İneklerde gebeliğin oluşumu ve devamlılığı için uterus, embriyo ve ovaryum arasında bir seri kompleks olayların gerçekleşmesi gerekmektedir. Fertilizasyon sonrası embriyo ovidukt kanalından geçerek ovulasyon sonrası takriben 3-4. günlerde uterusa ulaşmaktadır⁵. Ovulasyonu izleyerek ovaryum üzerinde şekillenen ve olgunlaşan korpus luteumdan (KL) salgılanan progesteronun etkisi ile uterus; embriyonun implantasyona kadar yaşaması için gerekli sekresyonları yapmakta ve büyüyüp gelişmesine ev sahipliği yapmaktadır^6,7. İzleyen günlerde ise zonasından çıkarak elips tarzında uzamaya başlayan embriyonun trofoblast hücrelerinden 15-16. günlerde ise gebeliğin maternal kabulü için sinyal niteliğinde olan interferon-tau (IFN-τ) üretilmeye başlamaktadır^8,9. Gebeliğin maternal kabulü sonrası embriyo uterus duvarına implante olmakta ve yavru zarlarının gelişimi ile gebelik devam etmektedir. Bu sürecin fizyolojik düzeninde işlemesi için embriyo transferinde embriyonun gelişme evresine uygun siklus yaşında olan taşıyıcıların uteruslarının uygun lokalizasyonuna bırakılması önemli olabilir. Zira daha önce ineklerde ve insanlarda yapılan bazı çalışmalarda embriyonun KL'a göre transfer edildiği kornu uteri tarafının ve transfer derinliğinin gebelik oranı üzerine etkili olduğu bildirilmiştir^10-12.

Günümüzde yaygın olarak tercih edilen non-şirurjikal embriyo transfer metodu, transfer kateterine yerleştirilen embriyonun rekto-vaginal yolla reprodüktif organlar üzerinde elle yapılan manipilasyonlarla uterusa bırakılmasıyla gerçekleştirilmektedir³. Reprodüktif sistem genel olarak ovaryum dışındaki organların tubuler bir kanal oluşturacak şekilde birbiriyle bağlamasından oluşmaktadır. İneklerde serviks ve uterusun anatomik yapısının diğer türlere göre bazı farklılıkları bulunmaktadır. Bu farklılıklar suni tohumlama ve embriyo transferi pratiği için oldukça önemlidir. Serviks uteri, yaklaşık 8-10 cm uzunluğunda olup kanalı mukozanın oluşturduğu enine kıvrımlar nedeniyle özellikle siklusun diöstrüs döneminde sirküler tarzda tamamen kapanmaktadır¹⁴. Bununla birlikte düvelerde daha ince yapılı olup dar bir lumene sahiptir. Uterus ise nispeten kısa bir korpus uteri ve birbirinden uzaklaşan uzun iki kornu uteriden oluşmaktadır. Diöstrüs döneminde kornu uteriler progesteronun etkisiyle yumuşak hamur kıvamını almakta ve ventrale doğru yönelerek kendi üzerinde kıvrılmaktadırlar^14,15. Bu farklılıklara bağlı olarak embriyo transferi uygulamalarında güçlükler oluşabildiğinden embriyo transferinde gebelik oranını etkileyen faktörlerden biri de pratisyenin tecrübe düzeyidir^13,16,17. Çünkü embriyonun transferinin diöstrüs döneminde yapılmasının gerekliliği, düvelerde transfer işlemi sırasında kateterinin kapalı ve dar bir serviks kanalındaki sirküler plikalardan geçirilmesini bunu takiben kornu uterilerden birine yönlendirilmesi ve ilerletilebilmesi için kendi üzerine katlanmış yumuşak kıvamlı ve küçük hacimli kornu uterinin mümkün olan en az travma oluşturacak el maniplasyonlarıyla düzleştirilmesini gerektirmektedir¹⁸.

