Bergey's Manual of Systemic Bacteriology'inin 9. baskısına göre, Mycobacterium'lar Prokaryotes aleminde, Fimircutes divizyonunda, Actinomycetales takımında, Mycobacteriaceae familyasında ve Mycobacteria cinsinde sınıflandırılmıştır
1.
Mycobacterim tuberculosis (M. tuberculosis) kompleks (MTBC) bakteriyolojik özellikleri ve DNA benzerliklerine göre birbirleriyle yakın ilişkili Mycobacterium türlerinin bir grubuna verilen isimdir2. Bunların tümü insan ve diğer memelileri etkileyen kronik granülamatöz bir hastalık olan tüberküloz (TB)'a sebep olur. Bu kompleks M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. microti, M. bovis BCG3, M. canetti4 ve M. caprae5'ı içerir. M. bovis MTBC'i içerisinde en geniş konakçı dağılımına sahiptir ve insanlar da dahil olmak üzere çok sayıda memeli türünü infekte edebilir6. Bununla birlikte, M. tuberculosis sadece bir insan patojenidir7.
Sığır TB'u etkeni olan M. bovis aside dirençli, aerobik, sporsuz, hareketsiz ve kapsülsüz bir bakteridir8.
Sığırlarda M. bovis çoğunlukla solunum yolu ile bulaşır, fakat kontamine materyalin sindirim yoluyla alınması ile de infeksiyon meydana gelebilir. Bakteri akciğerlere girdiği zaman çoğalmaya başlar ve genellikle akciğerlerin yanındaki lenf nodüllerine yayılır9.
Sığır TB'u tüberkeller olarak bilinen nodüler granülom'ların oluşumuyla karakterizedir10. Çoğunlukla kronik bir hastalık olarak tanımlanmasına rağmen, sığır TB'u bazen akut, çabuk ilerleyici bir seyir gösterebilir. Her vücut dokusu etkilenebilir, fakat lezyonlar çoğunlukla lenf nodülleri (özellikle baş ve thoraks), akciğerler, bağırsaklar, karaciğer, dalak, pleura ve peritoneum'da gözlenir10.
Bugün gelişmiş ülkelerde sığır TB'u eradike edilmiş veya kontrol edilebilir durumdadır11. Bu ülkelerde TB'un prevalansına bakıldığında ülkemizde etkili bir eradikasyon çalışmasının yapılması gerekmektedir11. Hastalığın eradikasyonuna yönelik 1986 yılından bugüne kadar ülkesel bir eradikasyon projesi uygulanmamasına karşın uzun yıllardan beri çeşitli resmi kurum ve kuruluşlardaki hayvanlarda TB mücadelesi sürdürülmektedir11.
Sığır TB'u genellikle canlı hayvanda gecikmiş tip aşırı duyarlılık reaksiyonları ile teşhis edilir10. İnfeksiyon subklinik bir seyir izlediğinden klinik muayene ile teşhis edilemez. Ölü hayvanlarda post-mortem muayene ve histopatolojik ve bakteriyolojik tekniklerle teşhis edilir ve DNA prob ve polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) teknikleri de kullanılabilir10. Sığır TB'unun tanısı için kullanılan bakteriyolojik yöntemler Ziehl-Neelsen boyama yöntemi ile aside dirençli basilin mikroskopik olarak gösterilmesi ve M. bovis'in kültürle üretilmesidir. Ziehl-Neelsen boyama yöntemi çabuk, ucuz, fakat duyarlılığı düşük bir yöntemdir7. BACTEC 460 gibi sıvı kültür sistemlerinin kullanımı ile kültür yönteminin duyarlılığı artmış ve üreme süresi kısalmıştır12,13.
Epidemiyoloji
M. bovis başlıca sığırları aynı zamanda domuz, kedi, köpek, koyun, keçi, at ve kanatlılar gibi evcil hayvanlarla, birçok yabani hayvanı (porsuk, geyik, tilki ve ferret'ler) ve insanları infekte edebilen zoonotik bir bakteridir6,10.
