Hidroksil radikali (^●OH), süperoksit anyonu (O₂ ^●) gibi serbest radikaller ile hidrojen peroksit (H₂O₂) gibi moleküller, reaktif oksijen türleri olarak isimlendirilirler. Vücutta reaktif oksijen türlerinin üretimi normal fizyolojik bir olay olup antioksidan sistem tarafından kontrol altında tutulur. Dişi üreme sistemi üzerindeki muhtemel etkileri hakkındaki bilgiler sınırlı olmakla birlikte, reaktif oksijen türlerinin belirli seviyeleri üreme açısından oosit olgunlaşması, üreme hormonlarının üretimi ve fertilizasyonun gerçekleşmesi gibi birçok fizyolojik olayda önemli görevler üstlenirler⁵. Bununla birlikte, reaktif oksijen türlerinin aşırı üretimi oksidatif stres olarak adlandırılır. Oluşan oksidatif stres sonucunda lipit peroksidasyon oluşur. Özellikle hücre membranları yüksek miktarda doymamış yağ asiti içermektedir. Lipit peroksidasyon membranlardaki bu hassas tabakaların yıkımlanmasına ve membran yapısının bozulmasına yol açar. Malondialdehit (MDA) lipit peroksidasyon sonucu açığa çıkan bir metabolit olup bu maddenin miktarının ölçülmesi, lipit peroksidasyonun düzeyini gösteren bir belirleyici olarak kabul edilmektedir⁶.

Antioksidanlar, dişilerde üreme faaliyetlerinin sürdürülmesi sırasında ortaya çıkan bazı problemlerin önlenmesi açısından oldukça gerekli maddelerdir⁷. Vitamin E (α-tokoferol), antioksidan sistem içerisindeki en önemli maddelerden birisi olup, üreme açısından gerekli bir vitamindir. Özellikle reaktif oksijen türlerinin yol açtığı oksidatif strese karşı hücrelerin korunmasında önemli bir role sahiptir⁸. Bununla birlikte, vitamin E'nin dişilerde oositin olgunlaşma sürecinde önemli rolleri olduğu da bildirilmektedir⁹.

Köpeklerde proöstrus başlangıcından diöstrusa kadar geçen süre, hormonal yönden yoğun değişimlerin yaşandığı ve buna bağlı olarak köpeklerde farklı fizyolojik ve davranışsal belirtilerin ortaya çıktığı dönemleri kapsamaktadır. Bu süre içerisinde oksidatif stres yönünden önemli değişimlerin olup olmadığı konusunda bilimsel bir çalışmaya rastlanılmamıştır.

Yapılan bu çalışmada, dişi köpeklerde serum vitamin E ve MDA konsantrasyonları belirlenerek östrus siklusunun farklı dönemleri arasında önemli bir değişimin olup olmadığı araştırıldı. Ayrıca elde edilen bu değerler ile bazı üreme özellikleri arasında herhangi bir ilişkinin olup olmadığı da incelendi.

Dişi köpeklerin seksüel siklus dönemlerinin belirlenmesinde hem vaginal smear örneklerinden hem de davranışsal özellikler ile klinik bulgulardan yaralanıldı. Dişi köpeklerde kanlı vaginal akıntının görüldüğü ilk gün proöstrusun başlangıcı olarak kabul edildi. Bu günden itibaren günlük olarak hayvanlardan vaginal smear örnekleri alınıp, Papanicolaou¹⁰ boyama yöntemi ile boyanarak incelendi. Mikroskobik muayene ile yapılan hücre incelemesi sonucu gözlenen hücre tiplerine ve bunların yoğunluğuna göre köpeklerin seksüel siklus içerisinde hangi dönemde oldukları belirlendi¹¹. Ayrıca dişi köpekler her gün belirli bir süre erkek köpekle aynı yerde tutularak davranışsal belirtileri incelendi. Elde edilen bulgular ışığında proöstrus ve östrus süreleri belirlendi.

Tüm dişi köpeklerden proöstrusun, östrusun ve diöstrusun başlangıcında vena cephalica antebrachi'den vakumlu tüplere 10 ml kan örnekleri alındı. Toplanan örneklerin 3000 g'de 10 dakikada elde edilen serumları analizler yapılıncaya kadar -20ºC'de muhafaza edildi. Serum MDA konsantrasyonu, Placer ve ark.¹²'nın tanımladığı spektrofotometrik yönteme göre belirlenerek elde edilen değerler nmol/ml olarak ifade edildi. Serum vitamin E konsantrasyonu ise yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) yöntemi ile tayin edilerek μg/ml olarak ifade edildi¹³.

