Parvovirusların sahip olduğu major kapsid proteini VP2, virüsün antijenik özelliklerini ortaya koyar. VP2 proteini üzerinde yer alan aminoasit rezidüleri yeni konaklara virüsun adaptasyonunda (297,300, 305, 323 ve 568 pozisyonlarında) önemli rol oynar ^8-10.

FPLV klinik olarak şiddetli depresyon, abdominal ağrı, kusma, dehidrasyon, şiddetli lökopeni ve ishal ile seyreder ve sık sık ölümlere neden olur ¹¹. FPLV’ün en yaygın bulaşma yolu enfekte kedilerin dışkı, idrar ve kanlarıyla duyarlı hayvanların doğrudan temasıdır. Hastalığın akut döneminde tüm vücut sıvılarıyla virüs saçılımı gerçekleşir. Günümüzde çeşitli aşılar (kedi karma aşıları ve FPL için olan aşılar) ile hastalık engellenmektedir. Ancak aşılanmayan populasyonlarda hastalık şiddetli ve yıkıcı etkilere neden olur. Hastalıktan etkin korunma yolu aşılamadır. Kediler sekiz haftalık olduktan sonra aşılama programı uygulanır ^2,12. Türkiye’de ticari olarak kullanılan aşılar sırasıyla, zayıflatılmış feline rhinotracheitis virüs ve calicivirus kapsayan Felocell (Zoetis) ve Johnson Snow Leopard FPLV ve zayıflatılmış feline rhinotracheitis virus kapsayan Purevax PCP (Merial)’dir.

Türkiye’de klinik olarak enfeksiyonun varlığı bilinmesine rağmen FPLV ile ilgili yapılan serolojik ¹³ ve moleküler ^10,14 çalışmaların sayısı sınırlıdır.

Bu çalışmanın amacı, Mersin ilinde FPLV’ün varlığını düşündüren;

i-klinik bulgulu kedilerde FPLV enfeksiyonunu ortaya koymak,

ii-saptanan virüslerde kısmı VP2 geninin genetik analizini yapmak ve

iii-Türkiye’de tespit edilen suşlar ve aşı suşlarıyla benzerlik/farklılığı ortaya koymaktır.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: FPLV kısmı VP2 geninin aminoasit değişimleri

Viral DNA İzolasyonu ve Polimerize Zincir Reaksiyonu (PZR): Kedilere ait taze dışkılar 2 mL phosphate buffer saline (PBS, pH; 7.2) ile karıştırılıp vortekslendi. Bu karışım daha sonra 10.000 rpm’de 10 dk. santrifüj yapılarak üstteki süpernatant alındı. Viral DNA eldesi 200 μL süpernatantdan High Pure Viral Nucleic Acid Kiti (Roche Diagnostics, Mannhaeim, Almanya) kullanılarak gerçekleştirildi. Özetle, 200 μL süpernatantın üzerine 200 μL lizis buffer (carrier RNA + binding buffer) ve 50 μL proteinaz K solüsyonu eklenerek hücresel ve protein yapılarının parçalanması için 72 ºC’de 10 dk inkübasyona bırakıldı. İnkübasyonu takiben 100 μL daha lisiz buffer eklenen örnekler vortekslendikten sonra filtreli tüplere eklenerek santrifüj işlemi gerçekleştirildi. Filtrelerdeki kalıntıların uzaklaştırılması için inhibitör uzaklaştırıcı buffer (500 μL) eklenerek tekrar santrifüj işlemi yapıldı. Yıkama solüsyonu (450 μL) ile art arda 2 defa yapılan yıkama işlemlerinin ardından, elüsyon solüsyonu (50 μL) ile filtreler muamele edilerek santrifüj yapıldı. Altta toplanan viral DNA’lar kullanıma kadar –20 ºC’de saklandı. PZR işlemi için FPLV’ün VP2 geninin kısmi bölgesini (630 baz çifti) hedefleyen H - forword (5’-CAGGTGATGAATTTGCTACA-3’) ve H- reverse (5’-CATTTGGATAAACTGGTGGT-3’) primerleri kullanıldı ⁵. Her örnek için amplifikasyon hacmi 30 μL olacak şekilde; 3 μL DNA, 0.25 μLTaq DNA polimeraz (5 U/1μL,Thermo Scientific, Amerika), 3 μL10xbuffer (20 mM, Thermo scientific, Amerika) 2 μL MgCl2 (25 mM, Thermo Scientific, Amerika), her bir primerden 1 μL (10 pmol), dNTP (10 mM) solüsyonundan 1 μL (Thermo Scientific, Amerika) ve ddH2O’dan 18.75 μL alarak PZR karışımı hazırlandı. Amplifikasyon işlemi için MiniAmpPlus Thermal cycler (Thermo Scientific, Amerika) cihazı kullanıldı. Elde edilen PZR ürünleri etidyum bromür (EtBr) ile boyanmış %1’lik agaroz jelde yürütülerek değerlendirildi. Sekans işlemi için örneklerin saflaştırılması QIAick PCR Purification kiti(Qiagen, Almanya) kullanılarak üretici firmanın önerisine göre yapıldı.

