Spermatozoonların genetik yapısındaki bozulma ile infertilite arasında kuvvetli bir
ilişki vardır. Spermatozoon DNA hasarlarının infertilitedeki önemi in vitro ve in vivo
gerçekleştirilen birçok çalışmada
1-4 ortaya konmuştur. Nitekim, hasarlı DNA taşıyan
spermatozoonun fertilizasyon kabiliyetinin azaldığı ve DNA hasarlı spermatozoon oranı
arttıkça doğal yolla gebe kalma oranın da azalabileceği bildirilmektedir. Ayrıca
intrasitoplazmik sperm enjeksiyon (ICSI) tekniğinde, hasarlı DNA'nın fertilizasyonu
önlemeyeceği ve neticede bu hasarlı genetik materyali taşıyan embriyoların oluşabileceği
bildirilmektedir. Bu nedenle ejakulatta DNA hasarlı spermatozoon oranının bilinmesi gerek
fertilizasyonun önceden tahmin edilmesinde gerekse embriyonun maruz kalabileceği
durumların belirlenmesinde önem kazanmaktadır.
DNA Hasarı:Genetik olayların moleküler düzeydeki temeli genetik materyal görevini
üstlenen nükleik asitlerin yapı ve özelliklerine dayanır. Nükleik asitlerin iki türü olan
deoksiribonükleik asit (DNA) ve ribonükleik asit (RNA) temelde aynı yapısal özelliklere
sahiptir. DNA sadece kalıtsal bilgiyi taşıyan makro moleküller olmayıp bu bilgiyi protein
sentezine aktarmaktan da sorumludur5. DNA kolay zarar görebilen bir moleküldür ve
üzerinde sürekli olarak hasar oluşmaktadır6. DNA üzerinde kendiliğinden değişimler
sonucu veya çevresel etmenler sonucu hasar meydana gelebilmekte, oluşan hasar DNA
onarım sistemleri tarafından giderilmekle birlikte, hasarın çok fazla olduğu veya onarım
sistemlerinin yetersiz kaldığı durumlarda DNA üzerinde oluşan hasar mutasyona veya
hücre ölümüne neden olmaktadır7 .
Kendiliğinden değişimler sonucu oluşan DNA hasarının nedenleri arasında; DNA
sentezi sırasında bazların yanlış eşleşmesi, purin ve pirimidin bazların ketoenol
tautomerizm ve deaminasyon sonucu kimyasal yapısında gelişen değişimler, DNA
yapısında bulunan pürin ve pirimidin bazlarının termal dayanıklılığına bağlı olarak hidrolitik baz kaybı ve hücresel metabolizmanın yan ürünü olarak
üretilen serbest radikallerin neden olduğu DNA hasarları
önemli yer tutmakta olup çevresel hasar ise fiziksel ve
kimyasal hasar olmak üzere iki grupta incelenmektedir.
DNA’nın bütünlüğünü bozup ve farklı DNA hasarlarının
oluşmasına neden olan fiziksel etkenler arasında
ultraviyole ve X-ışınları önemli yer tutmaktadır7-9.
DNA hasarlarının oluşmasına neden olan kimyasal
ajanlar içinde, çevresel mutajen ve karsinojenlerin en
geniş grubu olan ve çeşitli gıda maddelerinde, antitümöral
ilaçlarda ve tütünde bulunan alkilleyici maddeler,
fotoaktive olmuş psoralenler gibi çapraz bağlayıcılar ve
ksenobiotikler gibi elektrofilik reaktanlara metabolize
edilebilen kimyasallar yer almaktadır7.
Hücre, DNA hasarlarına farklı metabolik yollar ile
cevap verir. Ağır DNA hasarları hücrenin apopitoz yolunu
aktive ederek hücreyi ölüme götürür. DNA hasarı
replikasyon sırasında tamir edilemezse mutasyona ve
sonuç olarak genomik kararsızlığa nedenolabilmektedir8,10.