Sunulan bu çalışmada etilen glikolle direk transfer metoduna göre dondurulmuş embriyoların, ipsilateral (KL bulunduğu ovaryum tarafındaki kornu uteri)/kolleteral (KL bulunduğu ovaryumun aksi tarafındaki kornu uteri) ve/veya derin (kornu uterinin bifurkasyo bölgesinden itibaren son 1/3'lük kısmı)/yüzeysel (kornu uterinin bifurkasyo bölgesinden itibaren ilk 1/3)/ transfer edilmesinin gebelik oranı üzerine etkisinin tespit edilmesi amaçlandı.

Taşıyıcı düveler, düzenli siklik aktivite gösteren düveler; 14 gün ara ile çift doz PGF2α ile senkronize edildiler. Senkronize edilen taşıyıcılar sabah 07:00–08:00 ve 19:00–20:00 saatlerinde gözlemle östrüsler tespit edilmiştir. Östrüs gösteren taşıyıcılar rektal palpasyonda reprodüktif organlarında herhangi bir klinik bozukluk belirlenmeyen ve referans östrüs sonrası 6. günde (östrüs=0. gün) yapılan rektal ve ultrasonografik muayenede ovaryumlarında en az 2 cm çapında, sert yapılı ve tercihen taçlı KL bulunan ve kornu uterilerinde asimetri, fluktasyon vb. bozukluk saptanmayan düvelerden seçildi.

Etilen glikolle direkt transfer metoduna göre dondurulmuş birinci kalite embriyolar, taşıyıcının östrüs siklusunun 7. gününde (embriyonun ve taşıyıcının siklus yaşları birbirine ±24 saat sınırları içerisinde paralel olacak şekilde) transfer edildi. Transfer öncesi taşıyıcılara bağırsak peristaltiğini önlemek amacıyla üst epidural anestezi (lidokain HCl, 5-7 mL, Vilcain^®, Vilsan, Ankara, Türkiye) yapıldı. Embriyolar, payet azot tankından çıkarıldıktan sonra 5 sn havada bunu takiben 25 sn 25°C'deki su banyosunda tutularak çözdürüldü ve aşağıdaki tanımlamalara göre dört gruba ayrılan taşıyıcılara transfer edildi.

Grup I (n=12); derin-ipsilateral transfer: Embriyonun KL'un bulunduğu ovaryum tarafındaki kornu uterinin apeks bölgesine (kornu uterinin bifurkasyo bölgesinden itibaren son 1/3'lük kısmı) bırakılması.

Grup II (n=13); yüzeysel-ipsilateral transfer: Embriyonun KL'un bulunduğu ovaryum tarafındaki kornu uterinin basis bölgesine (kornu uterinin bifurkasyo bölgesinden itibaren ilk 1/3'lük kısmı) bırakılması.

Grup III (n=13); derin-kolleteral transfer: Embriyonun KL'un bulunduğu ovaryumun aksi tarafındaki kornu uterinin apeks bölgesine bırakılması.

Grup IV (n=12); yüzeysel-kolleteral transfer: Embriyonun KL'un bulunduğu ovaryumun aksi tarafındaki kornu uterinin basis bölgesine bırakılması.

Gebelik muayeneleri östrüs sonrası 28. günde transrektal yolla ultrason cihazı kullanılarak yapıldı.

Çalışmada gruplarda elde edilen gebelik oranlarının istatistiki yönden karşılaştırılması bilgisayar SPSS paket programı kullanılarak yapıldı.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: Gruplarda elde edilen gebelik oranları

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: Gruplarda elde edilen gebelik oranları

Çalışmada embriyoların kornu uteriye bırakıldığı transfer derinliği dikkate alınmaksızın yapılan ipsilateral transferlerde elde edilen gebelik oranı %52, kolleteral transferlerde ise %28 olarak tespit edildi (Tablo 2). İpsilateral transferlerde elde edilen gebelik oranının, kollateral transferlerdekinden istatistiki olarak daha yüksek olma eğiliminde olduğu tespit edildi (P=0.07; Şekil 2). Embriyoların CL'nin bulunduğu ovaryum tarafı dikkate alınmaksızın derin ve yüzeysel olarak kornu uteriye transferlerinde elde edilen gebelik oranları ise sırasıyla %36 ve %44 bulundu (Tablo 2). Transfer derinliğine göre tespit edilen gebelik oranları arasındaki farklılıkta istatistiki olarak önemli bulunmadı (P>0.05; Şekil 2).