Hastalığın oluşumunda hayvanın yaşı, davranışı, çevre, iklim ve çiftlik uygulamalarının rolü vardır14. M. bovis'in en önemli bulaşma yolu aerosoldür.14,15. Kalabalık ve havalandırmanın bozuk olduğu ahırlarda bulunan infekte hayvanlar öksürük ve tıksırık yolu ile sağlamları bulaştırarak hastalığın yayılmasına yol açarlar16. İnfekte sütün emilmesi, kontamine mera veya sudan direkt olarak M. bovis'in alınmasıyla sindirim yolu ile de bulaşma olmaktadır9.
Eğer üreme organları infekte olursa genital bulaşma meydana gelebilir, fakat bu tür bulaşma nadirdir15. Deri yolu ile bulaşma da oldukça seyrek gözlenir. Süt, idrar ve gayta ile M. bovis'in saçılması, gelişmiş ülkelerde sığır TB'unun nispeten önemsiz bir bulaşma şekli olarak kabul edilir. Bununla birlikte, M. bovis'in nazal mukustan izole edildiği bildirilmiştir17,18.
M. bovis insanlara sindirim, aerosol inhalasyon veya mukoz membranlar ve deri sıyrıklarından direkt temas ile bulaşabilir19,20. İnsanlara asıl bulaşma şeklinin aerosol inhalasyon ve pastörize edilmemiş süt ürünlerinin tüketimiyle olduğuna inanılır21. İnfekte sığırlarla22 veya yabani hayvanlarla yakın temas da insandan insana bulaşma da bir rol oynayabilir6. Gelişmiş ülkelerde eradikasyon çalışmaları bu hastalığın prevalansını önemli ölçüde azaltmıştır, fakat yabani hayvanlardaki rezervuarların tam eradikasyonu güçtür239. M. bovis halk sağlığı yönünden Risk 3 patojen olarak sınıflandırılmıştır24.
M. bovis'in yabani hayvan rezervuarları sığırlar için infeksiyon kaynağıdırlar8. Bu hayvanlar İngiltere'de Avrasya porsuğu (Meles meles), Yeni Zellanda'da fırça kuyruklu possum (Trichasurus vulpecula), Amerika'da beyaz kuyruklu geyik (Odocoileus virginianus), Afrika'da vahşi Afrika mandası ve diğer ruminantlardır8.
İngiltere'de sığır TB'unun insidensi 1984 yılından beri artmıştır ve yıllık kaybın 2011 yılına kadar 1 milyar dolara ulaşacağı düşünülmektedir25. Sığır TB kontrol programının toplam maliyeti 1998/199926'da 24.8 milyon Amerikan dolarından 2005/2006'da 99.1 milyon dolara kadar 7 yılda yaklaşık olarak % 400 artmıştır8.
Eradikasyon programları için finansal destek alan Avrupa Birliği Üyesi Ülkelerinde 1999 ile 2004 yılları arasında sığır TB'unun prevalansı Tablo 1'de gösterilmiştir27.
 Büyütmek İçin Tıklayın |
Tablo 1: Eradikasyon programları için finansiyal destek alan Avrupa Üyesi Ülkeleri arasında sığır TB'unun durumu: 1999 ile 2004 yılları arasında sürü prevalansındaki trendler27. |
Sütün pastörizasyonu ve zorunlu kontrol programlarının uygulanması ile Amerika'daki sığırlarda M. bovis infeksiyonlarının insidensi %0.001'den daha aza düşmüştür28. Sonuç olarak, Amerika'daki M. bovis infeksiyonlarının insan vakaları da azalmıştır23. Bununla birlikte, birkaç rapor Amerika'nın bazı bölgelerinde M. bovis'e bağlı insan TB'unun insidensinin arttığını göstermiştir29-31.
Aktif sığır TB kontrol programları olmayan gelişmekte olan ülkelerde sığır TB'u insan sağlığı için önemli bir tehdit oluşturmaktadır32. Gelişmekte olan ülkelerde insanlarda M. bovis'den kaynaklanan TB vakaları, insan TB vakalarının %10'unu oluşturmaktadır32.
