Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA Yöntemiyle Kanatlı Etlerinde Tür Tayini

Bu çalışmada, 9 adet kanatlı etinde (tavuk, hindi, martı, devekuşu, ördek, kaz, bıldırcın, keklik ve karga) Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA yöntemi kullanılarak tür tayini yapıldı.

Çalışmada, Guanin-Sitozin oranları %50 ile %80 arasında değişen, 12 adet 10 bazlık primer kullanıldı. Kanatlı türleri, Rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA profilleri karşılaştırılarak ayırt edildi.

Sonuç olarak, kullanılan bazı primerlerin kanatlı etlerinde tür tayini için uygun olduğu bazılarının ise uygun olmadığı tespit edildi. Çalışmanın sonuçları, Rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA yöntemiyle kanatlı etlerinde tür tayini için uygun primerlerin kullanılması gerektiğini gösterdi.

In this study, meats of 9 poultry species (chicken, turkey, gull, ostrich, duck, goose, quail, partridge, and crow) were identified by random amplified polymorphic DNA (RAPD) method using 12 different

10 bp-nucleotide primers with guanine and cytosine (GC) contents, ranging from 50-80%. In general, the species were differentiated by comparing RAPD fingerprinting of the species.

However, some primers used were not suitable for identification of poultry meats while the some primers were suitable. Therefore, the results indicated that identification of poultry meat species by RAPD technique requires use of suitable primers.

Giriş

Artan dünya nüfusunun aksine hayvansal kökenli protein yetersizliği giderek artmaktadır. Hayvansal protein yetersizliğine bağlı olarak et ve et ürünleri yüksek fiyatla satılmaktadır. Buna bağlı olarak gelir düzeyi düşük tüketicilerin ucuz et ve ürünlerine olan istemleri artmaktadır. Bazı kişiler bunu fırsat bilip daha çok para kazanmak amacıyla çok ucuz bir şekilde sağladıkları toplumun tüketmediği hayvan etlerini doğrudan veya et ürünlerine karıştırarak satışa sunarlar [1].

Kırmızı et türlerinin ayrımında duyusal niteliklere, anatomik farklılıklara, kılın histolojik farklılığına, doku yağlarının özelliklerine ve etlerdeki glikojen miktarına dayanan yöntemlerin yanı sıra immunolojik, elektroforetik ve DNA hibridizasyon yöntemleri de kullanılmaktadır [2-5]. Ancak, morfolojik ve duyusal özelliklere göre, kanatlı etlerinde tür ayrımının yapılmasının çok güç olduğu belirtmişlerdir [6]. Bunun yanı sıra, immunolojik, elektroforetik ve DNA hibridizasyon yöntemlerinde karşılaşılan güçlükler ve bazı dezavantajlar nedeniyle de, kanatlı et ve et ürünlerinin orijininin tespit edilmesi için doğru sonuç veren, basit ve hızlı yöntemlerin geliştirilmesinin zorunlu hale geldiğini vurgulamışlardır.

Son yıllarda, Polimeraz Zincir Reaksiyon (PZR) yönteminin geliştirilmesi bitki, bakteri ve hayvan türlerinin orijininin tespit edilmesinde büyük kolaylık sağlamış ve başarıyla kullanılmıştır [7-10]. PZR ile PZR tabanlı olan Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA (Random Amplified Polymorphic DNA =RAPD) ve Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) yöntemleriyle et türlerinin ayırımı yapılmıştır [11-13].

Bu çalışmada, RAPD yöntemiyle, farklı GC oranlarına sahip primerler kullanılarak kanatlı etlerinde tür tespiti yapıldı. Ayrıca, RAPD yönteminin rutin bir analiz yöntemi olarak, kanatlı etlerinde tür tespiti için kullanılabilme durumu değerlendirildi.