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 2: Embriyoların ipsilateral-kolleteral veya derinyüzeysel transferlerinde elde edilen gebelik oranları

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 2: Embriyoların ipsilateral-kolleteral veya derinyüzeysel transferlerinde elde edilen gebelik oranları

İneklerde gebeliğin oluşumu için öncelikle progesteron üretiminin devamlılığını sağlayan CL'nin uterus venasından ovaryum arterine difüzyon yoluyla geçerek regresyonuna neden olan PGF2α'nın pulsatif salınımının durdurulması gerekmektedir¹⁹. Gebeliğin maternal kabulü olarak tanımlanan bu olaylar zinciri embriyonun trofoblastik hücrelerinden üretilen interferontau (IFN-τ) adı verilen bir sitokin aracılığıyla varlığını anneye bildirmesiyle başlamaktadır. Genel olarak IFN- τ'nun luteolizisin önlenmesinde fonksiyonunu uterus endometriyumunda östradiol reseptörlerini baskılayarak oksitosin reseptörlerinin artışına engel olmak suretiyle gerçekleştirdiği kabul edilmektedir^19,20. Embriyo transferi çalışmalarında genel olarak embriyonun CL'nin lokalizasyonuna göre ipsilateral olarak transfer edildiğinde daha yüksek gebelik oranları elde edildiği bildirilmiştir. Bununla birlikte kolleteral transferlerde de ipsilateral transferlere benzer^11,21 hatta daha yüksek²² oranlarda gebelik elde edildiği bildirilmiştir. Gebeliğin maternal kabul sürecinde IFN-τ'nun uterustaki lokal fonksiyonlarına ilave olarak sistemik etkilerinin olabileceği belirtilmektedir ki Spencer ve ark²⁰ eksojen IFN-τ uygulamasının uterusta oksitosin ve östradiol reseptörlerinin ekspresyonunu baskılamakla birlikte CL'de Mx ve UCRP genlerinin ekspresyonunda artış oluşturduğunu ve bu etkisinin; IFN-τ'nun kendisinin doğrudan oluşturduğu bir etki, vücutta sistemik etki oluşturan maddelerin indüklenmesi veya luteal fonksiyonlar üzerine etkileri ilerleyen süreçte oluşan savunma hücreleri aracılığıyla oluşabileceğini belirtmişlerdir. Uterus dışı dokularda da (CL ve periferal beyaz kan hücreleri) bazı genlerin ekspresyonunda da gebeliğe bağlı artış olduğunun tespiti sistemik bir düzenlemenin de olabileceği görüşünü desteklemektedir^23-26. Sunulan çalışmanın sonuçları; Grup I, II, III ve IV'teki gebelik oranları arasındaki farklılıklar önemli olmamakla birlikte transferlerin ipsilateral olarak yapıldığı Grup I ve Grup II'de gebelik oranlarının kolleteral yapıldığı Grup III ve IV'ten rakamsal olarak fazla olması ve transferlerin ipsilateral ve kolleteral değerlendirildiğinde gebelik oranlarındaki arasındaki istatistiki farklılığın önemlilik düzeyine yakın olması (P=0.07) ve gruplardaki transfer sayılarının düşüklüğü beraber değerlendirildiğinde embriyonun ipsilateral kornuya yapılması gerekliliğini desteklemektedir.

