Sığır Dalak Doku Arginazının Bazı Kinetik Özellikleri

Bu çalışmada sığır dalak doku arginazının bazı kinetik özelliklerini incelenmiştir.

Çalışmada kullanılan dalak dokuları Elazığ'daki Elkas kesimevinden temin edilmiştir. Arginaz aktivitesini ölçmede tiyosemikarbazid-diasetilmonoksim üre (TDMU) metodu kullanılmıştır. Protein Lowry ve arkadaşlarının metoduna göre ölçülmüştür.

Preinkübasyon sıcaklığı, preinkübasyon süresi, inkübasyon süresi ve optimal pH' nın sırasıyla 62ºC, 15 dakika, 10 dakika ve 9.7 olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca sığır dalak doku arginazının çeşitli metal iyonlarına karşı duyarlılığı tespit edilmiş ve metal iyonları (Mn⁺², Cu⁺², Mg⁺², Ba⁺², Fe⁺³, Ag⁺², Cr⁺³, Sn⁺², Hg⁺², Pb⁺², Co⁺², Ni⁺², Zn⁺², Cd⁺², Li⁺¹, K⁺¹, Al⁺³, Mo⁺⁶, Na⁺¹ ve Ca⁺² ) içinde enzim aktivitesi üzerine en etkili metalin Mn⁺² olduğu bulunmuştur. Enzim 2 mM' lık MnCl₂ konsantrasyonunda en yüksek aktiviteyi göstermiştir. Enzim aktivasyonu için Mn+2 iyonlarının ve preinkübasyonun gerekli olduğu görülmüştür. Pb⁺² ve Ag⁺² iyonları varlığında enzim hiç aktivite göstermemiştir.

Enzimin substrata olan ilgisi Michaelis -Menten grafiğine göre değerlendirilmiş ve Km değeri 5 mM olarak bulunmuştur.

In this study, some kinetic properties of arginase in bovine spleen tissue were examined.

The spleen tissues used in the present study were obtained from the Elkas sloughterhause in Elazıg. The thiosemicarbazide- diacetylmonoxime urea (TDMU) method was used

Preincubation temperature, preincubation period, incubation period and optimal pH were determined to be 62ºC, 15 min, 10 min and 9.7 respectively. Furthermore, it was found that arginase in bovine spleen tissue was sensitive to different metal ions. It was found that the most effective was Mn⁺² from among Mn⁺², Cu⁺², Mg⁺², Ba⁺², Fe⁺³, Ag⁺², Cr⁺³, Sn⁺², Hg⁺², Pb⁺², Co⁺², Ni⁺², Zn⁺², Cd⁺², Li⁺¹, K⁺¹, Al⁺³, Mo⁺⁶, Na⁺¹ and Ca⁺² metal ions. Arginase showed the

highest activity in a 2 mM MnCl₂ concentration. Manganese ions and preincubation were necessary for the activation of the enzyme. The enzyme has no activity in presence of Pb and Ag ions.

The relationship with the enzyme substrate was evaluated according to Michaelis- Menten and the Km value was 5 mM.

Giriş

Arginaz (L-arginine amidinohydrolase, E.C. 3.5.3.1) üre siklusunun son reaksiyonunda L-argininin, L-ornitin ve üreye hidrolizini katalize eden bir enzimdir[1].Arginaz enziminin esas kaynağı memeli karaciğeri olmasına rağmen daha düşük miktarlarda böbrek, kalp kası, bağırsak, akciğer, dalak, beyin ve iskelet kası gibi ekstrahepatik dokularda da bulunmuştur[2].

Arginazın üre döngüsü olmayan ekstra hepatik dokularda poliamin sentezine katılmak ve protein biyosentezi için gerekli olan prolinin sentezlenmesi olmak üzere özel fonksiyonlara sahip olduğu saptanmıştır[3].

