Veteriner Aşı ve Biyolojik Maddelerin Kalite Kontrollerinde Alternatif Metotlar

Son yıllarda veteriner aşı ve biyolojik maddelerin kalite kontrollerinde deneme hayvanı sayısının azaltılmasına yönelik geliştirilen alternatif yöntemlerin etkin olarak geliştirilmesi sonucunda, daha az sayıda deneme hayvanı kullanılarak daha etkin sonuçlara ulaşılmıştır. Bu sonuçların doğrultusunda hem üretilen aşı ve biyolojik maddelerin kalitesi daha iyi sorgulanmış hem de etik anlamda kullanılan deneme hayvanı sayısında önemli miktarlarda azalma sağlanmıştır.

Recent years, as a result of the alternative methods developed in quality control of veterinary vaccines and biological products, using less experimental animals, more effective outcomes has been provided. From these results, the quality of the vaccines and biological products were investigated better, and the number of experimental animals used ethically.

Giriş

Hayvan deneylerinin yerine geçen, kullanılan hayvan sayısını veya hayvanların çektiği acıyı azaltan uygulamalar alternatif yöntemler olarak değerlendirilmektedir. Alternatif yöntemlerin geçerliliğinin bilim adamlarınca kabul görmesi çok kısa bir süre önce olmasına rağmen, birkaç alternatif yöntem şu an hâlihazırda kullanılmaktadır. Aşı kontrolünde en sık olarak kullanılan alternatif metotlar in-vitro (doku kültürü) ve analitikal (immunokimyasal, fizikokimyasal v.b.) metotlardır[1].

1. Veteriner Sahada Kullanılan Aşıların Kalite Kontrolünde Alternatif Uygulamalar
1-1. Bakteriyel Aşılar
1.1.1. Sporlu Anthrax Aşısı
Avrupa farmakopi monograflarında sporlu anthraks aşısının potens testleri için 13 kobay veya tavşan veya da 8 koyun kullanılmasını şart koşmuştur. Weisser ve Hechler, önerilen bu koşulun yalnızca lisans alım sürecinde uygulanmasının yeterli olduğunu önermektedir. Araştırmacılar, lisans alım sürecindeki bu çalışmalar ışığı altında in vitro canlı spor sayısı ile sayımı yapılan aşının hedef hayvan üstünde oluşturacağı bağışıklık arasında kurulacak bir korelasyonun bizlere bağışıklık gücünü anlamada yeterli olacağını saptamışlardır[2].

1.1.2. Brucella Aşısı
Yapılan test aşı suşunun organizmadaki beklenen periyodunu ortaya koymasına dayalıdır. Bakteri intrasellüler olarak yerleşir ve hücresel bir immun yanıt oluşturur. Aşının kalite kontrol denemelerinde 32 adet fare derialtı yolla aşılanır ve belli bir süreçten sonra hayvanların dalaklarından yapılan ekimde Brucella bakterileri tespiti yapılmaktadır. Bu teste alternatif bir yöntem henüz tespit edilememiştir. Weisser ve Hechler, bu denemelerin yalnızca lisans sürecinde yapılmasını önermektedir[2].

1.1.3. Balık Aşıları
Avrupa Farmakopisinde balık aşıları hakkında 3 adet monograf bulunmaktadır. Bunlar Furunkulozis aşısı, Vibriozis (soğuk su) ve Vibriozis aşıları hakkındadır. Bu monograflar güvenlik testleri için 10, çelınç testleri için 60 ve serolojik testler için ise 35 balığın kullanılmasını öngörmektedir. Farmakopi yönergelerinde özel durumlar haricinde veya inaktif balık aşılarının güvenlik testlerinde 30 balığın deneme hayvanı olarak kullanımını savunmaktadır[3].

Wagner ve arkadaşları tarafından Furunkulozis aşısının çelınç testlerinde kullanılan metoda alternatif olarak sandviç-ELISA yöntemi ile koruyucu antikorların tespiti yapılmıştır[4]. Pund ve arkadaşları ise Aeromanas salmonicida’nın aşılanmış ve aşılanmamış balıklardaki lenfositlerden izolasyonunun karşılaştırılmalı kıyaslaması yoluyla sonuca ulaşılmasını önermişlerdir[5].

