Ellajik asit böğürtlen, ahududu, çilek, vişne, kızılcık, nar, kırmızı ve siyah üzüm, ceviz ve diğer bitkisel besinler dâhil olmak üzere pek çok sayıda taneli meyvede bulunan fenolik karakterdeki bir antioksidandır. Birçok meyve ve sebzede bulunan ve doğal fenolik bir bileşik olan ellajik asit önemli bir antioksidan maddedir. Molekül formülü C14H6O8, molekül ağırlığı 302.197 g/mol’dür. Vücuda alınan meyvelerde bulunan ‘ellagitannins’ denilen maddeler vücutta ellajik aside dönüştürülür ⁴. Ellajik asit serbest radikallerin olumsuz etkilerini bloke edici özelliği olan bir antioksidandır. Etki mekanizması tam olarak bilinmemesine rağmen süperoksit ve hidroksil anyonları gibi reaktif oksijen türevlerini güçlü bir şekilde temizlediği bildirilmektedir ^5-7.

Farklı stres ve kirlilik faktörleri, su kalitesinde meydana gelen değişimler, toksik etkili maddeler, hastalıklar, yetersiz beslenme, koruyucu veya tedavi edici amaçla kullanılan kemoterapötikler gibi faktörlere bağlı olarak balığın direk fizyolojik durumu değişebilmektedir. Fizyolojik durumda meydana gelen bu değişimlerin incelenmesinde kan dokusu güvenilir bir kriterdir ve organizmada oluşan fiziksel ve kimyasal değişimleri kesin bir şekilde yansıtabilmektedir. Bu nedenle memelilerde olduğu gibi balıklarda da metabolik bozukluklar ve septisemik hastalıkların yanı sıra fizyolojik değişimlerin belirlenmesi amacıyla kan analiz sonuçlarına geniş bir şekilde başvurulmaktadır. Bununla birlikte immunostimulan ve antioksidanların vücutta oluşturduğu fizyolojik değişiklikleri ortaya koyması bakımından da kan dokusu oldukça önemlidir ^8-11.

Bu çalışmada, yeme katılan ellajik asidin pullu sazanda hematolojik parametrelere etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla araştırmada immunostimulan ve antioksidan özellikteki ellajik asit balıklara oral yolla verilmiş, kullanılan parametreler değerlendirilerek immunostimulan etkisi belirlenmeye çalışılmıştır.

Çalışma, Fırat Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi'nde yapıldı ve çalışmada 33x100x60 cm boyutlarındaki 12 farklı cam akvaryum (3 tekrar ve her bir tekrar için 4 akvaryum) kullanıldı. Akvaryumlar, çalışmaya başlamadan önce dezenfekte edildi ve balıkların akvaryum dışına atlamalarını engellemek için balık ağıyla kapatıldı.

Çalışmada başlangıç ağırlığı yaklaşık 50±5 g olan 0+ yaş grubundaki 240 adet (her bir tekrar için 80 toplamda 240 balık) pullu sazan (Cyprinus carpio) kullanıldı. Balıklar DSİ IX. Bölge Müdürlüğü Keban Su Ürünleri Şube Müdürlüğü’nden canlı olarak temin edildi. Canlı olarak temin edilen balıklar 33x100x60 cm boyutlarında 12 farklı cam akvaryuma, her birinde 20 adet olacak şekilde yerleştirildi. Deneysel çalışma başlamadan önce balıklar hazırlanmış olan bu ortama 15 gün süreyle adapte edildi. Adaptasyon süresince balıklara günde iki kere alabildikleri kadar ticari balık yemi verildi.

Çalışmada kullanılan ellajik asit Sigma-Aldrich' den (katalog no: E2250; sinonim: 4,4′,5,5′,6,6′-Hexahydroxydiphenic acid 2,6,2′,6′-dilactone; CAS no: 476-66-4; deneysel formülü: C₁₄H₆O₈) temin edildi. Laboratuvar analizleri sırasında kullanılan kimyasallar ise Sigma-Aldrich, Merck, Serva, Isolab, VWR Chemicals, Fluka, AppliChem, ABCR firmalarından sağlandı.