Türkiye'de sığır TB'u ile ilgili çalışmalar 1900'lü yılların başında başlamıştır ve hastalığın insidensi hakkında sağlıklı bir veri bulunmamaktadır33-35. Kayseri bölgesinde sığır TB'unun prevalansı %1.49 olarak saptanmış ve BACTEC radyometrik metodun, M. bovis'i saptamada hızlı ve duyarlı bir tanı yöntemi olduğu bildirilmiştir36. Van bölgesindeki hayvanlardan alınan burun akıntısı ve süt örneklerinin PZR yöntemi ile incelenmesi sonucu, burun akıntısı örneklerinin 3 tanesinde, süt örneklerinin ise 1 tanesinde pozitiflik bulunmuştur35. OIE verilerine göre Türkiye TB hastalığının görüldüğü ülkeler arasında yer almaktadır (Tablo-2)33,37.
Türkiye'deki süt sektörünün Avrupa Birliği ülkelerine süt ve süt mamülleri ihracatı yapabilmesi için sığırlarda TB'dan ari işletmeler oluşturulması gerekmektedir. 2005 yılı hayvan hastalık ve zararlıları ile mücadele programı gereği38 TB'dan ari işletmeler oluşturmak amacı ile Balıkesir, Edirne, İstanbul, İzmir, Kırklareli, Kahramanmaraş, Tekirdağ, Eskişehir ve Konya illerinde süt tesislerinin sütü temin ettiği işletmelerde Tüberkülin testi uygulanmaktadır11. Son çalışmalara göre, 2005 yılında 150 mihrakta TB hastalığı çıkmıştır, ari işletmeler dışında 5976 büyükbaş hayvana tüberkülin testi uygulanmış, pozitif çıkan 768 büyükbaş hayvan zorunlu kesime sevk edilerek 1.120.945.11 YTL tazminat ödenmiştir. TB'un prevalansı %10 olarak belirlenmiştir33,37,39,40.
Türkiye'de vahşi hayvanlarda TB'un prevalansı, dağılımı ve populasyon yoğunluğu ile bunların evcil hayvanlar ve insanlarla olan ilişkilerine ait parametreler yok denecek kadar azdır33. Bu durum hastalıkla mücadeleyi büyük ölçüde güçleştirmektedir33. Sıcak mevsimlerde yapılan yaylacılık sırasında vahşi domuz ve geyiklerden kalan infeksiyöz materyallerle kirlenmiş otlaklar hastalığın bulaşmasında bir kaynak oluşturabilmektedir33,39. Türkiye'de bir mink ve kedide TB vakası rapor edilmiştir41,42.
Teşhis
Sığırlarda TB sadece hastalığın son evrelerinde klinik olarak teşhis edilebilir43. Tüberkülin deri testi üniversal olarak bilinen ve sığır TB kontrol programlarında başlangıç teşhisi için kullanılan bir testtir43. Bununla birlikte, hastalık prevalansının düşük veya hastalıktan ari ülkelerde, et muayenesi teşhis ve teftiş için kullanılır43. Deri testinin bazen uygulama dezavantajlarından dolayı, sığırlarda M. bovis infeksiyonlarına karşı immünolojik testler alternatif teşhis metotları olarak geliştirilmeye çalışılmaktadır15. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ve gama-interferon (IFN-γ) testi gibi testler son yıllarda infeksiyonu saptamak için uygulanmıştır15. Bununla birlikte, sığır veya diğer hayvanlarda TB için üniversal olarak kabul edilen diagnostik kan testi yoktur10. İnfeksiyonun saptanmasında çoğu kez M. bovis'in izolasyon ve identifikasyonuna güvenilmektedir10.