Tüm dişi köpekler tespit edilen östrusun başlangıcından sonraki 2. ve 4. günde aynı erkek köpekle çiftleştirildi. Gebelikler ilk çiftleşmeyi izleyen 25 – 30. günlerde ultrasonografi ile (Scanner 2000, Pie Medikal, 7,5 mHz lineer prob) transabdominal yöntemle belirlendi. İlk çiftleşme ile doğum arasındaki gün sayısı gebelik süresi olarak belirlendi. Doğumu takiben doğan yavru sayısı kaydedildi.

Elde edilen değerler ortalama ± SEM olarak sunuldu. Yapılan istatistikî analizlerde önemlilik derecesi (ÖD) P<0,05 olarak değerlendirildi. Gruplar arasındaki serum vitamin E ve MDA değerleri tekrarlı ölçümlerde varyans analizi yöntemi kullanılarak incelendi. Araştırmadaki proöstrus, östrus ve gebelik süreleri ile yavru sayılarının karşılaştırılmasında ise Mann – Whitney U testi kullanıldı. Ayrıca elde edilen değerler arasında herhangi bir ilişkinin olup olmadığının belirlenebilmesi için de Pearson Korelâsyon Testi uygulandı.

Köpeklerin üreme özelliklerine ait parametreler Tablo 1 ve Tablo 2'de verilmiştir. Yapılan değerlendirme sonucunda gebe köpeklerle gebe kalmayan köpekler karşılaştırıldığında ortalama proöstrus ve östrus süreleri benzer bulundu (P>0,05). Benzer şekilde, gebe köpekler içerisinde ırklar arasında proöstrus, östrus ve gebelik süresi ile elde edilen yavru sayısı açısından istatistikî bir farklılık bulunamadı (P>0,05).

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: Köpeklerin üreme özelliklerine ait parametrelerin gebelik sonuçlarına göre karşılaştırılması.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 2: Gebe köpeklerin üreme özelliklerine ait parametrelerin ırklara göre karşılaştırılması.

Gebe köpeklerin üreme özelliklerine ait parametreler arasında yapılan korelasyon değerleri Tablo 3'de gösterilmiştir. Buna göre, gebelik süresi ile yavru sayısı arasında negatif bir ilişki (P<0,01, r=-0,829) tespit edildi. Ayrıca proöstrus süresi ile östrus süresi arasında da negatif bir ilişkinin olduğu (P<0,05, r=-0,608) saptandı.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 3: Gebe köpeklerin (n=14) üreme özelliklerine ait parametreler arasında yapılan korelasyon değerleri.

Östrus siklusunun değişik dönemlerine ait serum vitamin E değerleri Şekil 1'de gösterilmiştir. Vitamin E konsantrasyonları açısından gebe köpeklerle gebe kalmayan köpekler karşılaştırıldığında östrus siklusunun farklı dönemleri arasında herhangi bir farklılık bulunmadı (P>0,05). Ayrıca, gebe köpekler içerisinde ırklar arasında da istatistiksel bir farklılık saptanamadı (P>0,05).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: Köpeklerin östrus sikluslarının farklı dönemlerine ait serum vitamin E değerlerinin gebelik sonuçlarına ve ırklara göre karşılaştırılması.

Östrus siklusunun değişik dönemlerine ait serum MDA değerleri Şekil 2'de gösterilmiştir. MDA düzeyleri açısından gebe köpeklerle gebe kalmayan köpekler karşılaştırıldığında östrus siklusunun farklı dönemleri arasında herhangi bir farklılık belirlenmedi (P>0,05). Buna ilaveten, gebe köpekler içerisinde ırklar arasında da istatistiksel bir farklılık tespit edilemedi (P>0,05).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 2: Köpeklerin östrus sikluslarının farklı dönemlerine ait serum MDA değerlerinin gebelik sonuçlarına ve ırklara göre karşılaştırılması.

