised by immunoblotting. J Med Microbiol 1992; 36:46-51.

14) Shepherd JC, McManus DP. Specific and cross-reactive antigens of Echinococcus granulosus hydatid cyst fluid. Mol Biochem Parasitol 1987; 25: 143-154.

15) Maddison SE, Slemenda SB, Schantz PM, Fried JA, Wilson M, Tsang VC. A specific diagnostic antigen of Echinococcus granulosus with an apparent moleculer weight of 8 kDa. Am J Trop Med Hyg 1989; 40:377-383.

16) Altaş K. İnsan Hidatidozunun Tanımında ELISA (Enzyme Linked İmmunosorbent Assay)’nın Değeri. Doçentlik Tezi, İstanbul: İ.Ü. Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji, Parazitoloji ve İnfeksiyon Hastalıkları Kürsüsü, 1981.

17) Yong WK, Heath DD. Comparison of cestode antigens in an Enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of Echinococcus granulosus, Taenia hydatigena and Taenia ovis infections in sheep. Res Vet Sci 1984; 36: 24-31.

18) Force L, Torres JM, Carillo A, Busca J. Evaluation of serological tests in the diagnosis of human Echinococcosis and follow-up. Clin Infect Dis 1992; 15: 473-480.

19) Ibrahem MM, Rafiei A, Dar FK, Azwai SM, Carter SD, Craig PS. Serodiagnosis of cystic echinococcosis in naturally infected camels. Parasitology, 2002; 125: 245-

20) Oriol R, Williams JF, Perez-Esandi MV, Oriol C. Purification of lipoprotein antigens of Echinococcus granulosus from sheep hydatid fluid. Am J Trop Med Hyg 1971; 20: 569-574