Klinik muayene ve Nekropsi
Sığır TB'una yakalanan çoğu sığır klinik olarak normaldir43. Yaygın miliyer TB lezyonları gösteren bazı inekler klinik olarak normal görülürler, fakat diğer belirtilerle ilişkili olmayan aşırı zayıflama TB şüphesini artırır43. İnip çıkan ateş de çoğunlukla hastalıkla ilişkilidir16,43. Akciğer TB'u solunum güçlüğü ve düşük derecede pnömoni belirtileri ile birlikte, kronik öksürükle karakterizedir43. Etkilenen hayvanlar uysaldır ve hareketsizdir, fakat gözler parlaktır44. İngiltere'den elde edilen rapor 6 ayın üzerindeki sığırların patolojik muayenelerinde TB'daki primer kompleksin akciğerlerde ve ilişkili olduğu lenf nodüllerinde görüldüğünü belirtmektedir45.
Etkenin identifikasyonu
Klinik ve postmortem örneklerde M. bovis'in varlığı boyalı preparatların incelenmesiyle gösterilebilir ve organizmanın kültürde üretilmesi ile teyit edilebilir10. Marazi madde alma kaplarının temiz ve steril olması gerekir (çevresel mikobakteri ile kontamine olan örnek kaplarının kullanılması çevresel mikobakterilerin çabuk gelişmesine bağlı olarak M. bovis'i identifiye etmede başarısızlıkla sonuçlanabilir)10,16. Numune almada 50 ml kapasitede, uygun, tek kullanımlı plastik kaplar çeşitli örnek tipleri için kullanılabilir. Laboratuara gönderilecek örnekler sızıntıyı önlemek için iyice izole edilmeli, mühürlenmeli ve nakil sırasında meydana gelebilecek olan kırılma veya ezilmeye karşı uygun bir şekilde paketlenmelidir46. Şüpheli zoonotik bir hastalıktan elde edilen örnekleri taşımak için “International Air Transport Association” (IATA), “Dangerous Goods Regulations” (DGR) kuralları takip edilmelidir10. Laboratuara örneklerin erken teslimi M. bovis'in kültür ile elde edilme şansını artırır, fakat teslim gecikirse, kontaminantların üremesini geciktirmek ve mikobakterileri muhafaza etmek için örneklerin dondurulması gerekir10. Sıcak hava koşullarında, dondurma mümkün değilse, kontaminasyonu önlemek için, bakteriostatik madde olarak %5 w/v borik asit ilave edilebilir, fakat sadece sınırlı bir süre için sütün bozulmasını önler, 1 haftadan daha uzun süre bozulmayı önleyemez10.
Laboratuar personelinin infeksiyonunu önlemek için tedbirler alınmalıdır. Kültürü de içeren bütün prosedürlerin biyolojik güvenlik kabinleri içinde yapılması gerekir10.
a) Mikroskopik muayene: M. bovis klinik örneklerden ve doku materyalinden direkt olarak hazırlanan preparatlarda mikroskopik olarak görülebilir43. M. bovis aside dirençli olduğundan klasik Ziehl-Neelsen yöntemi ile boyanır, fakat fluoresan asit-fast boyama da kullanılabilir10. Mavi zemin üzerinde kırmızı renkte basil (methylene blue boyama) ve eğer malaşit yeşili ile tekrar boyanırsa yeşil zeminde görülürler47. Preparatta pozitif olan vakalar için lezyonun haematoxylin-eosin ile boyanmış kesitinin muayenesi önemlidir10. Bu teknik ucuz, pratik ve diğer laboratuar imkanlarının mevcut olmadığı gelişmekte olan ülkelerde faydalı bir başlangıç teşhis adımıdır; üstelik klinik ve patolojik örneklerde identifikasyon çabucak yapılabilir14. M. bovis kültürde izole edilmesine rağmen, histolojik kesitlerde saptanmayabilir10.
b) M. bovis'in kültürü: Örnekler akciğer, karaciğer, dalak v.s. gibi lezyonlu lenf nodülleri ve parenkimatöz organlardan alınır43. Ancak intradermal deri testleri pozitif olan hayvanlarda büyük patolojik lezyonlar görülmez; retrofarengeal, bronşial, mediastinal ve mesenterik lenf nodüllerinden alınan örnekler rutin olarak kültür muayenesi için toplanır; bazen supramamar ve mandibular bezler ve karaciğer de alınır43. Örnekler bir stomacher veya blendır ile homojenize edilir43,46. Diğer kontaminantların üremesini engellemek için doku %5 oksalik asit veya %2-4 sodyum hidroksit gibi bir asit veya alkali ile muamele ettirilir10,47. Karışım oda sıcaklığında 10 dakika karıştırılır. Süspansiyon santrifüj edilir, sıvı atılır ve sediment kültür ve mikroskopik muayene için kullanılır43.
