Gereç ve Yöntem: Gen ekspresyon değişiklikleri, B2M referans gen olarak kullanılarak kantitafif real time polimeraz zincir reaksiyonu ile (KRT PZR) değerlendirilmiştir. Bu amaçla genç, sağlıklı ve sigara içmeyen 10 kişiye ait kan örnekleri toplanmıştır. Her birey için beş tüpe bölünen örneklerden ilki kontrol olarak ayrılmış diğer dördü sabit gama kaynağında (Co60) 0327 kGy/sa doz hızına göre hesaplanmış 0.5 Gy, 1 Gy ve 3 Gy gama radyasyonuna maruz bırakılmıştır.

Bulgular: Sonuçlar eşik değerinin aşıldığı döngü değerlerine (CT) göre REST 2009 (Relative Expression Software Tool V. 2.0.13 ) programında değerlendirilmiş, hedef genin ve referans genin CT değerleri arasındaki farklılıklara göre hesaplanmıştır.

Sonuç: KRT PZR sonuçları MDM2 geninin maruz kalınan dozlarda up-regüle olduğunu göstermiştir. Elde edilen sonuçlar MDM2 geninin iyonize radyasyonun etkilerinin değerlendirilmesinde kullanılabileceğini göstermiştir.

Lenfositlerin ayrılması
Lenfositler sağlıklı bireylerden heparinle alınan periferik kandan Histopaque-1077 (Sigma, Amerika) ile yoğunluk gradiyenti uygulanarak izole edilmiştir. Kan örneği Histopaque-1077 üzerine eşit hacimde ilave edilmiş ve oda sıcaklığında 400xg'de 30 dakika santrifüj edilmiştir. Lenfositleri içeren ara faz başka bir temiz tüpe aktarılmış, ardından fosfat tampon solüsyonu (PBS) ile karıştırılmış ve 250xg'de 10 dakika santrifüj edilerek yıkanmıştır.

RNA ekstraksiyonu ve cDNA sentezi
Total RNA, RNeasy plus mini kit (Qiagen, Almanya) kullanılarak lenfositlerden izole edilmiştir. RNA örneklerinin miktarı GeneQuant 1300 spektorfotometrede (GE Healthcare) 260 ve 280 nm dalga boyunda kuvartz küvetler kullanılarak ölçülmüş ve örnekler −80°C'de saklanmıştır. cDNA, QuantiTect® Reverse Transcription Kit (Qiagen, Almanya) kullanılarak sentezlenmiştir. Genomik DNA'nın eliminasyon reaksiyonu 2 μl gDNA wipeout tamponu kullanılarak, 14 μl toplam hacimde, 1 μg kalıp RNA ve RNase içermeyen su ile 42°C'de 2 dakika inkübe edilerek gerçekleştirilmiştir. Reverse transkripsiyon reaksiyonu ise 1 μl quantiscript reverse transkriptaz, 4 μl 5x quantiscript RT tamponu, 1 μl RT primer mix ve 14 μl kalıp RNA kullanılarak ve 42°C'de 15 dakika ve 95°C'de 3 dakika inkübe edilerek gerçekleştirilmiştir. Elde edilen cDNA örnekleri -20°C'de saklanmıştır. MDM2 geninin amplifikasyonu için kullanılan primerler ve prob şöyledir: ileri primer 5'GAGCTTGGCTGCTTCTGGG'3; geri primer 5'TCGGCTTCTTGCTCCATCTT'3, prob 5'CCTGTGTGGCCCTGTGTGTCGG'3. Kantitatif Real Time polimeraz zincir reaksiyonu 2 μl cDNA, 5 μl 2x QuantiFast RT-PZR master mix (Qiagen), her primerden 1 μl ve 1 μl prob kullanılarak toplam 10 μl reaksiyon hacminde ve RotorGene RG6000 real-time PZR aletinde (Corbett Research, Sydney, Australia) çalışılmıştır. Reaksiyon koşulları 5 dakika 94°C'de denatürasyon ve ardından 45 döngü 94°C'de 10 saniye ve 60°C'de 30 saniyedir.

İstatistiksel analiz
Gerçek-zamanlı PZR reaksiyonu sonunda elde edilen CT değerleri REST 2009 (Relative Expression Software Tool V. 2.0.13 ) programında standart mod'da referans gen (B2M) normalizasyonu ile değerlendirilmiştir. MDM2 geninin ekspresyon düzeyleri ile maruz bırakılan gama radyasyonu dozu arasındaki ilişkinin belirlenmesinde SPSS 16.0 istastistiksel analiz paket programı kullanılarak, "Spearman Sıra Korelasyonu Analizi" ile değerlendirilmiştir.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: In-vitro gama radyasyona maruz kalan periferal kan lenfositlerinde MDM2 ekspresyon değişiminin grafiksel gösterimi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: In-vitro gama radyasyona maruz kalan periferal kan lenfositlerinde MDM2 ekspresyon değişimi.

Bu çalışmanın sonucunda p53‘ün inhibitörü olan MDM2 geninin ekspresyonunun radyasyona maruz kaldıktan sonra hızla değiştiği gözlemlenmiştir. MDM2‘nin aşırı ekspresyonunun sebebinin, radyasyona cevap olarak hücre döngüsünün G1 fazında tutuklu kalmasına aracılık eden p53'ün aktivitesini inhibe etmek ve böylelikle hücre ölümünü baskılamak olduğu düşünülebilir¹¹. MDM2 ekspresyonu azaltılmış olan farelerde yapılan çalışmalarda, MDM2 seviyesinin sadece %20 azaltılmış olan farelerin hepsinin iyonize radyasyona maruz kaldıktan sonra öldüğü, buna karşılık olarak aynı dozu alan yabanıl tip farelerin %50'sinin hayatta kaldığı gösterilmiştir¹².