Gebe köpeklerin östrus sikluslarının değişik dönemlerine ait serum vitamin E ve MDA değerleri ile elde edilen yavru sayıları arasında yapılan korelasyon değerleri Tablo 4'de gösterilmiştir. Buna göre, vitamin E konsantrasyonunun proöstrus başlangıcında yüksek olmasının, östrus başlangıcında MDA değerinin daha düşük olması ile ilişkili olduğu (P<0,01, r=-0,699) belirlendi. Buna ilaveten, vitamin E konsantrasyonunun proöstrus başlangıcında yüksek olmasının, diöstrus başlangıcında da yüksek seviyesini sürdürmesiyle ilişkili olduğu (P<0,01, r=0,716) gözlendi. Bununla birlikte, östrus siklusunun farklı dönemlerine ait serum vitamin E ve MDA değerleri ile yavru sayısı arasında bir ilişki tespit edilemedi (P>0,05).

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 4: Gebe köpeklerin (n=14) östrus sikluslarının farklı dönemlerine ait serum vitamin E ve MDA değerleri ile elde edilen yavru sayıları arasında yapılan korelasyon değerleri.

Antioksidanlar, dişilerde üreme faaliyetlerinin sürdürülmesi sırasında ortaya çıkan bazı problemlerin önlenmesi açısından oldukça gerekli maddelerdir⁷. Vitamin E, antioksidan sistem içerisindeki en önemli maddelerden birisi olup özellikle reaktif oksijen türlerinin yol açtığı oksidatif strese karşı hücrelerin korunmasına yardımcı olur⁸. Buna ilaveten, Vitamin E üreme açısından da oldukça gerekli bir vitamindir. Vitamin E, ovulasyon sonrası oositlerin olgunlaşmasını kolaylaştırıp yapısal olarak bozulmalarını önleyerek fertilizasyon şanslarını artırır. Bu aşamada ortaya çıkabilecek bir yetersizlik erken embriyonik ölüm ve fötal rezorpsiyon sayısının artmasına yol açabilir⁹. Yapılan çalışmalarda^14-17 köpeklerde serum veya plazma vitamin E düzeyinin bireysel ve ırksal olarak önemli farklılıklar gösterdiği (11,73 – 40,70 μg/ml) gözlenirken, bu değerlerin köpeğin beslenme özelliklerine, yaşına ve cinsiyetine bağlı olarak değişebildiği de bildirilmektedir. Sunulan bu çalışmada, köpeklerde proöstrus başlangıcından diöstrusa kadar geçen dönem içerisinde serum vitamin E düzeylerinin bildirilen sınırlar içerisinde olduğu ve önemli bir değişim göstermediği (P>0,05) belirlenmiştir. Yapılan değerlendirmede, proöstrus başlangıcında yüksek vitamin E konsantrasyonuna sahip olan köpeklerde bu değerin, diöstrus başlangıcına kadar yüksek seviyede devam ettiği ve vitamin E konsantrasyonunun proöstrus başlangıcında yüksek olmasının, östrus başlangıcında MDA değerinin daha düşük olması ile ilişkili olduğu (P<0,01, r=-0,699) belirlenmiştir. Bununla birlikte, östrus sikluslarının farklı dönemlerine ait serum vitamin E ve MDA değerleri açısından köpekler arasında bireysel farklılıklar gözlenmesine rağmen bunun özellikle elde edilen yavru sayısı ile bir ilişkisinin olmadığı tespit edilmiştir.