Primer izolasyon için sediment genellikle Lowenstein-Jensen, Coletsos base ve Stonebrink'in besiyeri gibi katı yumurtalı besiyerlerine ekilir, bu besiyerlerinin piruvat veya gliserol veya her ikisini de içermeleri gerekir43. Middlebrook 7H10 veya 7H11 gibi agar içeren besiyerlerinin de kullanılması gerekir43,46. Gliserolsüz sodyum piruvat içeren Stonebrink'in besiyeri muhtemelen en iyi besiyeridir48.
Kültürler CO2'li veya CO2'siz ortamda 37°C'de 8 hafta inkube edilir10,46. Besiyerlerinin kurumasını önlemek için ağzı vida-kapaklı tüplere koyulması gerekir10. Üreme gözle görüldüğü zaman preparatlar hazırlanır ve Ziehl-Neelsen yöntemi ile boyanır10. M. bovis genellikle 3-6 hafta inkubasyondan sonra üreme gösterir. M. bovis piruvatsız Lowenstein-Jensen besiyerinde gelişir, fakat gliserol ilave edildiği zaman daha az ürer10,46. Karakteristik üreme özellikleri ve koloni görünümü M. bovis'in teşhisinin kanıtıdır43. Bununla birlikte, TB kompleksindeki her bir izolatın biyokimyasal testler (niasin ve nitrat) veya Gen Prob TB kompleks DNA probuyla teyit edilmesi gerekir10.
İzolatların identifikasyonu genellikle kültürel ve biyokimyasal özelliklerini belirlemeyle yapılır46. M. bovis “disgonik” adı verilen gliserin içeren besiyerinde seyrek, ince üreme gösterir. Bununla birlikte, gliserinsiz piruvat içeren besiyerinde iyi gelişir46. Uygun piruvatlı katı besiyerinde M. bovis kolonileri “smooth” (S tipi) ve sarı-beyaz renktedir. Organizma 37°C'de yavaş ürer, fakat 25°C veya 42°C'de üremez44. M. bovis tiofen-2-karboksilik asit hidrazid (TCH) ve izonikotinik asit hidrazid (INH)'e duyarlıdır10,43. Bu durum 7H10/7H11 Middlebrook agar besiyeri veya yumurtalı besiyerlerinde gelişmeyle test edilebilir10. Yumurtalı besiyeri piruvatsız hazırlanır, çünkü INH'ı inhibe eder ve TCH üzerinde de benzer etkiye sahip olabilir (INH'ın bir analoğu olan) ve böylece yanlış pozitif sonuç verir10,43. M. bovis suşları para-amino salisilik asit ve streptomisin'e de duyarlıdır10. Etkili ilaç konsantrasyonları yumurtalı ve agar içeren besiyerleri için farklıdır. M. bovis'te niasin birikimi ve nitrat indirgemesi testleri negatifitir10,43. Amidaz testinde, M. bovis üreaz pozitif ve nikotinamidaz ve pirazinamidaz negatiftir10,43. Mikroaerofilik ve nonkromojenik bir bakteridir14. İdentifikasyon için ek testler kullanılabilir. Birkaç DNA analiz tekniği izolatları identifiye etmede çabuk bir yöntemdir ve moleküler tiplendirme epidemiyolojik açıdan önem taşır10.
M .bovis'in TB kompleksindeki diğer üyelerden, yani M. tuberculosis (insanlarda TB'un primer sebebi), M. africanum (M. tuberculosis ve M. bovis arasında fenotipik yer işgal eder) ve M. microti'den (“vole (tarla faresi) bacillus”, nadiren rastlanan organizma) ayırt edilmesi gereklidir10. Yukarıda belirtilen biyokimyasal testler M. bovis'i diğer türlerden ayırmaya yardımcı olur10.