Sekans Analizi: Dizi analizi, üretici firmanın önerdiği şekilde ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystem, Amerika) sisteminde, PZR işleminde kullanılan primerler (Hforward ve Hreverse) kullanılarak gerçekleştirildi. Elde edilen viral dizinler Gen Bankası’ndaki referans suşlarla karşılaştırıldı. Bu amaçla BioEdit version 7.0.5 ve Clustal W programları kullanıldı. Filogenetik analiz MEGA v6.0 programı ile gerçekleştirildi (Şekil 1) ¹⁵. Bu amaçla neighborjoining methodu kullanıldı (Bootstrap değeri 1000 tekrar olarak hesaplandı) ¹⁶.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: FPLV kısmı VP2 geninin filogenetik analizi (Bu çalışmada elde edilen konsensus dizinler içi dolu siyah eşkenar dörtgenle belirtilmiştir)

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 2: Çalışmada örneklenen kedilerin yıl, örnek tipi, cinsiyet, ırk, aşılama durumu ve klinik bulguları

Bu çalışmada, gastroenteritis bulguları gösteren 16 kediye ait taze dışkı örneği FPLV varlığı açısından moleküler düzeyde incelendi. 16 kediden 7(%43)‘sinin FPLV yönünden pozitif olduğu tespit edildi. Bu kedilerin yaşları 12 ayın altındaydı. Afyonkarahisar’da yapılan bir çalışmada ¹³ FPLV yönünden seropozitif bulunan kedilerin büyük oranda 2 yaşın altında olduğu bildirilmiştir. 3 yaş ve daha büyük kedilerde antikor tespit edilmemiştir. Dolasıyla hastalık erken yaşlardaki kedileri daha çok etkilemektedir. Yine çalışmada cinsiyetler açısından FPLV pozitif kediler incelendiğinde 4(%57)’nün dişi ve 3(%42)’ünün erkek olduğu görülmüştür. Son dönemde yapılan çalışmalarda ^13,20 FPLV’ün dişi ve erkeklerde görülme sıklığı arasında belirgin bir fark görülmemiştir. Dolasıyla her iki cinsiyette hastalık görülme oranı benzer olmaktadır. 2015 ile 2016 yılları arasında Erzurum’da yapılan bir çalışmada kedilerin %10 (5/50)’u PZR ile FPLV pozitif olarak bulunmuştur ¹⁴. Çalışmada daha az sayıda kedinin incelenmesine rağmen PZR pozitifliği %43(7/16) olarak tespit edilmiştir. Bu farklılığın nedeni; Mersin’de Erzurum’a göre iklim şartlarının ılıman olması nedeniyle enfekte kedilerin çevrede daha aktif olmaları diğer kedilerle temas etme olasılıklarını artırıyor olabilir. Bu durumun nedenlerinin açıklanması için daha çok bireyin, aşılama durumlarının, kedi populasyonunun ve diğer çevresel faktörlerin incelenmesi faydalı olacaktır.