Gereç ve Yöntem

Et Örnekleri: Çalışmada tavuk, hindi, martı, deve kuşu, ördek, kaz, bıldırcın, keklik ve karga kas dokusu kullanıldı. DNA Ekstraksiyonu: Kas dokularından DNA ekstraksiyonu Arslan ve ark. [14] bildirdiği yöntemle gerçekleştirildi.

Primerler: Çalışmada Tablo 1'de verilen primerler kullanıldı. Primerler Integrated DNA Technologies, Inc, (Coralville, USA) firmasından temin edildi. M- 100 bp DNA markers (Fermentas), 1- tavuk, 2- hindi, 3- martı, 4- deve kuşu, 5- ördek, 6- kaz, 7- bıldırcın, 8- keklik, 9- karga.

RAPD-PZR ve Agaroz Jel Elektroforezi: RAPD-PZR işlemi, touchdown thermocycler (Hybaid, Middlesex, England) cihazı ile yapıldı. Toplam hacmi 50 µl olacak şekilde eppendorf tüpe 5 µl 10xPCR buffer (10 mM Tris-HCl,pH 9.0,50 mM KCl,%0.1 TritonmX-100), 7.5 µl 25 mM MgCl2, 250 µM deoksinükleotidtrifosfat (dNTP), 2 U Tag DNA polimeraz (Promega,Madison,USA), 2.5 ml 20-25 pmol 10 nt-primer ve 5 µl hedef DNA konuldu. Hazırlanan eppendorf tüpleri thermocycler cihazına yerleştirilip 94ºC'de 1 dakika, 36ºC'de 1 dakika, 72ºC'de 2 dakika bekletilerek toplam 45 siklusta PZR işlemi gerçekleştirildi.

Çoğaltılan DNA segmentleri %1.5' lik agaroz jele (Sigma) yüklenerek 2 saat 100 voltta elektroforez işlemine tabi tutuldu. Elektroforez işlemini takiben jel ethidium bromide (0.5 mg/ml) ile boyanarak UV transilluminator'de gözlendi ve fotağrafı çekildi. Çalışma 3 kez tekrar edildi.

RAPD Profillerinin Değerlendirilmesi: Her tür için elde edilen RAPD profillerinin değerlendirilmesi Koh ve ark. [8] bildirdiği şekilde yapıldı. Her bir tür için en az 2 adet DNA bandı oluşturan primerler pozitif (+), 2 adetten az DNA bandı oluşturan primerler negatif (-) olarak değerlendirildi (tablo 2).

Bulgular

Her tür için elde edilen RAPD profillerinden bazı örnekler gösterildi. Primerlerin değerlendirilmesi Tablo 2'de verildi. Genel olarak %50, %60 ve %70 GC içeren primerler %80 GC içeren primerlerden daha iyi sonuçlar verdi.

GC oranı %50 olan primer 1 (Şekil 5) ve primer 2 (Tablo 2) tüm kanatlı türlerinde birbirinden farklı RAPD profilleri gösterdi.

GC oranı %60 olan primerlerden primer 3 hariç, diğer primerler (primer 4, 5 ve 6) çalışmada kullanılan kanatlı etlerinde nispeten ayırt edici RAPD profilleri gösterdiler. Primer 3 sadece deve kuşu ve karga'nın DNA'sında RAPD profili oluşturdu, diğer tür kanatlıların DNA'sından RAPD profili oluşturmadı (Tablo 2). Primer 4 deve kuşunda sadece 1 bant RAPD profili oluşturdu, bunun yanı sıra hindi ve martı eti için oluşturduğu RAPD profili incelendiğinde, 2 tür arasında ayırt edici bir farklılık oluşturmadığı görüldü (Şekil 3). Primer 5 tavuk ve kaz DNA'sında RAPD profili oluşturmadı (Tablo 2). Primer 6 ise çalışmada kullanılan tüm kanatlı türleri için birbirinden farklı RAPD profilleri oluşturdu (Şekil 4).