Mikobakteri türlerinin identifikasyonu ve tanımlanması için diğer biyokimyasal testler aril sülfataz, Tween 80 hidrolizi, MacConkey agar, sodyum klorid tolerans, tellurit indirgeme, demir yükseltme, üreaz ve katalaz testleridir2.
Bazı Mikobakteri izolatlarının biyokimyasal testlerle ayırt edilmesi güç olabilir10,43. Bu nedenle etkenlerin hücre duvarı lipid kompozisyonunun kromatografik analizinden yararlanılabilir16. M. bovis polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ve spoligotyping gibi moleküler tiplendirme teknikleriyle teyit edilebilir10.
BACTEC gibi sıvı kültür sistemleri bazı tıp ve veteriner laboratuarlarında rutin olarak kullanılmaktadır10,46. Bu otomatize sistemlerin kullanımı ile kültür yönteminin duyarlılığı artmış ve üreme süresi kısalmıştır12,13. Üreme radyometrik veya fluometrik aletlerle değerlendirilir10. BACTEC 460 sistem gibi radyometrik kültür metodu geleneksel kültür metodundan daha çabuk sonuç verir, fakat mantar kontaminasyonuna duyarlıdır ve antibiyotiklerle sınırlanamayan atipik mikobakteriler ve non-mikobakteriyal organizmalar üreyebilir48. Bu metodun çok pahalı olması, kültür viallerini okumak için bir cihaza gerek duyması ve radyoizotoplara elle dokunulması gibi dezavantajları vardır43. Aside dirençlilik sadece mikobakterileri tanımlamada bir kriter değildir. Çünkü Corynebacterium spp., Nocardia spp. ve Rhodococus spp gibi mikroorganizmalar da aside dirençlidir43. Primer kültürlerde MTBC organizmaların kolonisi katı besiyerinde 4-6 hafta sonra ve radyometrik ve otomatik kültür sistemlerinde 13-15 gün sonra gözlenebilir49. Üretici firmalar (BD-Diafnostic Systems) artık radyometrik sisteminin kullanılmasını desteklememektedir10.
c) Moleküler yöntemler: Kültür veya izolasyon mikobakterilerin saptanması için hala altın standart test durumundadır. Bununla birlikte, mikobakterilerin kültür ortamında çok yavaş üremesi ve bazı klinik örneklerde kültür edilemeyen canlı mikobakterilerin varlığından dolayı daha uygun metotlara gerek duyulmaktadır43. Son yıllarda, sığırlarda TB'un etkili şekilde teşhisi için çok sayıda moleküler yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntemler kültürden daha hızlı, spesifik ve duyarlıdır ve TB basilinin etkenini saptadığı gibi aynı zamanda bu etkenlerin tiplendirilmesinde de kullanılmaktadır43. Bununla birlikte, bu yöntemlerin uygulanması için uygun kaynakların ve uzman personelin mevcudiyeti önemlidir ve özellikle gelişmekte olan ülkelerde mikobakteriler gibi patojenlere bu teknolojiyi uygulamak güç olabilir43,50.
Moleküler yöntemler başta M. tuberculosis'in tanısını güvenilir hale getirmek ve tiplendirilmesini kolaylaştırmak için uygulanmıştır43,50. Bununla birlikte, son zamanlarda bu metotlar zoonotik olan M. bovis'e yönelmiştir43. Klinik örneklerde PCR inhibitörlerinin varlığı ile birlikte, mikobakteriyal hücre duvarlarının intrasellüler doğası ve impermeabilitesi, PCR ile tespiti sınırlar43. Bu durum az sayıda basilin yaygın olduğu, TB'lu sığırlardan alınan örneklerde ve bazı klinik örneklerde etkenin PCR ile saptanmasında potansiyel kullanımlarını etkiler10,43. Amplifikasyonu baz alan PCR saptama kitleri mevcut olmasına rağmen, sığırlarda M. bovis'in saptanmasının “in-house” amplifikasyonu baz alan sistemlerde odaklanıldığı görülmektedir51. Çalışmalarda farklı primerler kullanılmıştır. Bunlar 16S-23S rRNA'dan elde edilen sekanslar, insersiyon sekansları IS6110 ve IS1081, MPB70 ve 38 kDa antijen b gibi MTBC'e spesifik proteinleri şifreleyen genleri çoğaltan primerlerdir10. Amplifikasyon ürünleri prob'larla hibridizasyon veya jel elektroforez ile analiz ve teyit edilmiştir52-54.