Köpeklerde siklus boyunca vagina duvarında meydana gelen hücresel değişimler, kandaki östrojen hormonuna epitel hücrelerin verdiği tepkilerden kaynaklanmaktadır. Yüksek miktarlardaki östrojen hormonu epitel hücrelerin boynuzlaşmasına (kornifikasyon) neden olur. Oluşan bu hücresel değişimler, vaginal smear yöntemi ile tanımlanarak dişi köpeğin seksüel siklusun hangi evresinde olduğu ve yapılacak takiple östrus ve diöstrusun başlangıçları belirlenebilmektedir. Bununla birlikte sitolojik östrusun başlangıcı ile preovulatör LH pikinin zamanı ya da dişi köpeğin çiftleşmeyi kabul etmesi arasında her zaman bir ilişki olmayabilir^18,19. Köpeklerde preovulatör LH pikinin zamanı değişken olmakla birlikte genellikle östrusun ilk günü meydana gelir. Ovulasyonlar ise östrusun erken dönemlerinde preovulatör LH pikinden yaklaşık 48 ile 72 saat sonra gerçekleşir. Başlangıçta olgunlaşmamış olarak atılan primer oositler ovulasyondan yaklaşık 60 saat sonra sekunder oositler haline dönüşerek döllenme yeteneği kazanırlar. Olgunlaşan sekunder oositler ise 24 ile 36 saat kadar fertilize olma kabiliyetlerini sürdürürler^20-22. Dişi köpeklerde üremenin yönetimindeki başlıca hedefler yüksek gebelik oranı sağlamak ve ırksal özelliklere bağlı olarak maksimum canlı yavru elde etmektir. Bu amaçla dişi ve erkek köpeğin bir arada bulunduğu ve dişinin erkeği kabul ettiği durumlarda, en uygun çiftleşme zamanı ovulasyon sonrası 2 ile 5. günler arasıdır^20,23. Eğer ovulasyon zamanı kesin olarak belirlenememişse köpeklerin muhtemel ovulasyon zamanına yakın bir zamanda çiftleştirilmesi önerilmektedir²⁴. Ancak östrusun başlangıcından itibaren yaklaşık 7 günlük süre, gebeliğin oluşmasının mümkün olduğu çiftleşme periyodu olarak kabul edilir²². Çünkü köpek spermatozoasının in vivo şartlardaki yaşam süresi oldukça uzun olup tek bir çiftleşme sonrası yaklaşık 7 gün boyunca devam edebilir²⁵. Bu çalışmada gebelik oranı Labrador av köpeklerinde %87,5 (7/8), Alman çoban köpeklerinde ise %63,6 (7/11) olup ortalama %73,7 (14/19) olarak belirlenmiştir. Elde edilen değerler, Chatdarong ve ark (26)'nın üreme performansı yönünden Labrador av köpeklerinin Alman çoban köpeklerine göre daha üstün olduğunu bildirdiği çalışma sonuçlarıyla uyumluluk göstermektedir. Bununla birlikte, yapılan değerlendirme sonucunda tespit edilen üreme özellikleri ve kan parametreleri ile gebelik oranı arasında herhangi bir ilişki belirlenememiştir.

Köpeklerde gebelik süresi ilk çiftleşme ile doğum arasında geçen süre olarak kabul edilmektedir. Bu süre oldukça geniş bir aralığa sahip olup, 57 ile 72 gün arasında değişmekle birlikte ortalama 62–64 gün olarak kabul edilir. Bununla birlikte, preovulatör LH piki ile doğum arasındaki zaman dilimi neredeyse sabit olup köpeklerde bu kriter dikkate alındığında gebelik süresi ortalama 63 gün olarak kabul edilmektedir³. Gebelik süreleri arasındaki bu farklılıklar; optimum çiftleşme zamanı ile gerçek çiftleşme zamanı arasındaki farklılıklardan kaynaklanmaktadır²⁷. Bu çalışmada, ortalama gebelik süreleri Labrador av köpeklerinde 60,9 ± 0,8 gün, Alman çoban köpeklerinde ise 61,7 ± 1,1 gün olarak bulunmuş olup, sunulan değerler Okkens ve ark.²⁸'nın Labrador av köpekleri için 60,9 ± 1,5 gün ve Alman çoban köpekleri için 60,4 ± 1,7 gün olarak bildirdikleri değerlerle oldukça benzer bulunmuştur. Sunulan çalışmada, gebelik süreleri açısından ilk çiftleşme zamanları dikkate alındığında bulunan değerlerin normal sınırlar içerisinde olduğu görülmüş ve her iki ırk arasında bir farklılık tespit edilememiştir.

Yavru sayısı bir çok genetik ve çevresel faktör arasındaki etkileşime bağlı olarak değişebilen kompleks bir özellik olmakla birlikte özellikle köpeklerde ırksal olarak önemli farklılıklar gösterebilmektedir²⁸. Bunun yanı sıra köpeklerde yavru sayısının hayvanın yaşına, üreme mevsimine ve çiftleşme sayısına bağlı olarak da değişiklikler gösterebildiği ifade edilmektedir². Yapılan bazı araştırmalarda^28,29 köpek ırkları arasında yavru sayısı ortalamalarının ırka bağlı olarak önemli değişiklikler gösterdiği belirtilirken, Alman çoban köpeği ile Labrador av köpeklerinin üreme özellikleri ve yavru sayıları açısından birbirine benzerlik gösterdiği bildirilmektedir. Sunulan bu çalışmada, ortalama yavru sayısı Labrador av köpeklerinde 7,43 ± 0,92 iken, Alman çoban köpeklerinde 7,14 ± 0,59 olarak belirlenmiş ve her iki ırk arasında farklılık (P>0,05) tespit edilememiştir. Benzer şekilde, Linde-Forsberg and Wallén³⁰ Labrador av köpeklerinde ve Alman çoban köpeklerinde kızgınlıkların yıl boyunca normal dağılım gösterdiğini, elde edilen yavru sayısı açısından yılın ayları arasında farklılıkların görülmediğini ve değerlerin her iki ırk içinde birbirine yakın olduğunu bildirmişlerdir.