Sunulan çalışmada elde edilen gebelik oranları embriyonun sadece kornu uteriye bırakıldığı derinliğe göre değerlendirildiğinde derin ve yüzeysel transferler sonrası elde edilen gebelik oranları açısından farklılık tespit edilememiştir. Beal ve ark.¹⁰ ise bu sonuçlarımızın aksine derin transferlerde elde edilen gebelik oranının yüzeysel transferlerden elde edilen gebelik oranından yüksek olduğunu bildirmişlerdir. Hasler¹⁷ ise transfer derinliğin embriyoların kalitesinin bizim çalışmamızda olduğu gibi birinci kalite olması halinde gebelik oranı üzerine etkisinin olmadığını bildirmektedir. Embriyo transferi tekniğinde genel olarak embriyonun mümkün olduğunca, yaşına göre muhtemel olabileceği bölgenin kornu uterinin apikal 1/3-1/2'lik kısmı olması nedeniyle apeks kısmına bırakılması tavsiye edilmektedir. Ancak uzun süreli manipulasyonun embriyo için toksik olduğu daha önce yapılan çalışmalarda belirtilen PGF2α'nın salınımına neden olduğu²⁷ için transfer işleminin en kısa sürede tamamlanması gerekmektedir. Sunulan çalışmada da birinci kalite embriyoların çözündürüldükten sonraki 5 dk içerisinde uterusa bırakılmasının derin ve yüzeysel transferlerde gebelik oranlarında farklılığın oluşmamasının nedeni olabileceği düşünülmektedir. İkinci bir neden olarak embriyonun beslenmesinin kornu uterideki lokalizasyonundan etkilenmemesi sonucunu sağlamak suretiyle ineklerde endometriyal bezlerin dağılımının kornu uteriler boyunca aynı homojenlikte olması²⁸ düşünülmektedir. Üçüncü olarak çalışmada transfer işleminin daha önce ki bazı çalışmalarda embriyoların korpus uteriye yakın şekilde kornu uteriye bırakılmasının mikrobiyal kontaminasyona yol açma riskini²⁹ en bazal seviyede tutacak şekilde hijyenik koşulların oluşturulması suretiyle gerçekleştirilmesi varsayılmaktadır. Ayrıca yüzeysel transferlerin mikrobiyal kontaminasyon için bir risk faktörü olmadığı da Looney ve ark.¹⁸ tarafından belirtilmektedir.

Sonuç olarak bu çalışmanın sonuçlarına göre istatistiki anlamda önemlilik olmamakla birlikte embriyonun CL'nin lokalizasyonuna göre ipsilateral kornu uteriye transfer edilmesi gerektiği ve embriyonun kornu uterinin bifurkasyo bölgesi geçildikten sonra bırakılmasının kabul edilebilir düzeyde gebelik oranı elde edilmesi için yeterli olduğu kanısına varıldı. Bu çalışmanın sonuçlarının gruplardaki transfer sayısının düşüklüğüne rağmen henüz ülkemizde yaygınlaşmamış olan embriyo transferi tekniğinin yaygınlaşabilmesi için saha pratisyenlerine transfer tekniğinin uygulanmasında katkı sağlayacağı düşünülmektedir.

1) Hasler JF. Factors affecting frozen and fresh embryo transfer pregnancy rates in cattle. Theriogenology 2001; 56: 1401-1415.

2) Gali C, Duchi R, Crotti G, et al. Bovine embryo technologies. Theriogenology 2003; 59: 599-616.

3) Sağırkaya H, Bağış H. Memeli embriyolarının kriyoprezervasyonu. Uludag Univ J Fac Vet Med 2003; 22: 127-135.

4) Kızıl SH, Akyol N, Karaşahin T, Satılmış M. Etilen glikol ile direkt transfer metoduna göre dondurulan in vivo sığır embriyolarının transferi. Kafkas Univ Vet Fak Derg 2011; 17: 721-724.

5) Gordon IR. Culturing and evaluating the early bovine embryo. In: Gordon IR. (Editor). Laboratory Production of Cattle Embryos. 2rd Edition, Trowbridge, England: Cromwell Press 2003: 220-276.

6) Spencer TE, Johnson GA, Burghardt RC, Bazer FW. Progesterone and placental hormone actions on the uterus. Insights from domestic animals. Biol Reprod 2004; 71: 2–10.

7) Spencer TE, Bazer FW. Uterine and placental factors regulating conceptus growth in domestic animals. J Anim Sci 2004; 82: 4-13.

8) Thatcher WW, Meyer MD, Danet-Desnoyers G. Maternal recognition of pregnancy. J Reprod Fertil (Suppl) 1995; 49: 15-28.

9) Spencer TE, Bazer FW. Conceptus signals for establishment and maintenance of pregnancy. Reprod Biol Endocrinology 2004; 2: 49.