İnsan TB'unun epidemiyolojik çalışmalarında, insersiyon sekansı IS6110'nun multiple kopyalarda polimorfizmlerin tanımlanması M. tuberculosis'in suş tiplendirmesi için alternatif bir metot olarak kabul edilir55,56. Ne yazık ki, İngiltere ve diğer ülkelerde sığırlardan elde edilen M. bovis izolatlarının çoğunluğunda bu insersiyon sekansın tek bir kopyasının varlığı veteriner alanında bu tekniğin uygulanmasını sınırlamıştır55,57. Aynı şekilde, delesyon tiplendirme MTBC'nin farklı türlerininin ayrımında fayda sağlamıştır, fakat İngiltere'deki sığırlardan elde edilen M. bovis'in suşları arasında az varyasyon saptanmıştır55,58.
M. bovis'i MTBC'indeki diğer üyelerden ayırmak için kullanılan DNA analiz teknikleri biyokimyasal yöntemlerden daha hızlı ve daha güvenilirdir10. oxyR genindeki 285 nükleotid pozisyonundaki bir mutasyonun bugüne kadar incelenen MTBC izolatlarının tümünde M. bovis için spesifik olduğu bulunmuştur59.
Genetik fingerprinting (parmak izi) M. bovis'in farklı suşlarını ayırt edebilmektedir10. M. bovis'in orijini, nakli ve yayılmasının izlenmesi açısından bu yöntem değer taşır10. En yaygın olarak kullanılan yöntem spoligotiplendirmedir ve M. bovis'i M. tuberculosis'ten ayırt eder60. Aynı spoligotip'e sahip olan suşları ayırt etmek için diğer yeni teknikler şu an gelişme aşamasındadır10. Bunlar IS6110 primerini kullanan RFLP, direkt tekrar (DR) lokusu ve PGRS prob (poly G tekrar sekansı)61, DR ve puce (koyu mor renk) probların kombinasyonunu kullanan RFLP62 ve VNTR profili (değişken sayıda tandem tekrarlar)'ni içerir63-65.
2- Gecikmiş tip aşırı duyarlılık testi (tüberkülin testi): Sığır TB'unun saptanması için uluslararası standart yöntem tüberkülin testidir. Tüberkülin mikobakterilerden elde edilen saflaştırılmış protein türevi (PPD)'dir10. Bu test, TB'a karşı oluşan hücresel duyarlılığı ortaya koymak için yapılmakta ve hücreye bağlı olarak şekillenen aşırı duyarlılık reaksiyonları içerisinde yer almaktadır34. Bununla birlikte, tüberkülin testinde de yanlış pozitiflik ve negatiflik görülmektedir ve yeterli spesifite ve duyarlılığa sahip değildir34. Ayrıca, yeni doğum yapmış olan hayvanlarda da hatalı değerlendirmelere neden olabilir34,66-69. Sığır tüberkülin (PPD) intradermal olarak enjekte edilir ve 3 gün sonra injeksiyon alanında şişme (gecikmiş tip hipersensitivite) saptanır10. Bu test sadece sığır tüberkülin veya avian ve sığır tüberkülinler kullanılarak karşılaştırmalı olarak uygulanabilir10. Tüberkülin testi genellikle boynun orta kısmına yapılır, fakat kuyruğun kaudal kıvrımına da yapılabilir10. Tüberküline boyun derisi kaudal kıvrım derisinden daha duyarlıdır. Bu farkı telafi etmek için tüberkülinin daha yüksek dozları kaudal kıvrımda kullanılabilir10.