1.1.4 Klostridial Aşılar
Veteriner hekimliğinde kullanılan Clostridium aşıları genellikle çok komponentli toksoid aşılardır. Temel yapı taşları C. tetani, C. perfingens Tip B, C ve D, C. septicum, C. chauvoei ve C. novyi Tip B dir. Bu kompenentlerin her biri için hayvan deneyleri uygulamalarını içeren Avrupa Farmakopisinin uygun monograflarına göre kalite kontrolleri mevcuttur. Fareler ve kobaylardaki bu enfeksiyon ve intoksikasyon modelleri ki bunlar acılı, ağrılı ve sonuç olarak ta hayvanların en az % 50’sinin ölümlerine neden olurlar, hem hayvanları koruma kanunları hem de in vitro metotların gelişimleri yönünden sorgulanmalıdırlar.

Bu metotlara alternatif olarak hem immuno hem de hücre kültürü yöntemleri önerilmektedir.

1.1.4.1.Tetanoz Aşısı
Tetanoz aşısının bağışıklık denemeleri fare ve kobaylarda çelınç testi prosedürüne dayalı olarak yürütülmektedir. Bu yöntemde kısaca, ilk olarak kullanılan hayvanlar denemede kullanılacak olan aşının seri dilüsyonları ve referans tetanus aşısı kullanılarak immunize edilirler. İmmunizasyondan 4 hafta sonra tüm hayvanlar tetanus toksini ile çelınç (TNT testi) işlemine tabi tutulurlar ve 5 gün süre ile oluşan felçler gözlemlenir. Beş günlük süre sonunda teste tabi tutulan seri hakkında bir karara varılır. Testte kullanılan hayvanların % 50 kadarı çeşitli felç olaylarını takiben acı çekerek ölmektedirler. Yakın geçmişte bu denemeye alternatif olarak 2 farklı serolojik test yöntemi tanımlanmıştır. Bunlardan biri ELISA, diğeri ise Toxin Binding Inhibition (ToBI) testidir. Her ne kadar bu testlerde de hayvanlar kullanılmaya devam ediyorsa da sadece immunizasyon aşaması gerçekleştirilip kanları alınıyor ve daha sonrada bu kan serumlarında in vitro serum titrasyonlarına bakılıyor. Bu araştırmaların validasyon çalışmalarına Avrupa Farmakopi Komisyonu ve ECVAM tarafından 1992-1993 yıllarında başlanılmıştır. Çalışmada geniş bir laboratuvar ağı kullanılmıştır. Çalışma sonuçları 2000 yılı aralık ayı içerisinde tamamlanmıştır. Çalışma sonuçları Tetanoz aşısı kontrollerinde yapılan in vivo TNT testi yerine 2 faklı serolojik testin kullanılabileceğini ispatlamıştır[6,7]. Avrupa Farmakopisi şu anda her iki metodu da yayınlamış ve kullanıma sunmuştur. Bu metodların kullanıma geçişiyle birlikte 3 R prensiplerine uyumda kendiliğinden oluşmaktadır. İlk olarak hayvanların çelınç uygulamalarında çektikleri ağrı ve ızdırap oldukça azaltılmıştır. İkinci olarak da her iki serolojik testinde kullanıma girmesiyle birlikte kullanılan hayvan sayısında % 70 dolaylarında azalma gözlemlenmiştir.

1.1.4.2. Diğer Klostridial Aşılar
C. botulinum, C. novyi, C. perfingens, ve C. septicum aşılarının güvenlik kontrolleri için Avrupa farmakopisi tarafından yayınlanan monograflardaki prensip residual toksisitenin tespitine dayanmaktadır. C. perfingens ve C. novyi içeren aşıların değerliliği, toksoidlere karşı gelişen antitoksin içeriği tavşanlarda oluşan koruyucu antikorların miktarı ile tespit edilmektedir. Bu miktarın tespiti için kantitatif olarak farelerde TN (Toksin nötralizasyon) testi yapılmaktadır.