GC oranı %70 olan primerler (primer 7, 8, 9 ve10) tüm kanatlı türlerinde RAPD profili oluşturdu ( Şekil 1 ve 2). Fakat primer 8 (Şekil 1) ve 10, ördek ile kaz eti arasında belirgin bir farklılık oluşturmadı.

GC oranı %80 olan primer 11 kaz eti hariç çalışmada kullanılan diğer türler için RAPD profili oluşturmadı (Table 2). Primer 12 ise hindi, martı, deve kuşu ve bıldırcın eti için RAPD profili oluşturdu. Fakat hindi ve bıldırcın için oluşturduğu RAPD profilleri arasında belirgin bir farklılık ortaya koymadı.

Tartışma

Koh ve ark. [8], RAPD yöntemiyle alınan sonuçların kullanılan primere göre çok çeşitli olacağını bildirmişlerdir. Bazı primerlerin, genomda farklılıkların bulunduğu bölgeleri çoğaltamamasından dolayı, biri birine yakın türler arasında aynı RAPD profillerini verebileceği, bazı primerlerin ise genoma uygunluk gösterememesinden dolayı RAPD profili oluşturmayacağını belirtmişlerdir. Bazı araştırmacılar da [7,12,15], primerde bulunan bir bazın değiştirilmesinin, hedef DNA'da farklı bölgelerin çoğaltılmasına, dolayısıyla çok farklı bir RAPD profili elde edilmesine neden olacağını bildirmişlerdir. Yaptığımız bu çalışmada da, kullanılan her primer için farklı bir RAPD profili elde edildiği, bazı primerlerin tür ayrımı için yetersiz kaldığı, bazılarının ise tür ayrımı için uygun olmadığı görüldü.

RAPD yönteminde elde edilen RAPD profillerinin, PZR mixinde bulunan MgCl₂ miktarı ve hedef DNA konsantrasyonundan, primer bağlanma sıcaklığından, primerdeki baz sayısından ve dizilişlerinden etkilendiği bildirilmiştir [7]. Yaptığımız bu çalışmada da, aynı kanatlının aynı kas dokusundan DNA ekstrakte edilmesine, aynı marka ve aynı konsantrasyonda agaroz jel ve PZR mixi, aynı miktarda hedef DNA ve primer ile aynı PZR prosedürü kullanılmasına rağmen, tekrarlar esnasında RAPD profilleri arasında küçük değişiklikler gözlendi (bir tekrarda bazı bantlar çok belirgin iken, diğer tekrarda az belirgin olması gibi). Bu gibi durumlarda ekstrakte edilen DNA bir miktar daha steril distile suyla sulandırıldığında (100 ml yerine 300 µl), RAPD profilleri arasında gözlenen farklılığın ortadan kalktığı görüldü. Bu gibi problemlerle karşılaşılmasının sebebi, ekstraksiyon esnasında hedef DNA'nın yeterince saf olarak elde edilememesine veya çok yoğun elde edilmesine bağlanabilir.

RAPD yönteminin başlıca avantajları, spesifik PZR ve RFLP yöntemlerindeki gibi her hayvan için türe spesifik primerin kullanılmasına ve her hayvan türü için ayrı bir PZR işlemine gerek duyulmamasıdır [7-8]. Ayrıca türlerin DNA dizilişlerinin bilinmesine de gerek yoktur [12]. Bu avantajlar sayesinde RAPD yöntemiyle et türlerinin tespiti daha kısa sürede ve daha ucuz olarak yapılmaktadır [16-17]. Dezavantajları olarak, farklı primerler ile farklı sonuçlar alınması [8] ve aynı tür içerisinde, tekrarlar arasında küçük varyasyonlar çıkabilmesi dolayısıyla, kullanılan hedef DNA miktarının ve RAPD yönteminin tam olarak standardize edilmesi gerektiği vurgulanabilir. Aksi takdirde, laboratuarlar arasında alınan sonuçlar tartışılabilir. Ayrıca, RAPD metodu karışım halindeki farklı tür hayvan etlerinin orijinlerinin saptanmasında kullanışlı olmayabilir [14].