Yapılan literatür taramalarında koyun meme doku arginazı[3],sığır rumen doku arginazı[4], M. Benedeni arginazı[5], insan tiroid arginazı[6], koyun gözü vitreusu[7] ve insan tükürüğü arginazı[8] gibi bir çok türde ve farklı dokularda arginaz enziminin bazı kinetik özellikleri ortaya konmuş ama sığır dalak doku arginazı üzerine herhangi bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu sebeple yapılan çalışmada sığır dalak doku arginazının bazı kinetik özelliklerinin ilk kez ortaya konulması amaçlanmıştır.

Gereç ve Yöntem

Araştırma materyali olan sığır dalağı Elazığ Elkas tesislerine kesim için getirilen 4-5 yaşlarındaki, yetiştirme şartları ve fiziksel özellikleri aynı olan 20 adet Holştayn ırkı sığırdan temin edilmiştir. Kesimden sonra alınan dalak dokusu üzerindeki kan ve pıhtıdan temizlendikten sonra %0.9' luk soğuk NaCl çözeltisi içerisinde behere aktarılmış ve buz içerisinde hızlı bir şekilde laboratuara ulaştırılmıştır.

Doku örnekleri iki süzgeç kağıdı arasında kurutulduktan sonra MnCl₂ ile (1/6 w/v) sulandırılarak Potter Elvehjem (cam-cam) homojenizatörde homojenize edilmiştir. Homojenat +4 ºC 14000 rpm' de 13 dakika santrifügasyona tabi tutulmuş ve örneklerin süpernatanları enzim kaynağı olarak kullanılmıştır. Tiyosemicarbazid-diasetilmonoksim üre (TDMU) yöntemi[9] kullanılarak sığır dalak doku arginazının preinkübasyon ısısı ve zamanı, inkübasyon zamanı, Mn⁺² konsantrasyonu , optimal pH' nın tespiti ve arginaz aktivitesinin L-arginin konsantrasyonuna bağlı değişimi incelenmiştir. Protein miktarıda Lowry ve arkadaşlarının metodu ile ölçülmüştür[10].

Sığır dalak doku örneklerinin her ml süpernatantına 3 ünite Jack-Bean üreaz enzimi ilave edildikten sonra 37 ºC' de 15 dakika inkübe edilerek endojen ürenin parçalanması sağlanmıştır[11].

Çalışmada, 1 ünite enzim 1 saatte, 37 ºC' de L-argininden 1 µmol üre oluşturan enzim miktarı olup, spesifik aktivite µmol üre / saat / mg protein olarak ifade edilmiştir.

Bulgular

1- Preinkübasyon Isısının Tespiti: Sığır dalak doku arginaz enziminin aktivasyonu için preinkübasyon ısısı araştırılmış ve bunun için enzim kaynağı, mangan iyonları varlığında 30-75 ºC' lerde preinkübasyon ısısına tutulmuştur. En yüksek enzim aktivitesi 62 ºC' de saptanmış ve bundan dolayı enzimin aktivasyonu için preinkübasyon ısısı 62 ºC olarak kabul edilmiştir (Şekil 1).

2-Preinkübasyon Zamanının Tespiti: Sığır dalak doku arginazının preinkübasyon zamanına bağlı olarak değişimi araştırılmış, MnCl₂ varlığında ve 62 ºC preinkübasyon ısısında, 0-30 dakikalık zaman aralıklarında enzimin aktivitesi incelenmiştir. Enzimin maksimum aktiviteye 15 dakikada ulaştığı görülmüş ve preinkübasyon süresi 15 dakika olarak kabul edilmiştir (Şekil 2).