Costridial aşıların ve immunserumların bağışıklık testleri için hayvanlar üzerinde uzun zaman ağrılı, acı veren denemeler yürütülmüştür. 1997 yılında Strasbourg’da EDQM tarafından organize edilen ve PEI ve RIVM katılımları ile yürütülen bir sempozyum organize edilmiştir[8]. Aynı yıl Klostridial aşıların kontrolü için 4 monografta revizyona gidilmesi önerilmiştir. Bu öneriler fare nötralizasyon testleri yerine validasyonu tamamlanan immunkimyasallar metodu ve C. novyi, C. perfingens ve C. septicum aşılarının toksin nötralizasyon testlerinin hücre kültüründe yürütülmesi hakkındadır. Revize edilen monograflar Avrupa Farmakopisi 2001 eklerinde yürürlüğe girmiştir. Aynı zamanda bu ve benzeri birçok alternatif metot geliştirilmeye çalışılmaktadır.

C. perfingens ve C. novyi içeren aşıların değerliliği, toksoidlere karşı gelişen antitoksin içeriği tavşanlarda oluşan koruyucu antikorların miktarı ile tespit edilmektedir. Bu miktarın tespiti için geçmiş yıllarda kantitatif olarak farelerde TN (Toksin nötralizasyon) testi yapılmaktaydı. Günümüzde C. novyi ve C. perfingens gibi toksoidlerin tespitinde hücre kültürü metodları kullanılmaktadır. Hücre kültüründe kullanılan MDCK hücre hatları Clostridium perfingens epsilon toksini için, Vero hüre hatları ise C. novyi Tip-B Alfa toksini için spesifik ve duyarlıdır. Bu hücrelerle tavşan kan serumunda hem epsilon hem de alfa toksine karşı oluşan antikorların kantitatif tayini amacı ile tespiti yapılabilmektedir ve gerekli parametrelerin tekrarlanabilirliği de talimatlar ile standardize edilmiştir[9].

Toksin-antiserum karışımının tespiti için biyolojik indikatörü olarak permanent olarak çoğalabilen hücrelerin kullanımı, hayvan deneylerindeki LD50’nin belirlenmesine muhtemel bir alternatif olarak ortaya çıkmaktadır ve bundan dolayı da Clostridium aşılarının etkinlik kontrolleri için uygundurlar[9].

C. chauvoei aşılarının kontrolünde, kobayların kullanıldığı challenge testinde Avrupa Farmakopisinin öngördüğü % 100 koruma oranı Farmakopinin 2001 ekinde değiştirilmiştir. Yeni durumda bağışıklık testi uygulamalarında C. chauvoei’ye karşı geliştirilen koruyucu antijenlerin tespiti yapıldığı için çok daha az sayıda kobay kullanılmaktadır[10-14].

Amerika Birleşik Devletlerindeki otoriteler inaktive aşılardın potens testlerinde antijen ölçümü metodunun kullanılmasına izin vermektedirler fakat buna rağmen klostridial aşılar hakkındaki kanunlar henüz değiştirilmemiştir. Hauer ve Clough, C. chauvoei’nin flagellası, C. sordelli letal toksini, C. perfingens alfa, beta ve epsilon toksinlerine karşı monoklonal antikorların hibridoma hücre hatlarında üretildiğini rapor etmişlerdir. Bu antikorlar, antijen ölçüm çalışmaları veya diğer alternatif çalışmalar amacıyla uluslararası olarak da temin edilebilmektedirler[11,15].

1.1.5. Erysipelas Aşısı
Domuzların inaktif Erysipelas aşısının kontrol teknikleri Avrupa Farmakopisi 2001 ekinde yayınlanan monograf ile değiştirilmiştir. Bu monografla birlikte potens testlerinde multi-dilüsyon aşılama ile kullanılan 100 adet fare yerine tekli dilüsyon aşılama ile 10 adet fare kullanılmaya başlanılmıştır. Son yıllarda çelınç testinin değiştirilmesi konusunda bir çok yeni serolojik model geliştirilmiştir[14,16-18]. PEI tarafından direkt ELISA metodu validasyonları yapılmıştır. Bu metot da 10 fare imuunizasyon için aşılanmakta ve immunizasyon sonucunda farelerden kan alınmaktadır. Daha sonra ELISA metoduyla kandaki Erisipelas antikorları hesaplanmaktadır. Bu yöntem sayesinde bir seri aşının kontrolünde kullanılan fare sayısı 100 den 10’a düşmüştür. Aynı zamanda PEI tarafından ELISA plaklarının kaplanmasında kullanılan referans antijenlerin üretimi de yapılmaktadır[19].