Spermatozoon DNA’sı Hasarı: Spermatozoon
DNA’sı somatik hücre DNA’sından 6 kat daha yoğunluğa
ve 40 kat daha az hacme sahiptir. Bu yoğun yapı ve
DNA’nın spesifik şekli, DNA ve protaminler arasındaki
disülfid bağları ile sağlanmaktadır. Spermatozoon
DNA’sının koruyucu özellikteki bu şekli dışında
spermatozoonun içinde bulunduğu seminal sıvı yüksek
antioksidan seviyeleri içerir11. Ayrıca, spermatozoanın
DNA hasarlarını tamir etme kapasitesine sahip
endonukleaz aktivitesi içerdiği de bilinmektedir12.
Bunun yanında DNA hasarlı spermatozoonun yetersiz ya
da yanlış tamiri yeni genetik mutasyonların gelişmesi ile
de sonuçlanabilir13. Spermatozoon DNA’sı
hasarlarının hangi nedenlere bağlı olarak ortaya çıktığı
konusu tam olarak izah edilmiş olmasa da14,
spermatozoonda Şekil 1’de görüldüğü gibi pek çok
nedene bağlı olarak DNA hasarı meydana
gelebilmektedir15. DNA hasarı geçiren spermatozoon
sonuçta tamir olabileceği gibi tamir kapasitesini aşmış ise
hasarlı olarak çoğalabilir ve spermatogenezis bir
seviyede duraklayabilir (maturasyon duraklaması) ya da
ölür14.
İnflamasyon, apoptoz ve oksidanların (serbest
oksijen türevleri, ROS) spermatozoonda kromatinin
kondanse hale geçmesini engellemektedirler.
Kromatinde yeterli kondensasyon gelişmez ise
spermatozoon DNA'sı da kırık gelişmesine daha hassas
hale gelmektedir14. Spermatozoondaki DNA hasarına
neden olan etkenlerin arasında en etkili olanları,
süperoksit anyon ve hidrojen peroksit gibi reaktif oksijen
türleridir. Spermatozoon metabolik aktivite için gerekli
enerjinin büyük bir kısmını glikoliz olayından
karşılamalarına rağmen, yüksek aerobik aktiviteleri için,
fertilizasyon olayına katılan reaktif oksijen türlerinden
(ROS) yararlanır. ROS yüksek reaktivite ile karakterize
olup, orbitallerinde eşleşmemiş bir veya daha fazla
elektron bulundurmaları diğer moleküllerle kovalent bağ
kurmalarını sağlar. Aitken ve ark.16’nın insanlarda yaptıkları bir çalışmada ROS’un miktarı ile sperma
miktarı arasında ve spermatozoonun ileri hareketliliği ile
ROS seviyesi arasında ters bir orantı olduğunu
bildirmektedirler. Yine, ROS’un sebep olduğu DNA
hasarı hücrelerin apoptozisini hızlandırmakta ve
spermatozoa sayısının azalması ile ilgili olarak, fertilite
olumsuz etkilenmektedir17.
DNA'nın parçalanması ile gerçekleşen programlı
hücre ölümü yani apopitozis, vücutta bulunan bütün
dokuların normal fonksiyon görebilmesinde önemli bir rol
oynar. Apopitoz organların sağlıklı fonksiyon
görebilmeleri için doğal olarak meydana gelebildiği gibi,
hormonal faktörler, ROS, çevresel toksinler gibi faktörler
tarafından da uyarılabilmektedir. Spermatozoa için de
aynı aynı durum geçerli olup infertilite nedeni olarak
bilinen çoğu faktör spesifik mekanizmalarla apopitoza yol açar14. Sun’i tohumlamada önemli yer tutan
spermanın kısa ve uzun süreli saklanması işlemleri DNA
hasarına ve dolayısıyla anormal embriyo gelişimine ve
infertiliteye neden olabilmektedir18. Sonuçta infertilite
olgularında spermatozoon DNA’sı hasarlarının önemli bir
faktör olabileceğinden, DNA hasarlı spermatozoon
oranının bilinmesi gerek fertilizasyon şansının önceden
tahmin edilmesinde gerekse embriyonun maruz
kalabileceği risklerin belirlenmesinde önem
kazanmaktadır.