3- İnkübasyon Zamanının Tespiti: Sığır dalak doku arginazı için optimum inkübasyon süresinin saptanmasında enzim kaynağı 0-30 dakikalık zaman dilimlerinde inkübasyona tabi tutulmuş ve bunu argininin hidrolizi takip etmiştir. Reaksiyon sonunda meydana gelen ürenin zaman faktörüne bağlı olarak miktarları belirlenmiştir. Şekil 3'de de görüldüğü gibi üre sentezindeki artış zamana bağlı olarak 10. dakikaya kadar doğrusallığını korumuş, bu sürenin sonunda lineerlik yerini hiperbolik bir görünüme bırakmıştır. Bundan dolayı enzim için optimum inkübasyon süresi 10 dakika olarak kabul edilmiştir.

4- MnCl₂' nin etkisi: Arginaz enzim aktivitesi üzerine mangan iyonlarının etkisini araştırmak için 0-8 mM konsantrasyonları arasında değişen MnCl₂ preinkübasyon ortamına ilave edilmiş ve enzim aktivitesi incelenmiştir. Preinkübasyon ortamına Mn⁺⁺ katılmadığı kontrol grubunda enzim aktivitesi çok düşüktür. Ortama Mn⁺⁺ iyonları ilave edildiğinde aktivitenin belirgin bir şekilde arttığı gözlenmiştir. Enzimin en yüksek aktiviteyi 2 mM' lık MnCl₂ konsantrasyonunda göstermesinden dolayı sığır dalak doku arginazı için en uygun MnCl₂ konsantrasyonu 2 mM olarak tespit edilmiştir (Şekil 4).

5- Metal İyonlarının Etkisi: Sığır dalak doku arginaz aktivitesi üzerine bazı metal iyonlarının etkisini araştırmak için 2 mM konsantrasyonda Mn⁺², Cu⁺², Mg⁺², Ba⁺², Fe⁺³, Ag⁺², Cr⁺³, Sn⁺², Hg⁺², Pb⁺², Co⁺², Ni⁺², Zn⁺², Cd⁺², Li⁺¹, K⁺¹, Al⁺³, Mo⁺⁶, Na⁺¹ ve Ca⁺² metal iyonları preinkübasyon ortamına eklenerek aktiviteye bakılmış ve kontrole göre değerlendirilmiştir. Enzimin en yüksek katalitik aktiviteyi Mn⁺² varlığında gösterdiği tespit edilmiştir. Ni⁺², Co⁺², Cd⁺², Li⁺¹, K⁺¹, Al⁺³, Fe⁺³, Zn⁺², Ba⁺², Hg⁺² ve Mg⁺² varlığında enzimin katalitik aktivitesinde artış görülürken Mo⁺⁶, Ca⁺², Cu⁺², Cr⁺³, Sn⁺² ve Na⁺¹ varlığında enzimin katalitik aktivitesinde azalma tespit edilmiştir. Pb⁺² ve Ag⁺² varlığında ise enzim hiç aktivite göstermemiştir (Tablo 1).

6- Optimal pH' nın Tespiti: Sığır dalak doku arginazının optimal pH' sını tespit etmek için 7.5 ile 11 arasında değişen pH' larda tampon çözeltiler hazırlanmıştır (Glisin-NaOH tamponu, Tris-HCl tamponu, Sodyum bikarbonat- Sodyum karbonat tamponu). Şekil 5' de görüldüğü gibi pH grafiği çan eğrisi şeklinde olup (Bell shape) en yüksek aktiviteyi Sodyum bikarbonat- Sodyum karbonat tamponu pH 9.7' da verdiğinden dolayı optimal pH 9.7 olarak kabul edilmiştir.

7- Mn⁺² İyonlarının ve Preinkübasyon Isısının Sığır Dalak Doku Arginaz Aktivitesine Etkisi: Preinkübasyon ısısının Mn⁺²' iyonlarına gereksinimini tespit etmek için enzim kaynağı MnCl₂' lü ve MnCl₂' süz (distile su ile) preinkübasyona tabi tutulmuştur. Sonuç olarak MnCl₂' lü preinkübasyon işlemi uygulanan enzim kaynağının MnCl₂' süz preinkübasyona tabi tutulan enzim kaynağından yaklaşık 3 kat daha fazla aktivite gösterdiği tespit edilmiştir (Şekil 6).