1.1.6. Leptospira Aşıları
Leptospira canicola, L. icterohaemorrhagiae aşılarının potens kontrolleri için Avrupa Farmakopisinde tanımlanan metoda göre Hamster çelınç testi kullanılmaktadır. Bu metotta beş adet hamster test aşısı ile immunize edilir. İmmunizasyon sonucunda 5 deneme ve 5 kontrol hamstere aşıya uygun suş ile challenge testi uygulanır. Test sonucunda kontrol grubu hamster’lardan en az % 80’i enfeksiyondan ötürü ölmelidir.

Hamster çelınç modeli sığırların L. hardjo aşısının kalite kontrollerinde de kullanılmaktadır. Bu model de hayvanlar için biraz daha zordur, çünkü deneme sonunda karaciğerden bakterinin tekrar izolasyonuna gidilmektedir.

Bu tetkiklerin yüksek sayıda hayvan kullanılması ve challenge suşlarınında çok miktarlarda kullanılması gibi dezavantajları da bulunmaktadır. Aynı zamanda insanlar da bu leptospira bakterilerine yüksek hassasiyet taşımaktadırlar. Bu da laboratuvarda çalışan personel açısından önemli bir risk yaratmaktadır[20,2]. Veteriner kullanımdaki Leptospira aşılarının kalite kontrol testlerindeki challenge testlerine alternatif yaklaşımların incelendiği bir çalıştayda[21] serolojik (immunize edilen hayvanların kullanıldığı) ve antijen kuantifikasyon (hayvan kullanımının uygulanmadığı) metotları kullanıma sunulmuştur.

1.2.Viral Aşılar
1.2.1. Kanatlı Viral Aşıları
Avrupa Farmakopisi kanatlı aşıları hakkında 2 genel metin ve 13 tane de monograf ihtiva etmektedir. Bu bildirimlerde hayvanlardaki güvenlik ve potens testleri ve yabancı ajanlar yönünden kontaminasyon tespiti yapılması tanımlanmaktadır. Burada üstünde durulması gereken konu çok sayıda hayvan kullanılması gerektiğidir. Bu amaçla her yıl ortalama 1800 adet aşının kalite kontrol testlerinde 51.000 adet tavuk kullanıldığı saptanmıştır[22].

Günümüzde testlerde kullanılan büyük miktardaki hayvan sayısının Üç R’s yöntemlerinin uygulamaya sokularak azaltılmasını amaçlayan birçok çalışma yapılmaktadır. Bu çalışmaları, yapılan testleri ayrı ayrı değerlendirdiğimizde inceleyecek olursak aşağıdaki gibi sınıflandırabiliriz:

a. Ürünün yabancı ajanlar yönünden kontrolü testleri;
Canlı kanatlı aşıları hakkındaki Avrupa Farmakopi metini 2.6.4’te son ürünün, yabancı ajanlar yönünden kontrolünde, muhtemel kontaminantların aranması amacıyla yumurta, hücre kültürü ve tavukların kullanılması koşulu vardır. Günümüzde en az hayvan testleri kadar güvenilir olan PCR teknikleri de kullanılmaktadır. Bunlardan bazılarının validasyonları tamamlanmış ve kullanıma sunulmuşlardır, bazıları ise henüz geliştirilme aşamasındadırlar.

b. Güvenlik Testleri
Memeli aşılarının güvenlik testlerinde 2 adet hayvan kullanılırken, kanatlı aşılarının güvenlik testlerinde kullanılması gereken 10 adet hayvanın hiçbir bilimsel ve istatistiksel dayanağı bulunmamaktadır.

