Yapılan çalışmada, vajinal yöntemle çözdürülen dondurulmuş boğa spermalarında sıcak suda çözdürülen örneklere göre çözdürme sonrası ortalama statik (ölü) spermatozoon oranının önemli derecede arttığı gözlenirken, buna uyumlu olarak ortalama total motilite değerinin de önemli derecede azaldığı (%67.8 - %81.0; P<0.05) belirlenmiştir. Bununla birlikte, çözdürme sonrası ortalama progresif motilite değeri açısından kullanılan iki yöntem arasında istatistiki yönden önemli derecede bir farklılık oluşmadığı (%48.2 - %50.9; P>0.05) dikkati çekmiştir. Dondurulmuş sperma payetlerinin çözdürme sonrası kalite standartlarını tespit etmek için motilite oranlarının belirlenmesi oldukça önemlidir. Spermanın motilitesinin belirlenmesinin temel amacı; spermatozoon hareket çeşitleri ve bunların kapsadığı oranları tespit etmektir. Spermatozoonlar hareket çeşitlerine göre genel olarak 5 grup altında incelenirler. Bunlar; herhangi bir yönde hızlı ve güçlü hareket eden (progresif), herhangi bir yönde ama yavaş hareket eden, yerinde sallanan, kendi ekseni etrafında dönme şeklinde hareket eden ve hareketsiz (ölü/statik) olan spermatozoonlardır. Total motilite oranı; muayene yapılan spermada hangi oranda hareketli ya da hareketsiz spermatozoon bulunduğunun bir göstergesidir. Ancak bu oran içerisinde çok yavaş ilerleyen, kendi etrafında dönen veya olduğu yerde titreme ya da sallanma hareketi yapan spermatozoonların hareketlerinde doğrusallık özelliği olmadığı için hızlı hareket etseler bile fertilite yetenekleri düşüktür. Bu yüzden, yapılan muayenelerde total motilitenin yanında progresif spermatozoon oranın da belirlenmesi oldukça önemlidir
1,21. Progresif motilite, spermatozoonun dişi üreme kanalındaki ileriye doğrusal hareketi için gerekli olup aynı zamanda fertiliteyle de önemli derecede ilişkilidir. Bu yüzden, motilite belirlenirken, total motiliteye göre özellikle progresif motilite oranı daha belirleyici bir rol oynamakta olup CASA sistemi ile yapılan analizlerde progresif motilitenin %35’in üzerinde olması gerektiği vurgulanmaktadır
5,25. Ayrıca Ülkemizde Tarım ve Orman Bakanlığı’nın gerek yurt dışından getirilen gerekse de ülkemizde üretilen dondurulmuş boğa spermasının satışa sunulabilmesi için CASA sistemi ile yapılan motilite değerlendirmelerinde total motilitenin %40’ın üzerinde olması ve payet içerisinde en az 7 milyon motil spermatozoon şartı aranmaktadır
26. Yürütülen çalışmada dondurulmuş boğa spermasının iki farklı yöntemle çözdürülmesi sonrası elde edilen sonuçlar değerlendirildiğinde, total motilite oranları arasında önemli bir farklılık belirlenmesine rağmen bulunan değerlerin belirtilen referans değerlerinin üzerinde olduğu, bunun yanında benzer bulunan progresif motilite oranlarının da yüksek olması nedeniyle suni tohumlama uygulamalarında bu spermaların kullanılabileceği görülmektedir.
Spermatozoonların hareket yeteneklerinin devamı için gerekli olan enerji (ATP), yapısında bulunan mitokondriler tarafından oksidatif fosforilizasyon yoluyla üretilmektedir. İç mitokondriyal membran üzerinde oldukça kompleks bir yapıya sahip olup bu bölgede bulunan metabolitler, burada bulunan alt birimlerden geçerek enerji üretiminde kullanılırlar. Elektron transfer zincirinin son proteini olan Sitokrom C, Kompleks III’den aldığı elektronları sitokrom oksidaza indirgeyip kompleks IV’e geçirerek kompleks V’de ATP üretilmesini sağlar. Sitokrom C proteini normal şartlarda sağlam mitokondriyal membrandan dışarı çıkamaz. Ancak, sıcaklığın aniden düşmesine bağlı olarak spermatozoonun soğuk şokuna uğraması sonucu mitokondriyal membranın yapısının değişmesi ve geçirgenliğinin artması, sitokrom C düzeyinin sızmaya bağlı olarak düşmesine ve bunun sonucunda da mitokondriyal membran potansiyelinin azalmasına neden olabilir27,28. Nitekim Forero Gonzales ve ark.29 dondurulup çözdürülmüş boğa spermasında, çözdürme sonrası mitokondriyal membran potansiyelinde bir azalmanın oluştuğunu ve bu durumun kriyoprezervasyon sırasında şekillenen soğuk şoku nedeniyle spermatozoonların mitokondriyal membran zarlarının lipit ve protein faz değişikliği sonucunda kararsız hale gelmesinden kaynaklandığını bildirmişlerdir. Diğer taraftan, Khalil ve ark.30 ise dondurulmuş boğa spermasının çözdürme sonrası mitokondriyal membran potansiyelinde %15 oranında düştüğünü, bu durumun ise genel olarak kabul edilebilir sınırlar içerisinde kaldığını belirtmiştir. Yapılan çalışmamızda, vajinal yöntemle çözdürülen dondurulmuş boğa spermalarında sıcak suda çözdürülen örneklere göre çözdürme sonrası ortalama yüksek mitokondriyal aktiviteye sahip spermatozoon oranında önemli derecede bir azalma olduğu (P<0.05) belirlenmiştir. Yüksek mitokondriyal membran potansiyeline sahip spermatozoon oranındaki azalmanın total motilite değerlerinde belirlenen azalma ile benzer düzeyde olduğu görülmekle birlikte, bu düşüşün progresif motilite sonuçlarını etkilemediği görülmektedir. Bu sonuç, mitokondriyal membran potansiyelindeki aktivite azalmasının daha çok progresif motilite yeteneğine sahip olmayan spermatozoonlarda meydana geldiği şeklinde açıklanabilir.