Deneme yemlerinin hazırlanması için ellajik asit 50, 100 ve 200 mg/kg yem oranında tartıldı. Daha sonra özel bir firmadan alınan ve toz haline getirilen pelet yemlerle karıştırıldı. Hamur haline getirilen karışım kıyma makinesinden geçirilerek tekrar pelet haline dönüştürüldü. Hazırlanan peletler tepsilere yerleştirilip yem fırınında kurutuldu. Yemler soğutulduktan sonra, kullanılıncaya kadar koyu renkli cam muhafaza kapları içerisinde ve 4 °C’de muhafaza edildi.

Adaptasyon süresi sonunda balıklar aşağıdaki gibi dört grubu ayrıldı.

K: Kontrol grubu; 60 gün süreyle ellajik asit içermeyen ticari yemin uygulandığı grup,

EA-50: 60 gün süreyle 50 mg/kg yem oranında ellajik asit verilen grup,

EA-100: 60 gün süreyle 100 mg/kg yem oranında ellajik asit verilen grup,

EA-200: 60 gün süreyle 200 mg/kg yem oranında ellajik asit verilen grup.

Çalışma 3 tekrarlı olarak yürütüldü ve her bir tekrar için 80 adet olmak üzere toplamda 240 balık kullanıldı. Ellajik asidin uygulanan dozları Mişe Yonar ve ark. ⁹ ve Mişe Yonar ⁴’a göre belirlendi.

Denemenin 30. ve 60. günlerinde her bir tekrardan 10 balık alınarak 25 mg/L konsantrasyonundaki benzokain (25 mg/L) yardımıyla anestezi edildi. Anestezi altındaki balıklar kavdal pedünkül bölgesinden ensize edilerek kan örnekleri EDTA'lı tüplere alındı. Kan örnekleri aynı gün işlendi.

Eritrosit ve lökosit sayıları, Natt Herrick solüsyonu kullanılarak Thoma lamında aynı anda yapıldı ^12-14. Hemoglobin düzeyi siyanmethemoglobin yöntemine göre, Drabkin’s ayıracı kullanarak spektrofotometrede belirlendi (15). Hematokrit düzeyi mikrohematokrit yöntemle saptandı ¹³. Eritrosit indeksleri [Ortalama eritrosit hacmi (MCV), ortalama eritrosit hemoglobini (MCH) ile ortalama eritrosit hemoglobin konsantrasyonu (MCHC)] eritrosit sayısı, hemoglobin ve hematokrit düzeyleri kullanılarak formül yardımıyla hesaplandı ^13,14.

Sonuçların istatistiksel analizleri için SPSS 21.0 istatistik programı kullanıldı. Verilerin normal dağılımları kontrol edildikten sonra incelenen parametrelerde oluşan değişimlerin karşılaştırılmasında tek yönlü varyans analizi (ONEWAY – ANOVA) kullanıldı. Önemlilikler P≤0.05 olduğunda anlamlı kabul edildi. Bağımlı gruplarda istatistiksel farklılığı ortaya çıkarabilmek amacıyla bağımlı t testi kullanıldı. Sonuçlar ortalama ± standart hata olarak verildi ^16,17.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: Kontrol grubu ile ellajik asit uygulanan deneme gruplarının eritrosit (RBC) ve lökosit (WBC) sayıları ile hemoglobin (Hb) ve hematokrit (Ht) düzeyleri

Çalışmanın 30. gününde kontrol grubuna göre ellajik asit uygulanan EA-50, EA-100 ve EA-200 gruplarının eritrosit ve lökosit sayıları ile hemoglobin ve hematokrit düzeylerinin istatistiksel olarak önemli düzeyde arttığı belirlendi (P<0.05). EA-50, EA-100 ve EA-200 grupları kendi içerisinde kıyaslandığında ise EA-100 ve EA-200 gruplarının eritrosit ve lökosit sayıları ile hemoglobin ve hematokrit düzeylerinin EA-50 grubundan istatistiksel olarak daha yüksek olduğu görüldü (P<0.05).