10) Beal WE, Hinshaw RH, Whitman SS. Evaluating embryo freezing method and the site of embryo deposition on pregnancy rate in bovine embryo transfer. Theriogenology 1998; 49: 241.

11) Hernandez-Fonseca HJ, Sayre BL, Butcher RL, Inskeep EK. Embryotoxic effects adjacent and opposite to the early regressing bovine corpus luteum. Theriogenology 2000; 54: 83-91.

12) Mohammed MAS. The influence of the depth of embryo transfer into the uterine cavity on implantation rate. Middle East Fertility Society Journal 2010; 15: 174-178.

13) Gordon IR. Embryo transfer. In: Gordon IR. (Editor). Reproductive Technologies in Farm Animals. Cambridge: CAB International: 82-107.

14) Pineda MH. Female reproductive system. In: Pineda MH. (Editor). McDonald's Veterinary Endocrinology and Reproduction. 5th Edition, Iova: Blackwell Publishing Company 2003: 283-340.

15) Gürler H, Fındık M. Dişi üreme sisteminin morfolojisi. In: Semacan A, Kaymaz M, Fındık M, Rişvanlı A, Köker A. (Editörler). Çiftlik Hayvanlarında Doğum ve Jinekoloji. 1. Baskı, Malatya: Medipress Matbaacılık 2012: 3-14.

16) Schneider HJ, Castleberry RS, Griffin JL. Commercial aspects of bovine embryo transfer (abstract). Theriogenology 1980; 13: 73-85.

17) Hasler JF. Bovine embryo transfer: Are efficiencies improving? Applied Reproductive Strategies Conference Proceedings, Nashville, TN, August 5th & 6th, 2010; 265-282.

18) Looney CR, Nelson JS, Schneider HJ, Forrest DW. Improving fertility in beef cow recipients. Theriogenology 2006; 65: 201-209.

19) Güzeloğlu A. İneklerde gebeliğin maternal kabulü sürecinde anti-luteolizisin moleküler mekanizması. Eurasian J Vet Sci 2006; 22: 83-88.

20) Spencer TE, Stagg AG, Ott TL, et al. Differential effects of intrauterine or subcutaneous administration or recombinant ovine interferone tau on endometrium of cyclic ewes. Biol Reprod 1999; 61: 464-470.

21) Del Campo MR, Rowe RF, French LR, Ginther OJ. Unilateral relationship of embryos and corpus luteum in cattle. Biol Reprod 1977; 16: 580-585.

22) Callesen H, Greve T, Avery B. Embryo technology in cattle: brief review. Acta Agriculturae Scandinavica, (Section A, Animal Science Supp.) 1998; 29: 19-29.

23) Yankey SJ, Hicks BA, Carnahan KG, et al. Expression of the antiviral protein Mx in peripheral blood mononuclear cells of pregnant and bred, non-pregnant ewes. J Endoc 2001; 170: 7-11.

24) Gifford CA, Racico K, Clarck DS, et al. Regulation of interferon-stimulated genes in peripheral blood leukocytes in pregnant and bred, nonpregnant dairy cows. J Dairy Sci 2007; 90: 274-280.

25) Köse M, Görgülü M, Kaya MS, et al. Expression profiles of ınterferon-tau stimulated genes (ISGs) in peripheral blood leucocytes (PBLs) and milk cells in pregnant dairy cows. Kafkas Univ Vet Fak Derg 2014; 20: 189-194.

26) Oliveria JF, Henkes LE, Ashley RL, et al. Expression of interferon (IFN)-stimulated genes in extrauterine tissues during early pregnancy in sheep is the consequence of endocrine IFN-τ release from the uterine vein. Endocrinology 2008; 149: 1252-1259.

27) Weems CW, Weems YS, Randel RD. Prostaglandins and reproduction in female farm animals. Vet J 2006; 171: 206-228.

28) Gray CA, Bartol FF, Tarleton BJ, et al. Developmental biology of uterine glands. Biol Reprod 2001; 65: 1311- 1323.

29) Hussain AM, Jillella D, Daniel RCW, Frost AJ. Studies on some bacteriological aspects of non-surgical embryo transfer in cattle. Reprod Dom Anim 1994; 29: 55-60.