Listeriyozise karşı koyunlar sığırlara göre daha duyarlıdır⁸. Yetişkin koyunlarda merkezi sinir sistemini en çok etkileyen bakteriyel hastalığın L. monocytogenes kaynaklı olduğu vurgulanmıştır⁹. Beş haftalıktan küçük kuzularda septisemik form gelişirken, 4- 8 aylık kuzularda ensefalitis ortaya çıkabilir^5,10. Bu karakteristik hareketten dolayı dönme hastalığı olarak da isimlendirilir¹¹. Sinirsel lezyonlar genel olarak tek taraflı şekillenir. Ölüm genellikle klinik bulguların başlamasından sonraki 2-3 gün içinde ortaya çıkar. Abortus ve ölü doğumlar genel olarak ileri gebelik dönemlerinde gözlenir. Abortus formu gelişen bazı gebe koyunlarda iştahsızlık ve ateş dışında başka bir semptoma rastlanmaz^5,10,12,13.

Ani yem değişikliği, sürüye yeni hayvan girişi, kalabalık, diş değiştirme, sindirim kanalı epitelini etkileyen viral ve bakteriyel hastalıklar gibi stres faktörleri listeriyal enfeksiyona duyarlılığı arttırabilir^2,14-16. Özellikle kuraklığı takip eden dönemlerde fazla yağış, soğuk ve yetersiz havalandırma hastalık için diğer hazırlayıcı faktörleri oluşturur¹⁷.

Hastalıkta klinik semptomlar şüphe uyandırmakla birlikte, kesin teşhiste postmortem olarak bakteriyolojik kültürün yapılması, gram boyama, immunohistokimya ve PCR’ın kesin tanıda gerekli olduğu ifade edilmektedir^4,5,9,12.

Bu çalışmada, L. monocytogenesis enfeksiyonu teşhis edilen bir koyun sürüsündeki klinik, patolojik ve mikrobiyolojik bulguların tanımlanması amaçlanmıştır.

Nekropsi sonrasında beyin ve medulla spinalisten alınan doku örnekleri önce Listeria Enrichment Broth (LEB, LabM; İngiltere) içerisinde 30°C’de 48 saat süreyle selektif zenginleştirmeye bırakıldı. Zenginleştirme işleminin ardından Oxford formülasyonlu Listeria Isolation Medium (LabM; İngiltere)’a ekim işlemi gerçekleştirildi. Besi yerleri 37°C’de 48 saat inkubasyonun ardından kontrol edildi ve siyah koloni oluşturan koloniler Listeria spp. şüpheli kabul edilerek polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile identifikasyon amacıyla saf olarak izole edildi.

PCR işlemi amacıyla öncelikle Listeria spp. şüpheli olarak izole edilen kolonilerden klasik Proteinase K - Fenol: Kloroform: İzoamilalkol ekstraksiyon yönteminden yararlanıldı. Ekstrakte edilen DNA’lara uygulanan PCR işleminde Border ve ark.²⁰ tarafından bildirilen listeriolysin genine spesifik (LM1- CCTAAGACGCCAATCGAA ve LM2- CGCTTGCAACTGCTC) primerler kullanıldı. PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi neticesinde oluşan 702 bp moleküler uzunluğundaki bantlar L. monocytogenes’in göstergesi olarak kabul edildi. PCR uygulamalarında pozitif kontrol olarak ATCC 35152 L. monocytogenes, negatif kontrol olarak steril distile su kullanıldı.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: A. Tek taraflı göz kapağı felci (ok başı). B. Alt dudakta sarkma (ok başı).

Biyokimyasal olarak incelenen parametrelere ait sonuçların gösterildiği Tablo 1 incelendiğinde, saptanan değerler sağlıklı koyunlar için verilen normal referans aralıklarda idi ve dikkat çekici bir değişime rastlanılmadı.