Denemenin 60. gününde ellajik asit uygulanan EA-50, EA-100 ve EA-200 gruplarının eritrosit ve lökosit sayıları ile hemoglobin ve hematokrit düzeylerinin kontrol grubuyla kıyaslandığında istatistiksel olarak önemli düzeyde arttığı belirlendi (P<0.05). EA-50, EA-100 ve EA-200 grupları kendi arasında karşılaştırıldığında ise EA-100 ve EA-200 gruplarının eritrosit ve lökosit sayıları ile hemoglobin ve hematokrit düzeylerinin EA-50 grubundan daha yüksek olduğu tespit edildi (P<0.05).

EA-50, EA-100 ve EA-200 gruplarının 60. gündeki eritrosit ve lökosit sayıları ile hemoglobin ve hematokrit düzeylerinin 30. güne kıyasla istatistiksel olarak daha yüksek olduğu saptandı (P<0.05).

Kontrol grubu ve ellajik asit uygulanan gruplardaki balıkların, MCV, MCH ve MCHC değerleri Tablo 2'de verilmiştir.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 2: Kontrol grubu ile ellajik asit uygulanan deneme gruplarının MCV, MCH, MCHC düzeyleri

Kontrol grubu ve sırasıyla 50, 100 ve 200 mg/kg yem oranında ellajik asit verilen EA-50, EA-100 ve EA-200 gruplarının MCV, MCH ve MCHC değerlerinde çalışmanın hem 30. hem de 60. günlerinde istatistiksel herhangi bir farklılık tespit edilmedi (P>0.05). Ayrıca yalnız ellajik asit verilen EA-50, EA-100 ve EA-200 grupları kendi içerisinde kıyaslandığında hem 30. hem de 60. gündeki MCV, MCH ve MCHC değerlerinde istatistiksel olarak herhangi bir farklılık belirlenmedi (P>0.05).

Öte yandan, eritrosit indeksleri (MCV, MCH ve MCHC değerleri) anemilerin etiyolojisini ve morfolojik sınıflandırmasını yapmak için sıklıkla kullanılmaktadır ²¹. Bu çalışmada ellajik asit uygulanan grupların eritrosit indekslerinde (MCV, MCH ve MCHC) kontrol grubuna göre herhangi bir değişiklik gözlemlenmemiştir. Bu veri ellajik asidin pullu sazanda hematolojik parametreler üzerinde olumlu bir etkiye sahip olduğunu ve ellajik asidin anemiye sebep olmadığını, ayrıca ellajik asit uygulamasının balıklarda strese yol açmadığını göstermiştir. Benzer sonuçlar bu çalışmadaki dozlarla aynı oranda ellajik asit içeren yemlerin verildiği alabalıklarda da tespit edilmiştir ⁹.

İmmünolojik fonksiyonların yürütülmesinde görev alan ve spesifik olmayan veya nonspesifik bağışıklığın önemli faktörlerinden biri olarak kabul edilen lökositlerin sayısı / aktivitesindeki değişiklikler balıkların genel sağlık durumu hakkında ipuçları verebilmektedir ^3,22. Bu çalışmanın sonuçları ellajik asit içeren diyetlerle beslenen deneme gruplarının lökosit sayısının uygulama sonunda önemli ölçüde arttığını göstermiştir. Bu bulgu, 21 gün ⁹ ve 8 hafta ³ süresince ellajik asit uygulanan gökkuşağı alabalıklarından elde edilen sonuçlarla paralellik göstermiştir. Bununla birlikte bitkisel karakterdeki immünostimülanların balıklarda immun sistemi stimüle ettiği ve lökosit sayısını artırabileceği belirtilmiştir ²³. Yine birçok araştırmacı ^24-32 bitkisel immunostimulanların farklı balık türlerinde nonspesifik hücresel bağışıklığın önemli bir parçasını oluşturan fagositozu arttırdığını ifade etmiştir.