Tek Hücre Jel Elektroforezi (SCGE): Son 20 yılda
DNA hasarlarını belirleyebilen yeni metotların
araştırılmasıyla belli bir düzeye gelinmiştir19. DNA’daki
hasar düzeyinin ölçülmesinde kullanılan en yaygın ölçme
yöntemlerinden birisi olan “Tek Hücre Jel Elektroforezi”
(SCGE) hassas, basit ve hızlı bir görsel floresan
tekniğidir20. Teknik, hücrelerde çeşitli ajanların
indüklediği DNA hasarı ve onarım bozukluklarının tayini
amacıyla genetik toksikolojiden moleküler
epidemiyolojiye kadar pek çok alanda kullanılmakta olup
“Single Cell Gel Electrophoresis”, “Comet Analiz” ya da
“Microgel Electrophoretıc Tecnique” olarak da
adlandırılmaktadır19,20.
DNA’nın kısmi olarak çözünmesine izin veren hafif
alkali koşullar altında preparat üzerindeki agarozda
hücrelerin liziz edilmesi ve gömülmesi ile bu hücrelerdeki
DNA hasarını ilk belirleyenlerin Rydberg ve Johanson
olduğu bildirilmektedir6,19. Nötralizasyondan sonra
akridin oranj ile DNA’yı boyamışlar ve DNA’daki hasarın
boyutunu fotometre ile yeşil floresansın (çift zincir
kırıklarını gösteren) kırmızı floresansa (tek zincir
kırıklarını gösteren) oranı olarak belirlemişler ancak bu
teknik çok yaygın olarak kullanılmamıştır6,19.
İlerleyen zaman içerisinde hücrelerdeki DNA hasar
tespitinde duyarlılığı geliştirmek için 1984 yılında Ostling ve Johanson tarafından nötral teknik modifiye edilerek
hücredeki DNA hasarının direkt gösterilmesinde
“Microgel Electrophoretıc Tecnique” olarak sunulmuştur21. Bu uygulamada agarozda süspanse edilen
radyasyona maruz kalmış hücreler lam üzerine yayılarak,
yüksek tuz ve deterjanla lize edilmiş ve ardından
elektroforeze tabi tutulduktan sonra DNA bağlayıcı
floresan boya olan akridin oranjla boyanmışlardır21.
Sonuçta kırık içeren DNA’ların gevşediğini, kırılmış DNA
fragmanları nedeni ile elektrik yük kazandığını ve
çekirdekten anota doğru göç ederek kuyruklu yıldız
görünümünü vermesinden dolayı hasarlı hücreleri
“COMET” olarak adlandırmışlardır. Yine kuyruk uzunluğu
DNA hasarını saptamak için ölçülmüş ve kuyruk
uzunluğunun radyasyon dozunun bir fonksiyonu olduğu
belirlenmiştir22.
Ancak bu teknik sadece DNA çift dal kırılmalarının
belirlenmesine imkan vermektedir19. Oysa DNA’da
hasar oluşturan çoğu ajan DNA çift sarmalından ziyade
DNA tek sarmalında hasar meydana getirmektedir.
Bunun yanında nötral şartlarda proteinler tam olarak
uzaklaştırılamamaktadır23. Bu nedenle “Alkalin Comet
Metodu” 1988 yılında tanımlanmıştır. Böylece “tek sarmal
kırıkları” denilen ve sadece alkali teknikle ortaya
çıkarılabilen DNA tek sarmal kırıklarını tanımlama imkanı
doğmuştur6,19,20. Kullanılan daha güçlü lizis
koşulları proteinlerin % 95’inden fazlasını yok
edebilmekte böylelikle tekniğin yeni dizaynı hücrelerin
hemen hepsinde DNA hasar büyüklüğünün doğrudan
tespitine olanak sağlamaktadır.
Elektroforez ve lizis aşamalarının pH’sına bağlı
olarak tekniğin duyarlılığı değişebildiğinden nötral ve
alkalin lizis solüzyonları sırasıyla çift ve tek sarmal
kırılmalarını belirlemek için kullanılmaktadır (Tablo 1)19,24.