FPLV yönünden poztif yönünden bulunan örneklere ait filogenetik analiz (Şekil 1) sonucunda bir örneğin G1 ve altı örneğin ise G3 genotip grubu içinde yer aldığı görüldü. Yapılan filogenetik analize göre elde ettiğimiz G1 soyu Uzakdoğu soylarıyla daha yakın ilişkilidir. Bu sonuç daha önce yapılan çalışmalarla ¹⁴ uygunluk göstermektedir. Bu durumun iki nedeni olabilir; birincisi, ülkeler ve kıtalar arasındaki hayvan hareketleri viral etkenlerin yeni coğrafik alanlarda görülmesine neden olmaktadır. Mira ve ark. ¹⁹ Tayland ‘dan İtalya’ya gelen bir köpekte Asya kökenli CPV-2c genotipini tespit etmişlerdir. Yapılan genom analizinde Avrupa soylarında olmayan ve Asya soylarında bulunan amino asit değişimleri gözlenmiştir. Bir başka çalışmada ise Mısır’da tespit edilen FPLV’lerin %100 oranında Portekiz isolatlarıyla benzer oldukları tespit edilmiştir ²⁰. Çalışmada tespit edilen G1 soyunun ülkemize hayvan transportuyla veya ticaretiyle gelmiş olması mümkündür. Bununla beraber ülkemizde FPLV’ün moleküler ve epidemiolojik çalışmalarının artması ile dolaşımda olan genotiplerin tespit edilmesi ve genomlarının incelenmesi daha aydınlatıcı sonuçlar ortaya koyacaktır. İkincisi ise, CPV-2’nin genomunun hızlı evrimleşmesi sonucunda farklı genotipler ortaya çıkmıştır. Ancak FPLV genomu daha stabil bir yapıya sahiptir ¹⁴. FPLV’ün VP2 geni düzeyinde yapılan amino asit analizlerinin referans suşla yapılan karşılaştırmaları, bu rezidülerin değişmediğini göstermektedir. Nitekim çalışmada elde edilen pozitif örneklerin referans soyla karşılaştırılması sonucunda büyük oranda amino asit rezidülerinin korunduğu görülmüştür. Pakistan’da Ahmed ve ark. ²¹ sahadan elde edilen FPLV’lerin filogenetik ağaçta Portekiz, Güney Afrika ve Amerika’daki viral soylarla aynı dalda kümelendiğini ve bunun soylar arasındaki yakın atasal ilişkiden kaynaklandığını belirtmişlerdir. Bu yakın atasal ilişki virüsun genom yapısının oldukça korunmuş olduğunu da göstermektedir. Sonuç olarak çalışmada elde edilen G1 genotipinin Asya kökenli soylarla yakın ilişkili çıkmasının diğer bir nedenide FPLV’ün genomunun oldukça stabil olması ile açıklanabilir. Bu durumun daha iyi anlaşılması için global olarak daha fazla örneğin incelenmesi gerekebilir. Bununla beraber G3 genotipinde yer alan altı örnek ise Avrupa ve Türkiye soylarıyla daha yakın ilişkilidir.

Çalışmadaki aminoasit karakterizasyonu daha önce Türkiye’de rapor edilmemiş aminoasit değişimini göstermiştir. Bu değişim 454 (Y→N) numaralı rezidüde görülmektedir. Bu aminoasit rezidüsü kapsid yüzeyinde bulunan bir nokta olduğu için virüsun antijenik yapısı üzerine etkisi olabilir. Bunun yanında 311 numaralı aminoasit rezidüsünde D→N değişimi gözlenmiştir (Tablo 1). Bu değişim daha önce yapılan çalışmalarda bildirilmiştir ¹⁰. Aşı kaynaklı enfeksiyonlar, modifiye canlı aşıların kullanımından sonra görülebilir. G3 genotipinde yer alan saha örneği (145 numaralı kedi) FPLV enfeksiyonuna karşı aşılanmıştır. Düzenli olarak aşılanan kedilerde FPLV salgınları rapor edilmiştir ^17,18. Son dönemde yapılan bir çalışma ²² FPLV karşı aşılanmış kedilerin %37’sinde enfeksiyonun oluştuğunu göstermiştir. Kedi yavrularının sahip oldukları maternal antikorlarının etkinliğinin 16 haftaya kadar uzaması yapılan aşılamaların etkisiz kalmasına sebep olabilir. Diğer bir neden ise kapsid proteininde meydana gelen mutasyonların bağışıklık sisteminden kaçışlara neden olmasıdır ³. Evde barınan kedilerin sahiplerinin ihtiyaç olmadığını düşünerek daha az oranda aşılama yaptırmalarıda etkili olmaktadır ²⁰. Çalışmada pozitif bulunan yedi örnek aşı soylarından (Felocell, Purevax) farklı gruplar içinde yer almışlardır. Sonuç olarak aşı kaynaklı bir enfeksiyon söz konusu değildir. Aydın ve Timurkan ¹⁴ yaptıkları çalışmada tespit ettikleri FPLV genotipleri aşı soylarının dışındakı G1 grubunda yer almıştır. Bir başka çalışmada ¹⁰ G3 genotipleri ve köpek kaynaklı enfeksiyon tablosu kedilerde bulunmuştur. Mersin ilinde yapılan çalışmada ise G1 ve G3 genotipleri içinde yer alan FPLV’leri karakterize edilmiştir.

Sonuç olarak, sınırlı sayıda moleküler çalışmanın olmasına rağmen yapılan saha çalışmaları Türkiye’nin farklı bölgelerinde farklı genotiplerin dolaşımda olduğunu göstermiştir. Çalışmamızda ise aynı bölgede G1 ve G3 genotipleri ilk olarak bildirilmiştir. Segmentli genoma sahip virüslarda sıklıkla tespit edilen reassortment mutasyonu DNA genoma sahip virüslarda görülmemekle birlikte, intramoleküler rekombinasyon olayı çift iplikli DNA virüslarında görülebilir. Dolayısıyla farklı genotipe sahip bu virüsların aynı coğrafyada olması bu durumu akla getirebilir. Bu yüzden moleküler epidemiyolojik ve genetik çalışmalar durmadan sürekli devam etmelidir. Bu sonuçların ışığında Türkiye’de FPLV genotiplerinin çeşitliliğinin daha fazla araştırılması gerekli olduğu görülmektedir. Epidemiolojik ve moleküler çalışmaların ışığında kullanılan aşıların yeniden oluşturulması ile aşıların koruculuğunun ve etkinliğinin artırılması sağlanabilir.