Sonuç olarak; 50, 100 ve 200 mg dozlarında ellajik asit verilen balıklarda incelenen hematolojik parametrelerden eritrosit ve lökosit sayısı ile hemoglobin ve hematokrit düzeylerinin kontrol grubuyla kıyaslandığında arttığı belirlenmiştir. Elde edilen veriler ellajik asidin balıklarda immunostimülan olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Diğer taraftan belirtilen dozlarda ellajik asit uygulanan grupların eritrosit indekslerinde (MCV, MCH ve MCHC) ise herhangi bir değişiklik belirlenmemiştir. Bu sonuç, ellajik asidin pullu sazanın hematolojik parametreleri üzerine olan olumlu etkisini teyit etmiştir. Ayrıca bu veri ellajik asidin anemiye sebep olmadığını, ayrıca ellajik asit uygulamasının pullu sazanda strese yol açmadığını göstermiştir. Fakat farklı balık türlerinde, farklı doz ve süreler için farklı yöntemler kullanılarak ellajik asit uygulamasının sonuçlarına ihtiyaç olduğu görülmektedir.

1) Sağlam N, Yonar ME. Effects of sulfamerazine on selected haematological and immunological parameters in rainbow trout (Onchorhynchus mykiss, Walbaum, 1792). Aquac Res 2009; 40: 395-404.

2) Yonar ME, Mişe Yonar S, Ispir U, et al. Effects of curcumin on haematological values, immunity, antioxidant status and resistance of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) against Aeromonas salmonicida subsp. Achromogenes. Fish Shellfish Immun 2019; 89: 83-90.

3) Mişe Yonar S. Growth performance, haematological changes, immune response, antioxidant activity and disease resistance in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) fed diet supplemented with ellagic acid. Fish Shellfish Immun 2019; 95: 391-398.

4) Keskin S. Sıçanlarda Ultraviyole A ve B ile İndüklenmiş Deri Hasarında Ellajik Asit ve Silibininin Doku Koruyucu, Antiapoptotik ve Antioksidan Etkilerinin Moleküler ve Stereolojik Yöntemlerle Araştırılması. Yüksek Lisans Tezi, Van: Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, 2018.

5) Losso JN, Bansode RR, II AT, et al. In vitro anti-proliferative activities of ellagic acid. J Nutr Biochem 2004; 15: 672-678.

6) Landete JM. Ellagitannins, ellagic acid and their derived metabolites: A review about source, metabolism, functions and health. Food Res Int 2011; 44: 1150-1160.

7) Çeribaşı AO, Sakin F, Türk G, et al. Impact of ellagic acid on adriamycin induced testicular histopathological lesions apoptosis lipid peroxidation and sperm damages. Exp Toxicol Pathol 2012; 64: 717-724.

8) Talpur AD, Ikhwanuddin M. Azadirachta indica (neem) leaf dietary effects on the immunity response and disease resistance of Asian seabass, Lates calcarifer challenged with Vibrio harveyi. Fish Shellfish Immun 2013; 34: 254-264.

9) Mişe Yonar S, Yonar ME, Yöntürk Y, et al. Effect of ellagic acid on some haematological, immunological and antioxidant parameters of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). J Anim Physiol An N 2014; 98: 936-941.

10) Vazirzadeh A, Dehghan F, Kazemeini R. Changes in growth, blood immune parameters and expression of immune related genes in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in response to diet supplemented with Ducrosia anethifolia essential oil. Fish Shellfish Immun 2017; 69: 164-172.

11) Abdel-Tawwab M, Adeshina I, Jenyo-Oni A, et al. Growth, physiological, antioxidants, and immune response of African catfish, Clarias gariepinus (B.), to dietary clove basil, Ocimum gratissimum, leaf extract and its susceptibility to Listeria monocytogenes infection. Fish Shellfish Immun 2018; 78: 346-354.

12) Natt MP, Herrick CA. New blood diluents for counting the erythrocytes and leukocytes of the chicken. Poultry Sci 1952; 31: 735-738.

13) Konuk T. Pratik Fizyoloji. Ankara: Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Yayınları, 1981.