Sonuç olarak, kanatlı hayvan etlerinin tür tespitinde, GC oranı %70 olan primerler GC oranı %50, %60 ve %80 olan primerlerden daha iyi sonuçlar verdi. Fakat, daha fazla sayıda primerin denenerek en uygun primer/ primerlerin tespit edilmesi yerinde olacaktır.

Özetle, tür tespitinde kullanılan diğer metotlarla karşılaştırıldığında, RAPD yöntemiyle kanatlı etlerinde tür tayini daha kolay, daha ucuz ve hızlı olabilir. Fakat, tam olarak standardize edilmediği takdirde, yukarıda bahsedilen dezavantajlarından dolayı her zaman güvenilir bir metot olmayabilir.

References

1. İlhak İ, Arslan A. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) yöntemiyle sığır, koyun, keçi ve yabani domuz etinin ayırt edilmesi. F.Ü. Sağlık Bilimleri Dergisi 2003; 17: 59-63.
2. Kang'ethe EK, Jones SJ, Patterson RLS. Identification of the species origin of fresh meat using an ELISA procedure. Meat Sci 1982; 7: 229-240.
3. Allsup TN. A comparison of the agar gel immuno-diffusion (AGID) and counter-immunoelectrophoresis (CIE) tests for species identification of imported red meat and offal. Meat Sci 1987; 20: 119-128.
4. Wintero AK, Thomsen PD, Davies W. A comparison of DNA- hybridization, immunodiffusion, countercurrent immunoelectrophoresis and isoelectric focusing for detecting the admixture of pork to beef. Meat Sci 1990; 27: 75-85.
5. Ebbehoj FK, Thomsen DP. Species differentiation of heated meat products by DNA hybridization. Meat Sci 1991; 30: 221-234.
6. Hird H, Goodier R, Hill M. Rapid detection of chicken and turkey in heated meat products using the polymerase chain reaction followed by amplicon visualisation with vistra green. Meat Sci 2003; 65: 1117-1123.
7. Lee CJ, Chang GJ. Random amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction (RAPD-PCR) fingerprints in forensic species identification. Forensic Sci Int 1994; 67: 103-107.
8. Koh MC, Lim CH, Chua SB, Chew ST, Phang STW. Random Amplified Polymorphic DNA ( RAPD ) fingerprints for identification of red meat animal species. Meat Sci 1998; 48: 275-285.
9. Zhang G, Zheng M, Zhou Z, Ouyang H, Lu Q. Establishment and application of a polymerase chain reaction for the identification of beef. Meat Sci 1999; 51: 233-236.
10. Partis L, Croan D, Guo Z, Clark R, Coldham T, Murby J. Evaluation of a DNA fingerprinting method for determining the species origin of meats. Meat Sci 2000; 54: 369-376.
11. Meyer R, Höfelein C, Lüthy J, Candrian U. Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis: A simple method for species identification in food. J AOAC Int 1995; 78: 1542-1551.
12. Martinez I, Yman MI. Species identification in meat products by RAPD analysis. Food Res Int 1998; 31: 459-466.
13. Saez R, Sanz Y, Toldra F. PCR-based fingerprinting techniques for rapid detection of animal species in meat products. Meat Sci 2004; 66: 659-665.
14. Arslan A, Ilhak I, Calicioglu M, Karahan M. Identification of meats using random amplified polymorphic DNA (RAPD) technique. J Muscle Foods 2005; 16: 37-45.
15. Williams JGK, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA, Tingey SV. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research 1990; 18: 6531-6535.
16. Matsunaga T, Chikuni K, Tanabe R, Muroya S, Shibata K, Yamada J, Shinmura YA. Quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Sci 1999; 51: 143-148.
17. Welsh J, McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Research 1990; 18: 7213-7218.