Bu durumun araştırılması için PEI ve AGAATI tarafından iki adet araştırma yürütülmüştür (Europen Center for the Validation of Alternative Methods - ECVAM tarafından finansmanları sağlanmıştır). Araştırmada aşı üreticilerinin ve kontrol kurumlarının verileri geçmişe yönelik olarak değerlendirilmiştir. Değerlendirme sonucunda son yıllarda denemeye giren aşıların hepsinin bu hayvan denemelerinden geçtiği görülmüştür. Bu sürede sahadan da herhangi bir problemin rapor edilmediği saptanmıştır. Bu sonuçlardan sonra bu HHGT’lerinin kullanımı sorgulanmaya başlanmış ve bu konudaki monografda da HHGT’lerin iptalinin tavsiye edilmesi gerektiği tartışılır duruma gelmiştir. Hedef hayvan güvenlik testlerinin yalnızca ürünlerin lisans alım aşamasında sınırlı bir üretim serisine (kendi içinde tutarlılığı sağlayana kadar) veya üretim aşamalarında herhangi bir değişikliğe gidileceği zaman yapılması gerektiği savunulmaktadır[22].

c. Potens Testleri
Canlı kanatlı aşılarının potens testlerinde bir seri kontrolünün temsilinin yeterli kabul edilmesinin aksine inaktive kanatlı aşılarında her seriye potens testi uygulanması zorunluluğu vardır. Bu da çok sayıda hayvanın kullanılması ve zarar görmesi anlamına gelmektedir. Bundan dolayı da birçok aşının potens kontrolünde serolojik yöntemler yardımı ile immunizasyon sonrası antikor tespitinin hesaplanmasına gidilmektedir. Son yıllarda antijen miktarı hesaplanmasını temel alan ve hayvan kullanımını gerektirmeyen in vitro metotlar geliştirilmeye başlanmıştır. İnaktif Newcastle hastalığı (ND) aşısının potens kontrolünde bu yol ile önemli başarı sağlanmıştır[23,24]. Bu teknik aşılamadan sonra kanda üretimi olan ND antijenlerinin (HN-proteini ve F-proteini) ölçümü temeline dayanmaktadır. Bu ölçüm metodu için iki ayrı ELISA prosüdürü geliştirilmiştir. Bu metodlarla aşıdaki virus titresi ile aşılamadan sonra immunize serum arasında çok iyi bir korelasyon olduğu tespit edilmiştir. Denemeler her iki metodun da tekrarlanabilirliğini ve hassalığını ortaya koymuştur[24].

İnaktif Bursal Diseases aşısı içinde aynı şekilde immunizasyondan sonraki antijen titresinin hesaplanması temeline dayalı bir metot geliştirilme aşamasındadır.

1.2.2. Şap Aşısı (Foot and Mouth Disease)
Güvenlik
Avrupa farmakopisinde Şap aşısının güvenlik kriterleri için kullanılan virus hatlarının yeterli inaktivasyonu şart koşulmuştur. Bu durumun test edilebilmesi için yeterli hassasiyet hücre kültürü tekniklerinde bulunmaktadır[25].

Potens
Şap aşısının potens testleri multi-dilüsyon aşılaması ile çelınç uygulamasına tabi tutulan 17 sığırda yürütülmektedir. Bu sayının indirilebilmesi için çelınç testinde tekli dilüsyon kullanılabilir. Weisser ve Hechler tarafından alternatif bir metot geliştirilmiş fakat henüz valide edilmemiştir[2]. En uygun alternatif yöntemler antijen hesaplanması temeline dayanan metot[26,27,28] veya Sandviç ELISA yöntemi ile aşılanmış hayvanların kan serumlarındaki Şap aşısına karşı oluşan antikorların hesaplanmasına dayanan metot[29] ya da BHK21-CT hücre hattında plak azaltma yöntemidir[30].

1.2.3. Kuduz Aşısı
1.2.3.1. İnaktif Kuduz Aşısı
İnaktif Kuduz aşısı kontrollerinde Avrupa Farmakopisi monograflarına göre kuduz virusunun inaktive olup olmadığı, 10 adet fareye aşının beyin içi enjeksiyonu yapılıp hayvanların gösterecek olduğu semptomların takibine dayalı olarak yapılmaktadır. Bu testin hassaslığı konusunda bazı şüpheler yer almaktadır[31,2]. Günümüzde aşı üreticileri inaktivasyon periyodunu adjuvantın katımından hemen sonra yürütmektedirler ve yeni geliştirilen in vitro metotlar yardımı ile de bu aşamadan sonra aktif kuduz virüslerinin tespiti yapılabilmektedir[32,33]. Yeni geliştirilen bu metotlar yardımıyla da son ürün üzerinde farelere beyin içi enjeksiyon yapılması ile yürütülen inaktivasyon testleri de terk edilebilmektedir.