14) İmren H, Turan O. Klinik Tanıda Laboratuvar. İstanbul: Beta Yayım Dağıtım, 1985.

15) Drabkin DL. The crystallographic and optical properties of the hemoglobin of man in comparison with those of other species. J Biol Chem 1946; 64: 703-723.

16) Kocaçalışkan İ, Bingöl NA. Biyoistatistik. Ankara: Nobel Yayınları, 2008.

17) Kalaycı Ş. SPSS Uygulamalı Çok Değişkenli İstatistik Teknikleri. Ankara: Asil Yayınları, 2010.

18) Yonar ME. Chlorpyrifos-induced biochemical changes in Cyprinus carpio: Ameliorative effect of curcumin. Ecotoxicol Environ Saf 2018; 151: 49-54.

19) Li ZH, Velisek J, Grabic R, et al. Use of hematological and plasma biochemical parameters to assess the chronic effects of a fungicide propiconazole on a freshwater teleost. Chemosphere 2011; 83: 572-578.

20) Dotta G, Andrade JIA, Gonçalves ELT, et al. Leukocyte phagocytosis and lysozyme activity in Nile tilapia fed supplemented diet with natural extracts of propolis and Aloe barbadensis. Fish Shellfish Immun 2014; 39: 280-284.

21) Yonar ME, Mişe Yonar S, Pala A, et al. Trichlorfon-induced haematological and biochemical changes in Cyprinus carpio: Ameliorative effect of propolis. Dis Aquat Organ 2015; 114: 209-216.

22) Secombes CJ. The nonspecific immune system: Cellular defences. In: Iwama G, Nakanishi T. (Editors). The fish immune system, organism, pathogen and environment. Academic Press, Toronto: 1996: 63-103.

23) Adel M, Pourgholam R, Zorriehzahra J, et al. Hemato-Immunological and biochemical parameters, skin antibacterial activity, and survival in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) following the diet supplemented with Mentha piperita against Yersinia ruckeri. Fish Shellfish Immun 2016; 55: 267-273.

24) Dügenci SK, Arda N, Candan A. Some medicinal plants as immunostimulant for fish. J Ethnopharmacol 2003; 88: 99-106.

25) Sahu S, Das BK, Mishra BK, et al. Effects of Allium sativum on the immunity and survival of Labeo rohita infected with Aeromonas hydrophila. J Appli Ichthyol 2007; 23: 80-86.

26) Choi SH, Park KH, Yoon TJ, et al. Dietary Korean mistletoe enhances cellular non-specific immune responses and survival of Japanese eel (Anguilla japonica). Fish Shellfish Immun 2008; 24: 67-73.

27) Ardó L, Yin GJ, Xu P, et al. Chinese herbs (Astragalus membranaceus and Lonicera japonica) and boron enhance the non-specific immune response of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) and resistance against Aeromonas hydrophila. Aquaculture 2008; 275: 26-33.

28) Nya EJ, Austin B. Use of garlic, Allium sativum, to control Aeromonas hydrophila infection in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). J Fish Dis 2009; 32: 963-970.

29) Nya EJ, Austin B. Use of dietary ginger, Zingiber officinale Roscoe, as an immunostimulant to control Aeromonas hydrophila infections in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). J Fish Dis 2009; 32: 971-977.

30) Sharma A, Deo AD, Riteshkumar ST, et al. Effect of Withania somnifera (L. Dunal) root as a feed additive on immunological parameters and disease resistance to Aeromonas hydrophila in Labeo rohita (Hamilton) fingerlings. Fish Shellfish Immun 2010; 29: 508-512.

31) Nya EJ, Austin B. Development of immunity in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) to Aeromonas hydrophila after the dietary application of garlic. Fish Shellfish Immun 2011; 30: 845-850.

32) Wang JL, Meng X, Lub R, et al. Effects of Rehmannia glutinosa on growth performance, immunological parameters and disease resistance to Aeromonas hydrophila in common carp (Cyprinus carpio L.). Aquaculture 2015; 435: 293-300.