Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR): BEFV 2012 izolatında G geninin amplifikasyonu daha önceki çalışmaya göre gerçekleştirildi (6). Bu işlem sonucunda yaklaşık 1870 baz çifti uzunluğunda BEFV G geni amplifiye edildi.
Klonlama: Amplifiye G geninin protein açıklama vektörüne (pcDNA-4/HisMax-TOPO Vector) klonlanması daha önceki yayımlanan çalışmada modifikasyonlarla gerçekleştirildi (11). Kısaca, %1'lik agarozda yürütülen G geni PureLink Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen Co, ABD) kullanılarak pürifiye edildi. Jelden pürifiye edilen G geninin vektöre yerleştirilmesinde ilk adım olarak ligasyon işlemi gerçekleştirildi. Bu amaçla 1 μL plazmid vektör üzerine 2 μL pürifiye G geni, 3 μL dH2O ve 1 μL salt solüsyonu ilave edildi ve karışım oda ısısında 5 dk inkübe edilerek rekombinant pcDNA4-G vektörü oluşturuldu. Transformasyon işlemi için 50 μL TOP10 kompeten hücre üzerine 6 μL ligasyon ürünü bırakıldı. Bu karışım buz üzerinde 30 dk bekletildi ve sonrasında önceden 42°C'e ayarlanmış su banyosu içerisine daldırılıp 90 sn tutularak rekombinant vektörlerin bakteri hücrelerine transformasyonu gerçekleştirildi. Bu süre sonunda karışım tekrar buz üzerine alındı. Karışım üzerine 400 μL antibiyotiksiz sıvı besi yeri (LB Medium) ilave edildi. Bu karışım 37°C'de 90 dk karıştırıcı üzerinde bekletildi. Bu süreyi takiben karışımın 100 μL'si antibiyotikli (Ampisillin 60 μg/uL) petri içindeki katı besi yerine (LB Agar) ekildi. Petri 15-16 saat 37°C'de inkübe edildi ve petride bakteriyel koloniler belirlendi.
Glikoprotein genini ihtiva ettiği PCR ile doğrulanan rekombinant vektörlerin (pcDNA4-G) bulunduğu transforme hücreler 15 mL'lik falkon tüp içerisinde 10 mL antibiyotikli (Ampisillin 60 μg/mL) sıvı besi yerine ekildi ve bir gece üremeye bırakıldı. Sıvı besiyerinde üreyen rekombinant vektörlerin bulunduğu kompeten hücrelerden rekombinant plazmid DNA'sı ticari kit (PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit, Promega Co, ABD) kullanılarak elde edildi.
Transfeksiyon: Bu çalışmada transfeksiyon işlemleri Vero E6 hücrelerinde gerçekleştirilmiştir. Bu hücrelerle gerçekleştirilen zeosin (Invitrogen Co, ABD) duyarlılık testinde zeosin miktarının (60 ug/mL) 3. günden sonra hücrelerin büyük kısmını, 5. günden sonra ise tamamını öldürdüğü belirlendi. Bu nedenle BEFV G geni ile transfekte Vero E6 hücrelerinde seleksiyon amacıyla 60 μg/mL oranında zeosin kullanılmasına karar verildi.
Top-10 kompeten hücre içerisinde çoğaltılan ve PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit kullanılarak saf olarak elde edilen plazmid DNA'sı Nano-Drop 2000 Spektrofotometre (Thermo Scientific, ABD) ile ölçüldü. Lipofectamine 2000 kullanılarak Vero E6 hücrelerine transfeksiyon gerçekleştirildi. Transfeksiyon aşamasında ürün içerisindeki kullanım talimatı uygulandı (Invitrogen Co, ABD).
Bu aşamadan sonra her vasat değişiminde hücre kültür kaplarına 60 μg/mL zeosin içeren hücre kültür vasatı konuldu. Yirmibir gün bu işlem devam ettirildi. Bu işlem sonunda antibiyotiğe duyarlı olan normal hücrelerin öldüğü tersine mikroskopta gözlemlenir iken, transfekte olmuş ve zeosin dirençli geni (Rekombinant geni) taşıyan hücrelerin çoğalmaya devam ettiği görüldü.
İmmunoperoksidaz: İmmunoperoksidaz deneyi 6 kuyucuklu hücre kültür kaplarına ekilen rekombinant vektörle transfekte edilen ve 21 gün 60 μg/mL zeosin ile seçilen Vero hücreleri ile kontrol Vero hücrelerinde gerçekleştirildi. Yöntem daha önceden tarif edilen yöntemden modifikasyonlarla gerçekleştirildi (12). Kısaca, 6 kuyucuklu kaplarda tek tabaka oluşturduktan sonra hücrelere önce fiksatif solüsyonu olarak %2 paraformaldehit ve %0.1 Triton X-100 ihtiva eden PBS eklendi ve hücreler bu solüsyonla 30 dakika muamele edilerek fikse edildi. Endojen peroksidaz ithimaline karşı hücreler %3 H2O2 ile bir saat muamele edildi. Daha sonra bu hücrelere, bloklama amacıyla, %5 bovine serum albumin eklendi ve 2 saat inkübasyon gerçekleştirildi. PBS ile yıkamaları takiben transfekte ve kontrol hücre kuyucuklarına PBS içinde 1/50 sullandırılan BEFV G proteini spesifik monklonal antikor ilave edildi. Bu antikorlar BEFV antikor ELISA kitinde temin edildi (EMAI, Camden NSW, Avustralya). Oda ısında 2 saat inkübasyon gerçekleştirildi. En az 10 kez PBS ile yıkamalar tekrarlandı. Kuyucuklara PBS içinde 1/1000 sullandırılan peroksidaz enzimi ile de işaretli tavşan anti-mouse IgG (Sigma Co, Almanya) eklendi ve inkübasyon tekrarlandı. İnkübasyonu takiben hücreler yine en az 10 defa PBS ile yıkandı. Yıkanan hücreler, karanlık ortamda kromojen solüsyonuyla (Diaminobenzidin 6 mg, 0.05 M Tris pH 7.6 10 mL, %3 H2O2 1 mL) 15 dak. reaksiyona sokuldu. Hücreler, hematoksilin-eozin ile boyama ve etanolle yıkamayı takiben, mikroskopik olarak incelendi ve hücrelerin mikrografları alındı.
)
)
)