Nekropside makroskobik olarak meningeal damarların dolgun, sulkusların ise yer yer donuk bir görünüm aldığı gözlendi. Mikroskobik olarak; beyinde pons ve medulla oblongatada aksonal dejenerasyon, malasi odakları ve mikroapse formasyonları ile karakterize şiddetli purulent ensefalitis dikkati çekti. Malasi odaklarında nötröfil lökositler ile birlikte sitoplazmalarında çok sayıda vakuol içeren gitter hücreleri mevcuttu. Çok sayıda perivasküler boşluğun çoğunluğu mononüklear hücreler daha az olarak da nötrofil lökositler ile dolu olduğu gözlendi (Şekil 2A). Submeningial yerleşim gösteren nötrofil infiltrasyonları, ödem ve hiperemi ile karakterize fokal meningitis saptandı. Gri madde içerisindeki küçük ve orta çaptaki damarlarda diapedezis mevcuttu. Gram boyamada mikroapse odaklarının merkezindeki nötrofillerin sitoplazmasında ve serbest halde az sayıda ufak koyu mor-siyah renkte gram pozitif bakteri çomakları tespit edildi (Şekil 2B). Serebellum folialarında şiddetli hemoraji dikkati çeken bir değişimdi. Medulla oblongata’daki perivasküler hücre infiltrasyonlarının, pons bölgesine göre daha şiddetli olduğu gözlendi. Medulla bölgesinde mikroapse formasyonları arasında aksonal dejenerasyona ilişkin eozinofilik ve şişkin görünümde sferoid formasyonlar tespit edildi (Şekil 2C).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 2: A. Medulla oblongatada şiddetli perivasküler hücre infiltrasyonları (ok başları). HE, Bar = 200 μm. B. Mikroapse odağında, serbest ve nötrofil sitoplazması içindeki L. monocytogenes etkenleri (ok başları). Hucker- Corn Gram Boyama, Bar = 20 μm. C. Beyin sapındaki mikroapse odakları ile birlikte dejeneratif aksonlarda sferoid formasyonları (ok başları), HE, Bar = 100 μm.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: L. monocytogenes enfeksiyonlu koyunlarda saptanan bazı biyokimyasal parametrelerin ortalama değerleri (O), standart sapmaları (SD) ve referans değerler

Üç koyuna ait beyinden alınan örneklerin Oxford formülasyonlu Listeria İsolation Medium (LabM, İngiltere)’da siyah koloni oluşturarak Listeria spp. şüpheli olarak belirlenen izolatlara uygulanan PCR amplifikasyonu neticesinde şüpheli izolatların tamamında pozitif kontrolle aynı moleküler uzunluğa sahip 702 bp’lik amplifikasyon ürünleri gösterdikleri tespit edildi (Şekil 3)

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 3: Listeria spp. olarak identifiye edilen şüpheli izolatların L. monocytogenes’e spesifik PCR amplifikasyonları neticesinde agaroz jeldeki görünümleri. M: 100 bp DNA Ladder (Fermentas, SM0321), 1-3: L.monocytogenes olarak şüphelenilen koloniler, N: Negatif Kontrol (Steril distile su), P: Pozitif Kontrol (ATCC 35152 L. monocytogenes).

Sürüdeki tüm koyunlar Listeria spp. ile enfekte olsalar dahi, doğal direnç nedeniyle ancak % 5-10’unda hastalığa ilişkin klinik belirtilerin ortaya çıktığı ifade edilmiştir¹⁷. Hayvanlarda gözlenen çoğu vaka subklinik olmasına rağmen listeriyozis sporadik veya epidemik karakterde olarak²⁴ yaşamı tehdit eden septisemi ve meningitislere de neden olabilir^5,25. Ruminantlarda listeriyozis tipik olarak etkenle kontamine silaj veya diğer yem maddelerinin tüketilmesinden sonra oluşmaktadır. Enfeksiyonun özellikle kış aylarında hayvanlara silajın daha fazla yedirilmesi nedeniyle kış - ilkbahar aylarında ortaya çıktığı vurgulanmıştır^5,8,26. Bu çalışmada da, koyunlara yedirilen silaj örnekleri alınarak mikrobiyolojik ekimleri yapılmış ve ekim sonucunda Listeria spp. üretilmiştir. Bu nedenle de sürüde ortaya çıkan olayda enfeksiyon kaynağının silaj olduğuna karar verilmiştir. Ek olarak sunulan çalışmada literatür bilgilerine^5,11,12 uyumlu olarak L. monocytogenesis enfeksiyonu silaj tüketimi takiben Nisan ayında ortaya çıkmıştır.