MDM2, p53'ün hem transkripsiyonunu ve hem de degredasyonunu kontrol eder. Yapılan ilk çalışmalarda p53'ün ısı duyarlı formu, MDM2 ekspresyonunun yabanıl tip p53 aktivitesi yüksekken indüklendiğini göstermek için kullanılmıştır^13,14. Bundan kısa süre sonra da ultraviyole ve iyonize radyasyonun MDM2 ekspresyonunu p53 bağımlı olarak indükleyebileceği bulunmuştur^15,16. Ancak düşük doz iyonize radyasyonun etkisi hücrelerde hala tam olarak anlaşılamamıştır¹⁷. MDM2, radyasyona cevap olarak kontrolsüz hücre ölümünün önlemesinde kritik bir role sahiptir. MDM2, p53'ü iki yolla yıkabilir. İlk yolda direk olarak p53'ün amino terminal ucuna bağlanır ve p53'ün bazal transkripsiyon sistemi ile etkileşimini bloke eder^18,19. İkinci yoldaysa ubikitin aktivitesi ile p53'ün yıkımını sağlar ve buna ilaveten nükleustan sitoplazmaya translokasyonunu teşvik eder. Sitoplazmada ise p53 bir transkripsiyon faktörü olarak işlevini yerine getiremez^5,20-22. p53'ün yıkılması veya bloke edilmesi için her halükarda MDM2'nin p53'e direk olarak bağlanması gerekir.

Sonuç olarak radyasyona cevabın düzenlenmesinde MDM2'nin kantitatif değeri oldukça önem taşımaktadır.

1) Garaj-Vrhovac V, Zeljezic D. Comet assay in the assessment of the human genome damage induced by γ radiation in vitro. Radiol Oncol 2004; 38: 43-47.

2) Jeggo P, Lobrich M. Radiation-induced DNA damage responses. Radiat Prot Dosimetry 2006; 122: 124–127

3) Zdzienicka MZ. Mammalian mutants defective in the response to ionizing radiation-induced DNA damage. Mutat Res 1995; 336: 203-213.

4) Iliakis G, Wang Y, Guan J, Wang H. DNA damage checkpoint control in cells exposed to ionizing radiation, Oncogene 2003; 22: 5834-5847.

5) Kubbutat MH, Jones SN, Vousden KH. Regulation of p53 stability by Mdm2. Nature 1997; 387: 299-303.

6) Uhrinova S, Uhrin D, Powers H. et al. Structure of free MDM2 N-terminal domain reveals conformational adjustments that accompany p53-binding. J Mol Biol 2005; 350: 587–598.

7) Chen D, Li M, Luo J, Gu W. Direct interactions between HIF-1 alpha and Mdm2 modulate p53 function. J Biol Chem 2003; 278: 13595-13598.

8) Li M, Luo J, Brooks CL, Gu W. Acetylation of p53 inhibits its ubiquitination by Mdm2. J Biol Chem 2002; 277: 50607- 50611.

9) Gamulin M, Kopjar N, Grgić M, et al. Genome damage in oropharyngeal cancer patients treated by radiotherapy. Croat Med J 2008; 49: 515-527.

10) Paul S, Amundson SA. Development of gene expression signatures for practical radiation biodosimetry. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2008; 71(4): 1236-1244.

11) Perry ME. Mdm2 in the Response to Radiation. Mol Cancer Res 2004; 2: 9-19.

12) Mendrysa SM, McElwee MK, Michalowski J, et al. Mdm2 is critical for inhibition of p53 during lymphopoiesis and the response to ionizing irradiation. Mol Cell Biol 2003; 23: 462–473.

13) Barak Y, Juven T, Haffner R, Oren M. Mdm2 expression is induced by wild type p53 activity. EMBO J 1993; 12: 461–

14) Wu X, Bayle JH, Olson D, Levine AJ. The p53-mdm2 autoregulatory feedback loop. Genes Dev 1993; 7: 1126– 1132.

15) Perry ME, Piette J, Zawadazki JA, Harvey D, Levine AJ. The mdm2 gene is induced in response to UV light in a p53-dependent manner. Proc Natl Acad Sci 1993; 90: 11623–11627.

16) Chen CY, Oliner JD, Zhan Q, et al. Interactions between p53 and Mdm2 in a mammalian cell cycle checkpoint pathway. Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91: 2684–2688.

17) Vasil\'ev SA, Stepanova E, Kutenkov OP, et al. DNA double-strand breaks in human lymphocytes after single irradiation by low doses of pulsed X-rays: non-linear doseresponse relationship. Radiats Biol Radioecol 2012; 52: 31-38.

18) Oliner JD, Pietenpol JA, Thiagalingam S, et al. Oncoprotein Mdm2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53. Nature 1993; 362: 857–860.

19) Thut CJ, Goodrich JA, Tjian R. Repression of p53- mediated transcription by Mdm2: a dual mechanism. Genes Dev 1997; 11: 1974–1986.

20) Honda R, Tanaka H, Yasuda H. Oncoprotein Mdm2 is a ubiquitin ligase E3 for tumor suppressor p53. FEBS Lett 1997; 420: 25–27.

21) Haupt Y, Maya R, Kazaz A, Oren M. Mdm2 promotes the rapid degradation of p53. Nature 1997; 387: 296–299.

22) Freedman D, Levine AJ. Nuclear exportis required for degradation of endogenous p53 by Mdm2 and human papillomavirus E6. Mol Cell Biol 1998; 18: 7288–7293.