Potens testleri
Avrupa Farmakopisi monograflarında RFFIT testi ile kuduz antikorlarının tespiti ve ELISA testi ile in vitro antijen hesaplanması tekniklerine izin verilmiştir. Bununla birlikte uygulanan bu testlere paralel olarak NIH (National Institute for Health) tarafından tanımlanan testler de yapılabilir.

1.2.3.2. Canlı Kuduz Aşısı
Potens
Canlı kuduz aşıları tilkiler için kullanılmaktadır. Aşının potens tespiti için amacı ile 25 adet tilki immunizasyon amacı ile aşılanmaktadır. İmmunizasyon aşaması sonrasında aşılı grup ve 10 adet aşısız kontrol grubu hayvan kuduz virusu ile challenge işlemine tabi tutulurlar. Bu teste alternatif bir yöntem henüz tanımlanamamıştır. Weisser ve Hechler yaptıkları istatiksel çalışmalar sonucunda deneme grubu için 15, kontrol grubu içinde 5 adet hayvan kullanılmasının yeterli olacağını bildirmektedirler[2].

Avrupa Farmakopisi, üretilen serilerin kontrollerinde belli bir tutarlılığın sağlanmasından sora rutin yapılan potens testlerinin atlanmasına izin vermiştir.

Sonuç
Günümüzde hayvan deneylerine alternatif teşkil edebilecek olan doku kültürleri, bilgisayar teknolojisi, immunolojik teknikler ve kimyasal yöntemler hızla gelişmektedir. Moleküler biyoloji alanındaki gelişmeler ile, örneğin, DNA çip teknolojisi sayesinde belirli hastalıklarda hangi genlerin rol oynadığını hakkındaki spesifik bilgiye ulaşılabilmektedir. Bu alanda kısmende olsa hayvan kullanılmamaktadır.

Son yıllarda Hayvan deneylerine alternatif uygulamalar tüm dünya da yaygın olarak kullanıma geçmiştir. Bunun en onemli örneklerinden biri de güçlü bir biyolojik madde üreticisi olan Çin’de görülmektedir. Çin Farmakopisinin 2005 yılı baskısı ile üretilmekte olan 139 çeşit ilaç ve biyolojik maddenin kalite kontrollerinde pirojen maddelerin tespiti için çok sayıda tavşan kullanımı yerine LAL testine geçilmesi uygun görülmüştür[34].

Ayrıca Aşı ve biyolojik maddelerin üretiminde kullanılan tekniklerde standardizasyonun sağlanması ve GMP uygulamalarının benimsenmesi de kulanilan deneme hayvani sayılarında önemli bir azalmaya sebebiyet vermektedir[1].

Aynı zamanda Avrupa birliği yönetmeliklerinin ve sıklıkla bu konuda yayınlanan birlik çalışma kılavuzlarının da aşı ve biyolojik madde kalite kontrollerinin yapıldığı laboratuarlarca takip edilmesi ve ortak yapılan çalışmalara katılınmasi, kendisini kanıtlamış referans laboratuarlar tarafından yapılan testlerin aşının satışa sunulacağı diğer ülkeler tarafından kabulünün sağlanması yolu ile de testlerin her ülke tarafından tekrar yapılmasının önüne geçilerek kullanılan deneme hayvanı sayısının azaltılması öngörülmektedir[35,36].

Bir diğer değerlendirme ise üretilen seriler arası tutarlılığın biyoanalitik ve diğer test yöntemleri ile ortaya konularak zaman içerisinde her seriye uygulanan testlerin sıklığının azaltılma yoluna gidilmesidir[37].

Hayvan deneylerinin gelecekte de gerekli olacağı beklenilmektedir. Fakat hayvan deneylerinin amacı; temel araştırma olarak veri üretmekten ziyade, in vitro deneylerden sağlanan verilerin doğrulanması için olacaktır.