Listeriyozisli koyunlarda klinik olarak ensefalitis, septisemi ve abortuslar gözlenmektedir. Bu semptomlara ek olarak depresyon, iştahsızlık, ateş ve ölümler görülebilir. Ruminantlarda hastalığın en yaygın bulgusu olan ve dönme hastalığı olarak isimlendirilmesine neden olan ensefalitik formda, ayrıca başı bir yere dayama, bir tarafa doğru bükme ve tek taraflı fasiyal felçlerde dikkati çeker^5,27,28. Çalışmada klinik olarak etkilenen 25 koyunda saptanan bulgulardan, iştahsızlık (14 adet), yavru atma (3 adet), zayıflama (6 adet), opistotonus (1 adet), tek taraflı sol üst göz kapağının paralizi (1 adet) ve aşırı salivasyon ile birlikte alt dudakta sarkma (2 adet) hastalıkta gözlenebilen semptomlarla uyumlu bulunmuştur.

Patolojik olarak listeriyozisli hayvanlarda beyinde dikkat çekici makroskobik lezyonlar nadir olarak gözlenmektedir. Ancak ensefalitik formda serebrospinal sıvıda bulanıklaşma ve meningeal damarların konjesyonu dikkati çekebilir. Çalışmada listeriyozis saptanan koyunların nekropsisinde iç organlarda makroskobik herhangi bir değişime rastlanmamıştır. Makroskobik olarak sadece göz kapağı felci bulunan hayvanda meningeal damarların dolgun, sulkusların ise yer yer donuk bir görünüm aldığı gözlenmiştir.

Ensefalitik listeriyozis enfeksiyonlarında histopatolojik olarak merkezi sinir sisteminde perivasküler lenfosit, histiyosit, plazma hücreleri ve daha az olarak nötrofilleri içeren yangısal hücreler gözlenmektedir^12,29,30. Ek olarak medulla ve ponsta malasi ile birlikte parankimal mikroapseler gözlenebilir^12,29. Bu tip lezyonlarda, bakteriler fagositler içerisinde veya nekrotik alanlar etrafındaki beyin parankiminde serbest olarak nispeten bol miktarda bulunur^29,30. Sunulan çalışmada ise, beyinde pons ve medulla oblongata’da aksonal dejenerasyon, malasi odakları ve mikroapse formasyonları ile karakterize şiddetli purulent ensefalitis dikkati çekmiştir. Çalışmada listeriyozisli koyunlarda saptanan bulgular yukarıda ifade edilen literatürlerle uyumlu bulunmuştur. Ek olarak serebellum folialarında şiddetli hemoraji saptanmış ve medulla oblongata’daki perivasküler hücre infiltrasyonlarının pons bölgesine göre daha şiddetli olduğu gözlenmiştir.

Listeriyozis sadece L. monocytogenes’in izolasyonu ve identifikasyonu yoluyla doğrulanabilir⁵. Listeriyozisin teşhisinde klinik bulgular, beyindeki histopatolojik lezyonlar ile enfekte dokulardaki organizmaların izolasyonu ve identifikasyonu temel teşkil etmektedir. Septisemi veya ensefalitisli hayvanlarda kan ve serebrospinal sıvı kültürleri yapılabilir. Dokulardaki listeriya etkenleri biyokimyasal ve enzimatik reaksiyonlara dayalı çok sayıda ticari hızlı teşhis metotlarıyla ortaya konabilir. ELISA, immunofloresan, immunokromatografi ve PCR bu teknikler arasında yer almaktadır²³. Serolojik yöntem rutin teşhis yöntemleri arasında yoktur. Çünkü çoğu sağlıklı hayvan yüksek listeriyal titreye sahip olabildiği gibi, enterokoklar ve Staphylococcus aureus gibi diğer mikroorganizmalarla çapraz reaksiyonlar gelişebilir^23,31,32. Gram boyama ile dokulardaki bakterilerin zor tespit olabileceği vurgulanmış, listeriyozisin teşhisinde immunohistokimyanın tercih edilebileceği ifade edilmiştir. Loeb^33, bakteri kültürünün %28.5, gram boyamanın %47.6, immunohistokimyanın ise %80.9 oranda duyarlı olduğunu bildirmiştir³³.