Spermatozoon DNA’sı Hasarının Tespitinde Alkali
SCGE Tekniğinin Uygulanması: Geçmiş yıllarda SCGE
tekniği birkaç değişikliğe uğrasa da temelini teşkil eden
prensipler nötral ve alkalin versiyonlara dayanmaktadır19. Teknik kısaca, alkali pH da farklı molekül
ağırlıklarına ve farklı elektrik yüküne sahip DNA
moleküllerinin elektriksel alanda farklı şekilde göç
etmeleri esasına dayanır. Spermatozoon lam üzerinde
agaroza gömülür. Yüksek tuz ve deterjan içeren lizis
solusyonunda membranların parçalanarak protein bağları
çözülür ve spermatozoon DNA’sı açığa çıkarılır. Daha
sonra DNA’ların elektroforez de yürütülmeleri esnasında
hasarsız DNA’lar kuyruk yani comet oluşturmazken hasarlı DNA’ların fragmentleri oluşan hasardan dolayı
farklı moleküler ağırlıklara ve farklı elektrik yüklerine
sahip olduklarından elektriksel alanda farklı hızda
hareket ederek kuyruk şeklinde bir görüntü
oluşturmaktadırlar (Şekil 2). Floresan boyama
sonucunda elde edilen DNA göç görüntüleri
değerlendirilip DNA hasarı hakkında bir kanı oluşturulur25-27.
Bu ölçüm yönteminde yapılan işlemler laboratuar
koşullarına göre farklılık göstermekle beraber
spermatozoon DNA’sında oluşan hasarın tespit edilmesi
amacıyla uygulanan SCGE yöntemi değişik aşamalardan
oluşmaktadır (Şekil 3).
 Büyütmek İçin Tıklayın |
Şekil 3: SCGE Yönteminin Genel Aşamaları 1: Sperma süspansyonunun hazırlanması, 2: Slaytların hazırlanması ve
spermatozoonların agoroza gömülmesi, 3:Lizis, 4:DNA sarmalının çözülmesi ve Elektroforez, 5: Nötralizasyon ve
Boyama, 6-7: Hasarlı ve Hasarsız DNA Görüntülerinin elde edilmesi ve Değerlendirme |
Sperma Süspansiyonunun Hazırlanması: Hücrelerdeki DNA hasarını tespit etmek amacıyla
uygulanan SCGE yönteminde, değerlendirilecek
hücreler, hücreler arası ayrıma imkân sağlayacak bir
şekilde süspanse edilmelidir. Bir klinik örnekten ya da
canlıdan alınan hücrelerde DNA hasarının
ölçülmesindeki asıl olay örneklerin ekstra hasara veya
ilave bir onarıma imkan vermeksizin işlenmesi ve izole
edilmesidir19,28. Bu nedenle alınan ejekulat en geç
30 dk. içerisinde polipropilen bir tüpe alınıp havayla
teması önlenerek karanlık ortamda ve soğuk zincirde
korunmalıdır25. Sperma phosphate buffered saline
(PBS) ile iki kez yıkanarak aynı koruyucu önlemler
altında çalışmanın bir sonraki aşamasına hazır hale
getirilmektedir15.
Slaytların Hazırlanması ve Spermatozoonların
Agoroza Gömülmesi: SCGE yönteminde slaytlar tek
agaroz tabakalı ya da daha yaygın olarak kullanılan 3
tabakalı sandviç yöntemleri ile hazırlanır. Tek tabakalı
yöntemde hücreler düşük donma sıcaklığına sahip
agaroza gömüldükten sonra buzlanmış lam üzerine
yayılır. Üç tabakalı sandeviç yönteminde ise hücreler orta
katmandaki düşük donma dereceli agaroza gömülürler.
Tabaka hazırlamada yeterli manipulasyon kabiliyeti ve
analiz boyunca jellerin lam üzerinde donmuşluğu
korunabilmelidir19. Bu nedenle spermatozoon DNA
hasarı tespitinde sandviç modelinin uygulanması
manipulasyon kolaylığı bakımından tercih edilmektedir.
Yöntemde 10x PBS içerisinde hazırlanan % 0.75’lik
normal kaynama dereceli agaroz (NMA) jelden 100 μl
alınarak tamamen buzlanmış ya da etrafları buzlanarak
çerçeve oluşturulmuş lam üzerine damlatılarak froti
şeklinde yayılır ve katılaşması için oda sıcaklığında
bekletilir6. Etkili bir analiz için hücrelerin dilüsyonu ve
agarozun yoğunluğu önemlidir19. Bu nedenle 10 μl
PBS içinde yaklaşık 100.000 spermatozoa olacak şekilde
sperma solüsyonunun dilüsyonu sağlanmalıdır25.