1) Parthiban M, Aarthi KS, Balagangatharathilagar M, Kumanan K. Evidence of feline panleukopenia infection in cats in India. Virus Dis 2014; 25: 497-499.

2) Stuetzer B, Hartmann K. Feline parvovirus infection and associated diseases. The Vet J 2014; 201: 150-155.

3) Miranda C, Vieira MJ, Silva E,Carvalheira J, Parrishand CR, Thompson G. Genetic Analysis of Feline Panleukopenia Virus Full – length VP2 Gene in Domestic Cats Between 2006–2008 and 2012–2014, Portugal. Trans and Emerg Dis 2017; 64: 1178-1183.

4) Parrish CR, Aquadro CF, Strassheim ML, et al. Rapid antigenic-type replacement and DNA sequence evolution of canine parvovirus. J Virol 1991; 65: 6544-6552

5) Buonavoglia C, Martella V, Pratelli A, et al. Evidence for evolution of canine parvovirus type-2 in Italy. J Gen Virol 2001; 82: 1555-1560.

6) Timurkan MO, Oğuzoğlu T. Molecular characterization of canine parvovirus (CPV) infection in dogs in Turkey. Vet Ital 2015; 51: 39-44.

7) Truyen U. Emergence and recent evolution of canine parvovirus. Vet Microbiol 1999; 69: 47-50.

8) Brindhalakshmi B, Mukhopadhyay HK, Antony PX, et al. Isolation and molecular characterization of canine and feline parvovirus strains - an updated review. J Dairy Vet Anim Res 2016; 3: 164-169.

9) Steinel A, Venter EH, van Vuuren M, Truyen U. Antigenic and genetic analysis of canine parvoviruses in southern Africa. J Vet Res 1998; 65: 239-242.

10) Muz D, Oğuzoğlu TC, Timurkan MO, Akın H. Characterization of the partial VP2 gene region of canine parvoviruses in domestic cats from Turkey. Virus Genes 2012; 44: 301-308.

11) Battilani MA, Balboni M, Ustulin M, et al. Genetic complexity and multiple infections with more Parvovirus species in naturally infected cats. Vet Res. 2011; 42: 43.

12) Litster A, Benjanirut C. Case series of feline panleukopenia virus in an animal shelter. J of Feline Med and Surg 2014; 16: 346–353.

13) Gür S, Avdatek K. A serological investigation for Feline Panleukopenia Virus in Cats in Afyonkarahisar. Kocatepe Vet J 2016; 9: 165-170.

14) Aydın H, Timurkan MO. A pilot study on feline astrovirus and feline panleukopenia virus in shelter cats in Erzurum, Turkey. Revue Méd Vét 2018; 169: 52-57.

15) Hall TA. Bioedit: A user – friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symp Ser 1999; 41: 95-98.

16) Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol 2013; 30: 2725-2729.

17) Decaro N, Desario C, Miccolupo A, et al. Genetic analysis of feline panleukopenia viruses from cats with gastroenteritis. J of Gen Virol 2008; 89: 2290-2298.

18) Cho YY, Lim SI, Kim YK, et al. Molecular characterization and phylogenetic analysis of feline astrovirus in Korean cats. J Feline Med Surg 2012; 16: 679-683.

19) Mira F, Purpari G, Lorusso E, et al. Introduction of Asian canine parvovirus in Europe through dog importation. Transbound Emerg Dis 2017; 65: 16-21.

20) Awad RA, Khalil WKB, Attallah AG. Epidemiology and diagnosis of feline panleukopenia virus in Egypt: Clinical and molecular diagnosis in cats. Vet World 2018; 11: 578-584.

21) Ahmed N, Riaz A, Zubair Z, et al. (Molecular analysis of partial VP-2 gene amplified from rectal swab samples of diarrheic dogs in Pakistan confirms the circulation of canine parvovirus genetic variant CPV-2a and detects sequences of feline panleukopenia virus FPV). Virol J 2018;15: 45.

22) Truyen U, Parrish CR. Feline panleukopenia virus: Its interesting evolution and current problems in immunoprophylaxis against a serious pathogen. Vet Microbiol 2013; 165: 29-32.