Her ne kadar hastalığın teşhisinde klinik ve patolojik bulgular değerli olsa da kesin tanı açısından hastalıklı organlardan etken izolasyonu ve moleküler konfirmasyonu büyük öneme sahiptir. Bununla birlikte bakteriyolojik kültür işlemlerinin uzun zaman alması ve zahmetli olması gibi dezavantajları vardır. Son yıllarda konvansiyonel yöntemlere alternatif olarak, spesifitesisensitivitesi yüksek, daha hızlı ve güvenilir bir yöntem olarak kabul edilen PCR metodu listeriya etkenlerinin identifikasyonunda çok yoğun olarak kullanılmaktadır³⁴. Mevcut çalışmada hem klinik olarak hasta koyunlardan alınan kan, süt ve dışkı örneklerinden hem de silodan alınan silaj örneklerinden selektif besi yerlerine bakteriyolojik ekimler yapılarak listeriyal etkenler üretilmiştir. Ayrıca karaciğer, böbrek, dalak, beyin, beyincik ve beyin sapı örnekleri de selektif zenginleştirmeye bırakılmış ve bu işleminin ardından Oxford formülasyonlu Listeria Isolation Medium (LabM; İngiltere)’a ekim işlemi gerçekleştirilmiştir. Besi yerlerinde siyah koloni oluşturan koloniler Listeria spp. şüpheli kabul edilerek PCR işlemine tabi tutulmuş ve bu işlemde 702 bp moleküler uzunluğundaki bantlar L. monocytogenes’in göstergesi olarak kabul edilmiştir. Hastalığın ayırıcı teşhisinde bakteriyolojik olarak etkenin ortaya konulması, L. monocytogenes’in isolasyonu ve identifikasyonu ile immunohistokimyanın gerekli olduğu ifade edilmiştir^5,23,31,32. Mevcut çalışmada hem bakteriyel kültür, hem PCR ve hem de Gram boyama yapılarak etken ve muhtelif lezyonlar ortaya konularak hastalığın kesin teşhisi sağlanmıştır.

Sonuç olarak bu çalışma ile erişkin koyunlarda silaj tüketiminden kaynaklanan doğal L. monocytogenes ensefalitislerindeki klinik, patolojik, biyokimyasal ve mikrobiyolojik bulgular sunulmuş, hastalığın kesin teşhisinde klinik, makroskobik ve histopatolojik değişimlerin yanı sıra bakteriyolojik kültür ve PCR’ın önemli teşhis metotları olarak kullanılabileceği vurgulanmıştır.

1) Gouly E, Mengauo J, Cossart P. The virulence gene cluster of Listeria monocyto- genes is also present in Listeria ivanovii, an animal pathogen, and Listeria seeligeri, a nonpathogenic species. Infect Immun 1994; 62: 3550- 3553.

2) Killinger AH, Mansfield ME. Epizootiology of listeric infection in sheep. J Am Vet Med Assoc 1970; 157: 1318- 1324.

3) Low JC, Wright F, McLauchlin J, et al. Serotyping and distribution of Listeria isolates from cases of ovine listeriosis. Vet Rec 1993; 133: 165-166.

4) Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schrecken-Berger PC, Winn WC. Diagnostic Microbiology. 5th edition, Philadelphia: Lippincott company, 1997.

5) Aiello SE, Mays A. The Merck Veterinary Manual. 8th edition, Philadelphia: Whitehouse Station NJ, Merck and Company, 1998.

6) Radostits OM, Gay CC, Blood DC, Hinchcliff KW. Veterinary Medicine, a Textbook of the Disease of Cattle, Sheep, Pigs, Goats and Horses. London, United Kingdom: W.B. Saunders Company Ltd, 2000.

7) Wesley IV, Larson DJ, Harmon KM, Luchansky JB, Schwartz AR. A case report of sporadic ovine listerial meningoencephalitis in Iowa with an overview of livestock and human cases. J Vet Diagn Invest 2002; 14: 314-321.

8) Wiedmann M, Arvik T, Bruce J, et al. Investigation of a listeriosis epizootic in sheep in New York State. Am J Vet Res 1997; 58: 733-737.

9) Scott PR. A field study of ovine listerial meningoencephalitis with particular reference to cerebrospinal fluid analysis as an aid to diagnosis and prognosis. Br Vet J 1993; 149: 165-170.