Daha fazla hücre kullanılırsa oluşan görüntünün analizi
zorlaşabilmektedir19. Dilüye edilen süspansyondan 10
μl alınarak 80 μl % 0,5-1 oranında düşük kaynama
dereceli agaroz (LMA) jel ile (37 ºC) karıştırılarak birinci
agaroz kat üzerine tabakalandırılır lamel ile kapatılarak
buzdolabında donması için bekletilir24-26. Üçüncü
tabakadaki agaroz oranı jel boyutuna bağlı olarak
değişebilir. Bu amaçla % 0,5-1 konsantrasyonda LMA
ikinci tabakanın üzerine ince bir kat halinde
tabakalandırılarak slaytların hazırlanması tamamlanır19,26.
Hücre Lizisi: Lizis solüsyonu hücre ve çekirdek
zarını lize edip DNA sarmallarının agaroz içinde serbest
kalmasını sağlamak amacıyla kullanılmakta olup
spermatozoonlar lam üzerinde agaroz jele gömüldükten
sonra, slaytlar yüksek yoğunlukta tuz ve deterjan içeren
taze hazırlanmış soğuk lizis solüsyonunda (2.5 M NaCl,
100 mM Na2-EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X-100 ve
10% dimethyl sulfoxide (DMSO), pH 10) yaklaşık 1 saat
süre ile inkube edilir6,27,29. Bir saat sonunda soğuk
lizis solüsyonundan çıkarılan slaytlar 4 saat süre ile 37ºC
de 100 μg/ml proteinase K içeren lizis solüsyonunda
tekrar inkübe edilerek hücrelerin lize olup DNA
sarmallarının agaroz içinde serbest kalması sağlanmış
olmaktadır26,30.
DNA Sarmalının Çözülmesi ve Elektroforez: SCGE
yönteminde, DNA sarmalının çözülmesi ve elektroforez
süresi, çalışılmakta olan hasar ile incelenmekte olan
hücre tipine bağlı olarak değişebilmektedir19.
Elektroforezde yürütmeden önce DNA zincirlerinin
ayrılması için slaytlar elektroforez tamponunda 20-30 dk.
arasında inkübasyona bırakılırlar26. Bu inkübasyon
döneminin amacı yüksek yoğunluklu tuzlu lizis
solüsyonun DNA ile bir elektrotmuş gibi mücadele ettiği
tabakadaki agardan ayrılmasını sağlamaktır19.
Agaroza gömülü spermatozoonların elektroforez
tamponunda (300 mM NaOH ve 1 mM EDTA, pH 12.5)
inkübasyonu tamamlandıktan sonra DNA’lar bu tampon
çözelti içerisinde 250 mA ve 12 volt’luk elektriksel alanda
(0.714 V/cm) minimal ışık altında 20 dk. yürütülür25,26. Mikroskobik deneylerde DNA’nın yalnızca 1mm
oranında ilerlemesinin comet formasyonu için yeterli
olduğu bildirilmektedir19.
Nötralizasyon ve Boyama: Elektroforezde yürütme
işlemi tamamlandıktan sonra alkali elektroforez
çözeltisini slaytlardan uzaklaştırmak için, slaytlar taze
hazırlanmış Tris tamponuyla (40 mM Tris, pH 7.4) 3 kez
yıkanarak nötralizasyon sağlanır25,26. Nötralizasyon
tamamlandıktan sonra slaytlara floresan boya tatbik
edilerek DNA’lar boyanır. Görsellik için kullanılan DNA’yı
tespit eden boyayla ilgili tekniğin son adımı, büyük ölçüde araştırıcının ihtiyaçlarına dayanır ve çalışmanın
duyarlılığında çok az etkisi vardır. Daha çok kullanılan
boya ethidium bromid, propidium iyodid, dihydrochloride
ve YOYO-1 dir19,26,30.
Hasarlı ve Hasarsız DNA Görüntülerinin Elde
Edilmesi ve Değerlendirme: Floresan boya ile boyanan
slaytlardan floresan mikroskop ile elde edilen DNA
görüntüleri değerlendirilerek hasar düzeyi hakkında bir
kanıya varılır6. Bu nedenle SCGE yönteminde
sonuçların değerlendirilmesi için farklı teknikler
kullanılmaktadır. Kullanılan en yaygın kriterler; kuyruklu
hücrelerin yüzdesi, kuyruktaki DNA yüzdesi, kuyruk
uzunluğu ve kuyruk içindeki toplam DNA oranıdır.