Okkens ve ark.^29, değişik ırktan köpekler üzerinde yaptıkları çalışmalarında gebelik süresinin ırklara göre farklılık gösterdiğini, buna bağlı olarak gebelik süresi ile yavru sayısı arasında negatif bir ilişkinin olduğunu ve daha az yavru doğuran köpeklerde gebelik süresinin fazla sayıda yavru doğuran diğer ırklara göre daha uzun olduğunu bildirmişlerdir. Yapılan bu çalışmada da, üreme özellikleri yönünden yapılan istatistiki değerlendirme sonucunda genel popülasyon dikkate alındığında doğan yavru sayısı ile gebelik süresi arasında negatif bir korelasyonun olduğu belirlenmiştir. Bununla birlikte, Tsutsui ve ark.³¹ ise yavru sayısının gebelik süresini etkilemediğini, ovulasyonların şekillenmesinden çiftleşmeye kadar geçen süre ile gebelik süresi arasında negatif bir ilişkinin olduğunu bildirmişlerdir. Kutzler ve ark.³² ise gebelik süresinin tespitinde ilk çiftleşme zamanı ile doğum arasında geçen süre dikkate alındığında yavru sayısı ile gebelik süresi arasında bir ilişkinin tespit edilebileceğini, ancak LH piki ile doğum arası sürenin yavru sayısına göre değişmediğini bildirmişlerdir. Bu çalışmada elde edilen bu sonuç da çiftleşme zamanı ile LH piki arasında geçen sürenin değişken olmasından kaynaklanabilir.

Sonuç olarak, köpeklerde serum vitamin E ve MDA konsantrasyonunun östrus siklusunun farklı dönemlerinde benzer düzeylerde olduğu ve üreme özellikleri üzerine herhangi bir etkisinin olmadığı belirlenmiştir.

1) Sundqvist AK, Björnerfeldt S, Leonard JA, et al. Unequal contribution of sexes in the origin of dog breeds. Genetics. 2006; 172(2): 1121-1128.

2) Gavrilovic BB, Andersson K, Linde Forsberg C. Reproductive patterns in the domestic dog - a retrospective study of the Drever breed. Theriogenology 2008; 70(5): 783-794.

3) Concannon PW, Whaley S, Lein D, Wissler R. Canine gestation length: variation related to time of mating and fertile life of sperm. Am J Vet Res 1983; 44(10): 1819- 1821.

4) Jöchle W, Andersen AC. The estrous cycle in the dog: a review. Theriogenology 1977; 7(3): 113-140.

5) Agarwal A, Allamaneni SS. Role of free radicals in female reproductive diseases and assisted reproduction. Reprod Biomed 2004; 9 (3): 338-347.

6) Agarwal A, Gupta S, Sharma RK. Role of oxidative stress in female reproduction. Reprod Biol Endocrinol 2005; 3: 28 (1-21).

7) Fujii J, Iuchi Y, Okada F. Fundamental roles of reactive oxygen species and protective mechanisms in the female reproductive system. Reprod Biol Endocrinol 2005; 3: 43 (1-10).

8) Chow CK. Vitamin E and oxidative stress. Free Radical Biol Med. 1991; 11(2): 215-232.

9) Tao Y, Zhou B, Xia G, et al. Exposure to l-ascorbic acid or alpha-tocopherol facilitates the developmentof porcine denuded oocytes from metaphase I to metaphase II and prevents cumulus cells from fragmentation. Reprod Domest Anim 2004; 39(1): 52-57.

10) Papanicolaou GN. A new procedure for staining vaginal smears. Science 1942; 95(2469): 438-439.