İnfekte hayvanlarla temas olduğundan şüphelenildiği durumlarda bu testin kullanılması önerilmez. Çünkü yanlış negatif sonuçlar ve testin duyarlılığında bir azalma meydana gelir10. Eğer sadece tek bir tüberkülin test kullanılırsa tam eradikasyon güç olur, çünkü yanlış negatif sonuçlar hastalığın erken safhasında ve ileri derecede infekte hayvanlarda meydana gelebilir10.
Kanı Baz Alan Laboratuar Testleri
M. bovis'in teşhisinde klasik intradermal tüberkülin testi yanısıra, birkaç yeni kan testi de kullanılır70. Bu testler genellikle intradermal deri testinin sonuçlarını teyit etmek veya hatalarını düzeltmek için yardımcı test olarak kullanılırlar10. Lenfosit profilerasyon testi ve gamma interferon (IFN-γ) testi hücresel immüniteyi, ELISA ise humoral immüniteyi ölçer10.
1- Lenfosit profilerasyon test: Test bilimsel değere sahiptir, fakat testin uzun zaman alması ve laboratuar uygulamasının karmaşık (uzun inkubasyon sürelerine ve radyoaktif nükleotidlerin kullanılmasına gerek duyar) olması gibi dezavantajlarından dolayı rutin teşhiste kullanılmaz10. Bununla birlikte, test vahşi hayattaki hayvanlarda faydalı olabilir10. Lenfosit transformasyon testleri ve ELISA'yı içeren kan testinin geyiklerde M. bovis infeksiyonunun teşhisinde yüksek derecede duyarlı ve spesifik olduğu bildirilmiştir71.
ELISA
TB için klinik olarak faydalı serolojik testleri geliştirme çabaları başarısız olmuştur. ELISA hücresel immüniteyi baz alan testler için alternatiften ziyade bir tamamlayıcı test olarak uygulanabilir72. ELISA'nın tüberkülin testine alternatif olarak spesifite ve duyarlılığının düşük olduğu, fakat anerjik sığır ve geyiklerin tespitinde faydalı olabileceği bildirilmiştir73. ELISA'nın bir avantajı kolay olmasıdır, fakat hem spesifitesi hem de duyarlılığı çoğunlukla hastalığın seyri esnasında, sığırlarda geç ve düzensiz humoral immun yanıtın gelişmesine bağlı olarak sınırlıdır10. M. bovis'in üremesi sırasında salgılanan ve oldukça yüksek düzeyde tür spesifik bir protein olan MPB70 antijen olarak kullanılarak M. bovis infeksiyonlarında MPB70'e karşı oluşan antikorları saptayabilmek için bir ELISA geliştirilmiştir74.
2- IFN-γ testi: TB'un teşhisinde başarı oranını artırmak için, tam kan sığır ve kanatlı tüberkülinleri ile kültür edildiğinde, sitokinin salınımını saptamak ve ölçmek için IFN-γ testi geliştirilmiştir75. Sığırların deneysel infeksiyonlarından elde edilen sonuçlar testin post-infeksiyondan 14 gün kadar önce ve tüberkülin testinden daha erken infeksiyonu saptayabildiğini göstermiştir76. IFN-γ araştırmasına dayanan testlerin tüberküline kıyasla bazı avantajları vardır10. Avustralya'daki ilk saha çalışmaları testin TB'un teşhisi için tek intradermal tüberkülin testinden (%65,6) daha duyarlı (IFN-γ, %93.6) olduğunu göstermiştir77. Test deri testiyle kıyaslandığında yüksek duyarlılığa sahiptir, fakat birkaç çalışmada daha az spesifik olduğu ispatlanmıştır10. Bununla birlikte, tanımlanan mikobakteriyel antijenlerin kullanılması spesifiteyi artırmada ümit vericidir78. Sığırlar gibi dokunulması zor veya tehlikeli olan hayvanlarda deri testi üzerindeki avantajı hayvanların sadece bir kez zapt edilmesidir10. Test in vitro yapılır ve deri testleri gibi ölçümler gerektirmediği için sonuçlar daha az kişiseldir79.