Numuneler: Çalışmada, Kayseri ili ve çevresindeki farklı satış noktalarından Eylül 2008-Ocak 2009 tarihleri arasında 100 adet 50'şer ml çiğ süt numunesi toplandı. Numuneler, soğuk zincirde laboratuvara getirildi ve bekletmeden incelemeye alındı.
Standart Suş: Çalışmada izolasyon işleminin her aşamasında, S. aureus ATCT 29213 (SEA), S. aureus NCTC 10652 (SEA, SED), S. aureus NCTC 10654 (SEB), S. aureus NCTC 10655 (SEC) standart suşları kullanıldı.
Primerler: Çalışmada elde edilen izolatlar beş adet primer (Tablo 1) kullanılarak m-PCR tekniği ile incelendi.
Etken İzolasyonu: Staphylococcus aureus izolasyonu amacıyla çiğ süt numuneleri yayma plak yöntemi ile Egg-Yolk Tellurit (Merck 1.03785.0001) içeren Baird Parker Medium (BPM, Oxoid CM275) besiyerine ekildi ve 37º C'de 2 -3 gün inkübasyona bırakıldı. Bu süre sonunda BPM'de üreyen S. aureus şüpheli beş adet koloni tekrar BPM besiyerine yayma plak tekniği ile ekilerek 37º C'de 24 saat bekletildi. Üreyen şüpheli koloniler fenotipik özelliklerinin belirlenmesi amacıyla Brain Heart İnfuzyon Broth (BHI, Acumedia, 7116A) besi yerine inokule edildi ve ekim 37º C'de 24 saat inkübe edidi12,15.
İzolatların Fenotipik Karakterizasyonu: BHI'da üreyen şüpheli kültürlere Gram boyama, katalaz ve koagülaz testleri uygulandı24.
DNA Ekstraksiyonu: Baird Parker Medium besiyerinde üreyen şüpheli kolonilere ait DNA'lar GF-1 Nukleik asit ekstraksiyon kiti (Vivantis, GF-BA-100) kullanılarak ekstrakte edildi.
Multipleks PCR: m-PCR'da primer büyüklüğü 69 ile 306 bp arasında değişen tür spesifik primerler kullanıldı. Reaksiyon karışımı final konsantrasyonu 50 µl olacak şekilde hazırlandı. Reaksiyon karışımı; 2 μl DNA örneği, 5 μl 10x PCR buffer (Vivantis),4 mM MgCl2 (Vivantis), 0,2 mM dNTP Mix (Vivantis), 20-30 pmol SA-U, SA-A, SA-B, SA-C/ENT-C ve SA-D primerleri, 1 U Taq polymerase (Vivantis) olacak şekilde hazırlandı9. Reaksiyon PCR cihazında (Thermo) 35 siklus olacak şekilde 94°C'de 30 s, 50°C'de 30 s ve 72°C'de 30 s, son ektensiyon 72°C'de 2 dk olarak gerçekleştirildi. Amplifikasyon sonucunda elde edilen PCR ürünleri % 1,5'lik agaroz jelde 90 V gerilimde 45 d elektroforez (Thermo EC330) işlemine tabi tutulduktan sonra, UVP jel dökümantasyon sistemi (Vilber Laurmat ECX-20-M) kullanılarak görüntülendi9.
Enzim- Linked Immunosorbent Assay (ELISA):Toplanan örneklerde, Staphylococcus aureus enterotoksinlerinin (SET A,B,C,D,E) varlığı Ridascreen® SET A,B,C,D,E (r-biopharm, Germany, Art.no:R1101) kiti kullanılarak Enzim-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) metodu ile belirlendi25.