11) Johnston SD, Kustritz MVR, Olson PNS. Vaginal cytology. In: Johnston SD. (Editor). Canine and Feline Theriogeneology. 1st Edition, Philadelphia: Saunders 2001: 32-40.

12) Placer AZ, Linda LC, Johnson B. Estamination of product of lipid peroxidation (Malonly Dialdehyde) in biochemical systems. Anal Biochem 1966; 16: 359-364.

13) Driskell WJ, Neese JW, Bryant CC, Bashor MM. Measurement of vitamin A and vitamin E in human serum by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr 1982; 231(2): 439-444.

14) Stowe HD, Lawler DF, Kealy RD. Antioxidant status of pairfed Labrador Retrievers is affected by diet restriction and aging. J Nutr 2006; 136(7): 1844-1848.

15) Tran JL, Horvath C, Krammer S, Höller U, Zentek J. Blood vitamin concentrations in privately owned dogs fed nonstandardized commercial diets and after intake of diets with specified vitamin concentrations. J Anim Physiol Anim Nutr (Berl) 2007; 91(1-2): 40-47.

16) Piercy RJ, Hinchcliff KW, Morley PS, et al. Association between vitamin E and enhanced athletic performance in sled dogs. Med Sci Sports Exerc 2001; 33(5): 826-833.

17) Jewell DE, Toll PW, Wedekind KJ, Zicker SC. Effect of increasing dietary antioxidants on concentrations of vitamin E and total alkenals in serum of dogs and cats. Vet Ther 2000; 1(4): 264-272.

18) Linde C, Karlsson I. The correlation between the vaginal cytology of the vaginal smear and the time of ovulation in the bitch. J Small Anim Pract 1984; 25: 77-82.

19) Wright PJ. Application of vaginal cytology and plasma progesterone determinations to the management of reproduction in the bitch. J Small Anim Pract 1990; 31: 335-340.

20) Concannon PW, McCann JP, Temple M. Biology and endocrinology of ovulation, pregnancy and parturition in the dog. J Reprod Fertil Suppl 1989; 39: 3-25.

21) Concannon PW, Hansel W, Visek WJ. The ovarian cycle of the bitch: plasma estrogen, LH and progesterone. Biol Reprod 1975; 13(1): 112-121.

22) Tsutsui T. Gamete physiology and timing of ovulation and fertilization in dogs. J Reprod Fertil Suppl 1989; 39: 269-275.

23) England GCW, Burgess CM, Freeman SL, Smith SC, Pacey AA. Relationship between the fertile period and sperm transport in the bitch. Theriogenology 2006; 66(6-7): 1410-1418.

24) Johnston SD, Kustritz MVR, Olson PNS. Breeding management and artificial insemination of the bitch. In: Johnston SD (Editor): Canine and Feline Theriogeneology. 1st Edition, Philadelphia: Saunders 2001: 55-56.

25) England GCW, Burgess C. Survival of dog spermatozoa within the reproductive tract of the bitch. Reprod Domest Anim 2003; 38: 325-326.

26) Chatdarong K, Tummaruk P, Sirivaidyapong S, Raksil S. Seasonal and breed effects on reproductive parameters in bitches in the tropics: a retrospective study. J Small Anim Pract 2007; 48(8): 444-448.

27) Shimatsu Y, Yuzawa H, Aruga K, Nakura M. Effect of time for mating and gestation length on reproductive efficiency in dogs. Reprod Domest Anim 2007; 42(6): 664-665.

28) Hare E, Leighton E. Estimation of heritability of litter size in Labrador Retrievers and German Shepherd dogs. J Vet Behav 2006; 1(2): 62-66.

29) Okkens AC, Teunissen JM, Van Osch W et al. Influence of litter size and breed on the duration of gestation in dogs. J Reprod Fertil Suppl 2001; 57: 193-197.

30) Linde-Forsberg C, Wallen A. Effect of whelping and season of the year on the interoestrus intervals in dogs. J Small Anim Pract 1992; 33: 67-70.

31) Tsutsui T, Hori T, Kirihara N, Kawakami E, Concannon PW. Relation between mating or ovulation and the duration of gestation in dogs. Theriogenology 2006; 66(6-7): 1706- 1708.

32) Kutzler MA, Mohammed HO, Lamb SV, Meyers-Wallen VN. Accuracy of canine parturition date prediction from the initial rise in preovulatory progesterone concentration. Theriogenology. 2003; 60(6): 1187-1196.