References

1. de Mattia F, Chapsal JM, Descamps J et al. The Consistency approach for quality control of vaccines – A strategy to improve quality control and implement 3Rs. Biologicals 2011; (39): 59-65.
2. Weisser K, Hechler U. Animal welfare aspects. In: the quality control of immunobiologicals. A critical evaluation of animal tests in pharmacopoeial monographs. Published by FRAME, Nottingham, UK for ECVAM and the Paul-Ehrlich-Institute. 1997.
3. EU. The rules governing medicinal products in the European Union. Eudralex: 1999; http://dg3.eudra. org/eudralex/download.htm
4. Wagner U, Hädge D, Lachmann I, Drössler K. Development of an ELISA-system for the assessment of furunculosis vaccine (German). ALTEX 15 Supplement, 1998; 79-82.
5. Pund RP, Nold K. Henrion E. [Testing fish vaccines with an in vitro lymphocyte blastogenesis assay (German)]. ALTEX 15 Supple¬ment, 1998; 75-79.
6. Council of Europe, Tetanus vaccine for veterinary use. Pharmeuropa 8, 1996; 238-240.
7. Hendriksen CFM, Woltjes J, Akkermans AM, van der Gun JW, Marsman FR, Verschure MH & Veldman K. Interlaboratory validation of in vitro serological assay systems to assess the potency of tetanus toxoid in vaccines for veterinary use. Biologicals 1994; 22: 257-268.
8. Council of Europe, Alternative potency testing and other possible re¬lated quality issue for clostridial vac¬cines. Proceedings of the symposium on veterinary clostridial vaccines. 4-6 February 1997, Strasbourg, France. Pharmeuropa Special Issue, 1997; BIO 97-1, pp. 88. Strasbourg: Council of Europe
9. Borrmann E, Schulze F, Diller R. Entwicklung von in vitro Methoden zur Wirksamkeitsprüfung von Clostridien-Impfstoffen. ALTEX 2001; 18: 34-36.
10. Hauer PJ, Clough NE. Development of monoclonal anti¬bodies suitable for use in antigen quantification potency tests for clostridial veterinary vaccines. In: Brown F, Hendriksen CFM, Sesardic D. (Editors), Alternatives to animals in the development and control of biological products for human and veterinary use (85-94). Developments in Biological Standardization, Basel: S. Karger AG, 1999; 101.
11. Hauer PJ. Viewpoint from the USA authorities. Recent development on different clostridiae. Pharmeuropa Special Issue, 1997; BIO 97-1, 47-58.
12. Kijima-Tanaka, M, Ogikubo Y, Kojima S. Flagella based enzymelinked immunosorbent assay for evaluation the immunity in mice vac¬cinated with blackleg vaccines. Journal of Microbiological Methods 1998; 32: 79-85.
13. Redhead K, Lucken R, van de Moer A. Veterinary Vaccines: In-VITRO – International Veterinary Industry Test Replacement Organisa¬tion. In: Brown F, Hendriksen CFM, Sesardic D. (Editors), Alternatives to animals in the development and control of biological products for hu¬man and veterinary use (261-266). Developments in Biological Standard¬ization, Basel: S. Karger AG, 1999; 101.
14. Rosskopf-Streicher U, Johannes S, Hausleithner D. Suit¬ability of an ELISA for the batch potency testing of erysipelas vaccines. Pharmeuropa Special Issue, 1998; BIO 98-1, 65-70.
15. Roth F, Seifert, HSH. De¬velopment of in vitro methods for the potency testing of blackleg vaccines based on soluble and cellular antigens of C. chauvoie. Pharmeuropa Special Issue, 1997; BIO 97-1, 21-29.
16. Beckmann R, Cussler K. Wirksamkeitsprüfung von Rotlauf¬impfstoffen an der Labormaus. ELISA kontra Infektionsversuch. ALTEX Sup¬plement 1994; 1, 39-45.
17. Redhead K. Preparation of an in¬house reference vaccine: results of in vitro studies in pigs. Pharmeuropa Special Issue, 1998; BIO 98-1, 50-55.
18. Rosskopf-Streicher U, Johannes S, Wilhelm M, Cussler K. Quality control of inactivated ery¬sipelas vaccines: results of an interna¬tional collaborative study to establish a new regulatory test. Vaccine 2001; 19: 1477¬-1483.
19. Rosskopf-Streicher U, Johannes S, Wilhelm M. Potency testing of swine erysipeals vaccines by serology - results of a prevalidation study. ALTEX1999; 16: 123-128.