8- Sığır Dalak Doku Arginaz Aktivitesinin L-Arginin Konsantrasyonuna Bağlı Değişimi: 0-50 mM L- arginin konsantrasyonlarında enzimin substratına olan ilgisi çalışılmış ve Michaelis-Menten grafiği ile incelenmiştir (Şekil 7). Reaksiyon hızı başlangıçta 3 mM' a kadar lineerlik gösterirken (1.mertebe kinetiği), daha sonra hiperbolik bir görünüm kazanmış (karışık mertebe kinetiği) ve sonunda enzim 25 mM konsantrasyonda doygunluğa ulaşarak reaksiyon sabit hızla devam etmiştir (sıfır mertebe kinetiği). Sığır dalak doku arginazının substratına bağlı değişimi Lineweaver-Burk grafiği ile değerlendirilmiş ve Km' i 5 mM olarak tespit edilmiştir (Şekil 8).

Tartışma

Enzimlerin genel yapısı protein kaynaklı olması nedeniyle ısıya dayanıklı değillerdir. Maksimum aktivite gösterdiği ısının üstüne çıktığı zaman enzim aktivitesi düşmektedir. Sığır dalak doku arginazı için preinkübasyon ısısı 62 ºC, zamanı ise 15 dakika olarak bulunmuştur. Colombo ve Konarska[12] 55 ºC' de 20 dakikalık bir preinkübasyonun karaciğer arginaz aktivitesini 4-5 kat eritrosit arginaz aktivitesinin ise 2-6 kat arttığını saptamışlardır.

Preinkübasyon ısısı ve zamanı değişik hayvan ve dokularda incelenmiş koyun meme doku arginazı için 52 ºC' de 12 dakika[3], koyun gözü vitreusu için 40 ºC' de 9-10 dakika[7], insan tükürüğü için 55ºC' de 20 dakika[8], tiroid dokusu için 55 ºC' de 12 dakika[6], sığır rumen doku arginazı için 60 ºC' de 5 dakika[4], rat karaciğeri için 68 ºC' de 12 dakika[13] olarak tespit edilmiştir.

Sığır dalak doku arginaz aktivitesinin inkübasyona bağlı değişimi incelendiğinde 10 dakikaya kadar lineer bir artış görülürken, 10 dakikadan sonra lineerliğin bozulduğu saptanmıştır. Yapılan çalışmalarda farklı dokular için değişik inkübasyon süreleri: insan tiroid arginazı için 30 dakika[6], rat karaciğeri için 20 dakika[13], koyun gözü vitreusu için 10 dakika[7], sığır rumen doku arginazı için 13 dakika[4], insan karaciğer ve uterusu için 20 dk[14], koyun meme doku arginazı için 15 dakika[3] olarak tespit edilmiştir.