Gelişmiş teknolojik imkanlara sahip olmayan laboratuvarlarda
hasarlı hücreler görsel skorlama yöntemi ile
subjektif olarak değerlendirilmektedir31. Teknikte
hasarsız hücrelerin incelenmesinde yuvarlak, kenarları
daha az yoğun olmak üzere ortası parlak bir ışık
görünümüdür. Hücrelerin bu görünümü göç etmemiş
olarak değerlendirilir. Eğer DNA hasarı oluşmaya
başlamış ise göç uzunluğu fragmentlerin miktarına, DNA
zincir kırılmalarına ve alkali-labil bölgelerin seviyesine
bağlı olarak değişiklik göstereceğinden, normalde
düzgün kenarlı olan görüntü DNA kırıklarının çekirdek
dışına göçmesi nedeniyle düzensiz kenarlı bir görünüm
alır. Hasarın şiddetine göre merkezden kenara doğru
uzama oluşur. Bu görünüme “gerilmiş (stretch) ya da
düşük dereceli göç (low migration)” adı verilmektedir.
Hasar arttıkça hücreler kuyruklu yıldız comet, yüksek
dereceli göç (high migration) şeklini alır. Son aşama ise
apoptozistir. Bu uzama hasar ile doğru orantılıdır. Ayrıca
kuyruktaki floresan yoğunluğu da hasarın derecesine
paraleldir22. Fakat bu yaklaşım hasarlı hücreler
arasındaki tahribatın büyüklüğü hakkında bilgi vermekte
yetersiz kalmaktadır. Bu nedenle hasarlı hücreler, oluşan
hasarın derecesine göre DNA görüntüleri çeşitli alt
kategoride sınıflandırılarak puanlandırılır19. Hasar
bulunmayan DNA’lar 0, hasar olan DNA’lar hasarın
derecesine göre Şekil 4’de görüldüğü gibi 1 den 4’e
kadar puanlandırılır ve sonuçlar görsel skorlama (AU) ile
değerlendirilir29,32.
 Büyütmek İçin Tıklayın |
Şekil 4: Görsel Skorlama Tekniği (AU) İle Hücrelerin
Sınıflandırılması (0:Hasarsız DNA Görüntüsü, 1-4:
Hasarlı DNA’ları hasarın derecesine göre puanlanması)6 |
Gelişmiş laboratuarlarda sonuçların
değerlendirilmesinde kameralı bilgisayar sistemine sahip
görüntü analiz sistemiyle hasarlı hücrelerin baş
uzunluğu, baş ve kuyruktaki DNA yüzdesi gibi çeşitli
comet parametreleri özel bilgisayar yazılımları
kullanılarak başarılı ve objektif olarak
değerlendirilebilmektedir20,33,34. Son yıllarda
değerlendirmede Laser-scainning microscopy (LSM)
teknolojisi kullanılarak DNA sarmal kırıklarındaki
farklılıklar kolaylıkla tespit edilmektedir19,20.
Canlı popülasyonlarının genetik bütünlüğü, bir çok
genotoksik ajan, yaşam biçimi, çeşitli tıbbi tedaviler, iklim
değişiklikleri ve bir çok stres faktörü nedeniyle giderek artan bir baskı altında olduğundan DNA hasarlı
spermatozoon oranının bilinmesi gerek fertilizasyon
şansının tahmin edilmesinde ve gerekse embriyonun
maruz kalabileceği risklerin belirlenmesinde önem
kazanmaktadır. Ayrıca yardımcı üreme tekniklerinden
IVF, ICSI uygulaması ve ticari sperma üretiminden önce
DNA hasarının varlığının araştırılması zorunluluk haline
gelmiştir. Sonuç olarak, SCGE tekniği, spermatozoon
DNA’sında olaşabilecek hasarların ölçümünde; tek veya
çift sarmal DNA hasarlarının ayrı ayrı görülebilmesi,
düşük bir bütçe ile yürütülerek verilerin hızlı, hassas ve
etkili olarak elde edilebilmesi gibi avantajlarından dolayı
giderek yaygınlaşan bir kullanım alanı bulacaktır.