10) Summers BA, Cummings JF, De Lahunta A. Veterinary Neuropathology. Mosby: St. Louis, 1995.

11) Nightingale KK, Fortes ED, Ho AJ, et al. Evaluation of farm management practices as risk factors for clinical listeriosis and fecal shedding of Listeria monocytogenes in ruminants. J Vet Med Assoc 2005; 227: 1808-1814.

12) Low JC, Donachie W. A review of Listeria monocytogenes and listeriosis. Vet J 1997; 153: 9-29.

13) Milli Ü, Hazıroğlu R. Sinir Sistemi: Veteriner Patoloji 1. Cilt. Ankara: Medipress, 2000.

14) Fenlon DR, Wilson J, Donachie W. The incidence and level of Listeria monocytogenes contamination of food sources at primary production and initial processing. J Appl Bacteriol 1996; 81: 641-650.

15) Green LE, Morgan KL. Descriptive epidemiology of Listeria meningoencephalitis in housed lambs. Prev Vet Med 1994; 18: 79-87.

16) Fenlon DR. Wild birds and silage as reservoirs of Listeria in the agricultural environment. J Appl Bacteriol 1985; 59: 537-543.

17) Wesley IV. Listeriosis in animals. In: Ryser ET, Marth EH. (Editors) Listeria, Listeriosis, and Food Safety. Second edition, New York: Marcel Dekker 1999: 39-74.

18) Luna LG. Manual of histologic staining methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3rd edition, New York: McGraw-Hill, 1968.

19) Hucker GJ, Conn HJ. Methods of Gram-staining. NY Agr Expt Sta Tech Bull, 1923; 128.

20) Border PM, Howard JJ, Plastow GS, Siggens KW. Detection of Listeria species and Listeria monocytogenes using polymerase chain reaction. Lett Appl Microbiol 1990; 11: 158-162.

21) Farber JM, Peterkin PI. Listeria monocytogenes a food borne pathogen. Microbiol Rev 1991; 55: 476-511.

22) Malik SV, Barbuddhe SB, Chaudhari SP. Listeric infections in humans and animals in the indian subcontinent: a review. Trop Anim Helat Prod 2002; 34: 359-381.

23) Hof H, Nichterlein T, Kretschmar M. Management of listeriosis. Clin Microbiol Rev 1997; 10: 345-357.

24) Roberts AJ, Wiedemann M. Pathogen, host and environmental factors contributing to the pathogenesis of listeriosis. Cell Mol Life Sci 2003; 60: 904-918.

25) Lorber B. Listeriosis. Clin Infect Dis 1997; 21: 1-9.

26) Fenlon DR. Wild birds and silage as reservoirs of Listeria in the agricultural environment. J Appl Bacteriol 1985; 59: 537-543.

27) Low JC, Donachie W. Clinical and serum antibody responses to lambs to infection by Listeria monocytogenes. Res Vet Sci 1991; 51: 185-192.

28) Dennis S. M. Listeriosis (circling disease, silage sickness). In: Howard J L (Editor). Current Veterinary Therapy. 3th edition, Philadelphia: WB Saunders company 1993: 580- 595.

29) Charlton KM, Garcia MM. Spontaneous listeric encephalitis and neuritis in sheep. Vet Pathol 1977; 14: 297-313.

30) Marco A, Ramos JA, Domı́nguez L, Domingo M, González L. Immunocytochemical detection of Listeria monocytogenes in tissue with the peroxidaseantiperoxidase technique. Vet Pathol 1988; 25: 385-387.

31) Husu JR. Epidemiological studies on the occurrence of Listeria monocytogenes in the feces of dairy cattle. J Vet Med [B] 1990; 37: 276-282.

32) Lida T, Kanzaki M, Maruyama T, Inoue S, Kaneuchi C. Prevalence of Listeria monocytogenes in intestinal contents of healthy animals in Japan. J Vet Med Sci 1991; 53: 873- 875.

33) Loeb E. Encephalitic listeriosis in ruminants: immunohistochemistry as a diagnostic tool. J Vet Med A 2004; 51: 453-455.

34) Olsen JE, Aabo S, Hill W, et al. Probes and polymerase chain reaction for detection of food-borne bacterial pathogens. Int J Food Microbiol 1995; 28: 1-78.