Metal iyonları bir dokudaki enzimi aktive ederken diğer dokudaki enzimi inhibe edebilmektedir. Spektor ve ark.[15], yetişkin ve fötal insanın karaciğer, eritrosit, böbrek, beyin ve gastrointestinal sistem dokularında Mn⁺²'> Co⁺² > Mg⁺² iyonları arginazı aktive ederken Ca⁺²' un inhibe ettiğini ortaya koymuşlardır. Sığır rumen dokusunda Mn⁺², Ni⁺², Cd⁺², Co⁺²' nın enzimi aktive ettiği, Hg⁺²', Sn⁺², Zn⁺², Ag⁺², Cu⁺², Pb⁺², Fe⁺³ iyonları varlığında ise hiç aktivite görülmediği bildirilmiştir[4]. Koyun meme dokusunda en yüksek enzim aktivitesi Mn⁺²' varlığında elde edilmiş, Cd⁺², Ni⁺², Ca⁺², Mg⁺², Ba⁺², Cu⁺², Fe⁺³ varlığında enzim aktive olmuş, Sn⁺², Pb⁺² ve Cr⁺³ iyonları varlığında enzim hiç aktivite göstermemiştir[3]. Bu çalışmada da sığır dalak doku arginaz aktivitesi üzerine en etkili metal iyonu Mn⁺² olarak tespit edilmiş, daha sonra sırasıyla Ni⁺², Co⁺², Cd⁺², Li⁺¹, K⁺¹, Al⁺³, Fe⁺³, Zn⁺², Ba⁺², Hg⁺² ve Mg⁺² metal iyonlarının enzim aktivitesini artırdığı saptanmıştır. Mo⁺⁶, Ca⁺², Cu⁺², Cr⁺³, Sn⁺² ve Na⁺¹ metal iyonlarının varlığında enzim aktivitesinde azalma görülürken, Pb⁺² ve Ag⁺² varlığında ise enzim hiç aktivite göstermemiştir.

Arginazın tetramerik bir yapıya sahip olduğu ve tetramerik yapının oluşması için Mn⁺² katyonlarının gerekli olduğu Muszynska[16] tarafından belirtilmiştir. Mn⁺² iyonlarının enzime bağlanması ısıya dayanıklılığı artırmakta ve enzimin inaktivasyonlara karşı daha dayanıklı hale gelmesini sağlamaktadır[17]. Yapılan çalışmalarda farklı dokular için Mn⁺² konsantrasyonları farklı olup rat karaciğeri için 2 mM[13], M. Benedeni arginazı için 0.5 mM[5], koyun meme doku arginazı için 0.75 mM[3], insan karaciğeri için 2 mM[12] , koyun gözü vitreusu[7] ve insan tükürüğü için 5 mM[8], sığır rumen doku arginazı için 2 mM[4], insan karaciğer ve eritrositi için 2.5 mM[14] olarak tespit edilmiştir.

Özçelik ve Özdemir[3] preinkübasyon ortamına Mn+2 iyonları ilavesinin enzim aktivitesini artırdığı belirtmektedirler. Bu çalışmada da araştırmacıların[3] bulgularına paralel olarak preinkübasyon ortamına Mn+2 iyonları ilavesinin dalak doku arginaz enzim aktivitesini üç kat arttırdığı saptanmıştır.

Arginaz enzimi üzerine yapılan çalışmalarda farklı tampon sistemleri kullanılmıştır[3,4,6,12,13,18]. Bu nedenle araştırmamızda uygun tampon seçimi ve optimal pH araştırılmış, enzim aktivitesi için karbonat tamponunun ve pH 9.7' nin uygun olduğu saptanmıştır. Colombo ve ark[12]. karaciğer ve eritrosit arginazı için karbonat tampon (pH 9.5) sistemini kullanmışlardır. Koyun meme doku arginazı için en uygun tamponun karbonat tamponu(pH 9.5)[3], koyun gözü vitreusu için Glisin-NaOH tamponu (pH 8.8)[7], rat karaciğeri için karbonat tamponu (pH 10.1-10.2)[13], Moniezia expensa arginazı için karbonat tamponu (pH 9.5)[18], sığır rumen doku arginazı için ise karbonat tamponu (pH 10)[4] olduğu saptanmıştır.

Sığır dalak doku arginazının L- arginine karşı Km değeri Michaelis-Menten ve Lineweaver-Burk eğrileri ile araştırılmış ve 5 mM olarak bulunmuştur. Değişik çalışmalarda Km değerleri: M. Benedeni arginazı için 12.5 mM[5], sığır rumen doku arginazı için 4 mM[4], insanlar üzerinde yapılan çalışmalarda eritrosit için 3.2 mM, karaciğer için 4.1 mM, uterus için 5.9 mM[14], tiroid için 2 mM[6] ve vitreus sıvısı arginazı için 6 mM olarak bildirilmiştir[7].