20. Marbehant P. Leptospiral vac¬cines batch potency testing. European monograph status review. Pharmeuro¬pa Special Issue, 1999; BIO 99-2, 11-16.
21. Council of Europe, Alternatives to animal challenge tests in the batch control of Leptospira vaccines for veterinary use. Pharmeuropa Special Issue, 1999; BIO 99-2, pp. 135. Strasbourg: Council of Europe
22. Bruckner L, Bongers J, Castle P, ve ark. Three Rs approaches to the production and quality control of avian vaccines. The Report and Recommen¬dations of ECVAM Workshop 41. ATLA 2000; 28, 241-258.
23. Maas RA, Oei HL, Kemper S. The use of homologous virus in the haemagglutination-inhibition assay after vaccination with Newcastle disease virus strain La Sota or clone 30 leads to an overestimation of pro¬tective serum antibody titers. Avian Pathology 1998; 27, 625-631.
24. Maas R, de Winter M, Koch G. Development of an in vitro potency test for inactivated newcastle disease vaccines. In Balls M, van Zeller AM, Halder ME. (Editors), Progress in the Reduction, Refinement and Replacement of Animal Experimentation Amster¬dam: Elsevier Science B.V. 2000; 959-967.
25. Anderson EC, Capsick PB, Mowat GN, Leech FB. In vitro method for the safety testing of foot-and-mouth disease vaccines. J Hyg Camb 1970; 68: 159-17.
26. Black L, Rweyemamu MM, Boge A. Revaccination response of cattle as a function of the 140S foot-and-mouth disease antigen. Journal of Comparative Pathology 1984; 94: 417-424.
27. Pay TWF, Hingley PJ. Correlation of 140S antigen dose with the serum neutralising antibody response and the level of protection induced in cattle by foot-and-mouth disease vaccines. Vaccine 1987; 5: 60-64.
28. Rweyemamu MM, Black L, Boge A. The relationship between the 140S antigen dose in aqueous foot-and-mouth diesease vaccines and the serum antibody response of cattle. Journal of Biological Standardization 1984; 12, 111-120.
29. Hamblin C, Barnett ITR, Crowther JR. A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus). Journal of Immunological Methods 1986; 93: 123-129.
30. Thalmann G, Nöckler A, Felfe P, Kreienbrink G. Erarbeitung und Einsatz von Laborverfahren zur Wirksamkeitsprüfung von Maul-und-Klauenseuche-Vakzinen für Rind und Schwein. Archives of Experimental Veterinary Medicine 1987; 41: 806-811.
31. Hendriksen CFM. Opportunities for replacement, reduction or refinement: Veterinary vaccines for mammals. In: Hendriksen CFM. (Editor), Laboratory Animals in Vaccine Production and Control, Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1988; 125-139.
32. Blum SAE, Braunschweiger M, Krämer B. ve ark. Proof of complete virus inactivation in rabies vaccines by either intracerebral injec¬tion of mice or fluorescent antibody technique (FAT) – a quantitative com¬parison. In: Brown F, Hend¬riksen CFM, Sesardic D. (Editors), Alterna¬tives to animals in the development and control of biological products for human and veterinary use (302). De¬velopments in Biological Standardiza¬tion, Basel: S. Karger AG, 1999; 101.
33. Ullrich L. Ersatzmethoden in der Diagnostik. In Tierlaboratorium Tierlaboratorien Zentrale, Institut für Tierschutz, Verhaltenslehre und Versuchstierkunde der Freien Universität Berlin. Berlin: Uni¬versitätsdruckerei 1993; 107-119.
34. Zhengming HE. Alternetive methods for animal tests in the quality control of biologicals products of China. AATEXS 2007, 14, Special Issue, 591-593.
35. Brown F, Hendriksen C, Sesardic D, Cussler K, editors. Advancing science and elimination of the use of laboratory animals for development and control of vaccines and hormones. Dev Biologicals, Basel: S. Karger AG, 2002; vol. 111.
36. Hendriksen CFM. Replacement, reduction and refinement alternatives to animal use in vaccine potency measurement. Expert Rev Vaccines 2009; 8: 313-322.
37. Metz B, Jiskoot W, Hennink WE, Crommelin DJ, Kersten GFM. Physicochemical and immunochemical techniques predict the quality of diphtheria toxoid vaccines. Vaccine 2003;12: 156-167.