Sığır dalak dokusunun bazı kinetik özelikleri ilk kez laboratuvarımızda optimize edilerek değerler tespit edilmiştir. Bu verilerin konu ile ilgili daha sonraki çalışmalara ışık tutacağı kanaatindeyiz.

References

1. Jackson JM., Beaudet AL., O' Brien WE.: Mammalian urea cycle enzymes. Ann. Rev. Genet. 1986; 20: 431-464.
2. Aminleri M., Vaseghi T.: Arginase Distribution in Tissue of Domestic Animals. Comp Biochem Physiol 1992;103: 385-389.
3. Özçelik M., Özdemir N.: Koyun Meme Doku Arginazının Bazı Biyokimyasal Özellikleri. Turk J. Vet. Anim. Sci. 2003; 27: 719-725.
4. Erişir M.: Sığır Rumen Doku Arginazının Bazı Biyokimyasal Özellikleri. Doktora Tezi, Elazığ: Fırat Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, 1997.
5. Özdemir N., : M. Benedeni Arginazının Bazı Özellikleri. Doktora Tezi, Elazığ: Fırat Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, 1990.
6. İlhan N.: İnsan Tiroid Doku Arginazının Kinetik Özellikleri. Doktora Tezi, Elazığ: Fırat Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, 1992.
7. Gürsu M.F. Çeşitli Türlerin Humor Vitreuslarında Üre ve KaynaklarınınAraştırılması. Doktora Tezi, Elazığ: Fırat Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, 1993.
8. Konarska L, Tomaszewski L, Colombo JP, Terheggen HG. Human salivary arginase and its deficiency in argininaemia. J Clin Chem Clin Biochem. 1985; 23(6): 337-42.
9. Geyer J.W., Dabich D.: Rapid Method for Determination of Arginase Activity in Tissue Homogenates. Anal. Biochem. 1971; 39: 412-417.
10. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., and Randall R.J.: Protein Measurements with the Folin Phenol Reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193:265-275.
11. Mohammed S. M., Greenberg D.M.: Liver Arginase I. Preperation of Extracts of High Potency, Chemical Properties, Activation, İnhibition and pH Activity. Arch. Biochem. Biophys. 1945; 8: 349-357.
12. Colombo J., P., Konarska L.: Arginase; In : Bergmayer Grabı M. (Eds). Methods of enzymatic analysis. 3 rd Ed.Weinheim Vertag Chemie. 1984: 285-294.
13. Erisir M., Ercel E., Yılmaz S., Ozan S.:Evaluation of optimal conditions for arginase activity in streptozotocin induced diabetic rats. Vet. Med. – Czech, 50, 2005; (2): 69–76.
14. Halifeoğlu İ.: İnsan Karaciğer, Eritrosit ve Uterus Doku Arginazının Kinetik Özellikleri. Doktora Tezi, Elazığ: Fırat Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü., 1993.
15. Spector E.B., Rice S.C.H., Moedjono S., Bernard B., Cederbaum S.D.: Biochemical Properties of Arginase İn Human Adult and Fetal Tissues. Biochem. Med. 1982; 28: 165-175.
16. Muszynska G. Immobilization of rat liver arginase. C.I Biospecific Chromatography. Protides of the Biological Fluids 23 RD. Colloguim. Oxford and New York. Pergamon Press, 1976: 633-637.
17. lhan N, Gülen Ş: Tiroid Arginaz Enzim Aktivitesinin Farklı Metal İyonları Varlığında Isıya Karşı Stabilitesi. Biyokimya Dergisi 1993; 18: 59-67.
18. Ozan S., Gürsu M.F., Gülen Ş.: Kısmen Arıtılmış Moniezia Expensa Arginazının Bazı Özellikleri. Tr. J. Vet. Anim. Sci. 1993; 17:245-250.