Yapılan çalışmada spermatozoonlar hız değerlerine göre sınıflandırıldığında, çözdürme yöntemleri arasında orta hızlı ve yavaş hareket eden spermatozoon oranları yönünden önemli derecede bir farklılık oluşmadığı (P>0.05) görülürken, vajinal yöntemle çözdürülen spermalarda sıcak suda çözdürülen örneklere göre çözdürme sonrası hızlı hareket eden spermatozoon oranının önemli derecede (P<0.05) düşük olduğu ve bu düşüşün ölü (hareketsiz) spermatozoon oranındaki artışla paralellik gösterdiği belirlenmiştir. Elde edilen bu veriler, vajinal çözdürme yönteminin sıcak suda çözdürme yöntemine göre hızlı hareket eden spermatozoon oranında %10-15 oranında bir azalmaya yol açtığını göstermektedir. CASA sistemlerinde progresif motilitenin belirlenmesi özel bir sınıflandırma sistemi ile yapılmaktadır. Bu sistemde spermatozoonlar hem hareket hızlarına (50 μm ˂ hızlı) hem de hareketleri sırasında izledikleri yolun doğrusallık düzeyine göre (0.80 ˂ STR veya LIN) değerlendirilip referans değerlerin üzerinde değer taşıyan spermatozoonlar progresif olarak sınıflandırılırlar31. Elde edilen bulgular değerlendirildiğinde, dondurulmuş boğa spermasının su banyosunda çözdürülmesi yöntemi vajinal çözdürme yöntemine göre daha hızlı bir çözünme ortamı oluşturduğu için hızlı hareket eden spermatozoon oranının artmasına yol açmış olabilir. Ayrıca her iki yöntem arasında progresif motilite oranının benzer olması, su banyosunda çözdürülen payetlerdeki spermatozoonların hız değerleri yüksek olmasına rağmen progresif hareket özelliğine sahip olmadığını göstermektedir.
Yapılan çalışmada, vajinal yöntemle çözdürülen spermalarda sıcak suda çözdürülen örneklere göre çözdürme sonrası ortalama VCL değerinin önemli derecede (P<0.05) düşük olmakla beraber, ortalama VAP ve VSL değerlerinin çözdürme yöntemleri arasında benzerlik gösterdiği (P>0.05) görülmüştür. Kinematik parametre değerleri açısından VAP değeri, spermatozoonun hareket özelliğinin belirlenmesi açısından oldukça önemlidir. Nitekim Nagy ve ark.32 CASA sistemi yardımıyla belirledikleri spermatozoonların kinematik parametre değerleri ile bu spermalarla yaptıkları tohumlamalar sonucunda elde ettikleri gebelik sonuçlarını değerlendirdiklerinde, kinematik parametreler açısından özellikle VAP değerinin fertilitenin tahmin edilmesinde en kullanışlı parametre olduğunu bildirilmişlerdir. Benzer şekilde Robayo ve ark. 33, koç spermatozoonlarının motilite ve kinematik parametrelerinin CASA’da belirlenmesinin ardından servikal mukustaki hareket yeteneklerini inceledikleri çalışmalarında, spermatozoonların koyun servikal mukusunda ilerleyişi ile VAP değerlerinin arasında pozitif yönde bir ilişkinin olduğunu tespit etmişlerdir.
Sunulan çalışmada, hız değerlerine göre hesaplanan ve spermatozoon hareketlerinin doğrusallığını gösteren LIN ve STR değerlerinin vajinal yöntemle çözdürülen spermalarda, sıcak suda çözdürülen örneklere göre önemli derecede (P<0.05) yüksek olduğu gözlenmiştir. Bu durum, sıcak suda çözdürülen örneklere göre vajinal yöntemle çözdürülen spermalarda, VCL değerinin düşük olmasına rağmen VAP ve VSL değerinin birbirine benzer olmasından kaynaklanmaktadır. Spermatozoonun doğrusal olmayan hareketlerinde VAP değeri VSL’ye göre oldukça yüksek iken, düzenli ve düz bir hat üzerinde devam eden spermatozoon hareketinde VAP değeri genellikle VSL’ye çok yakındır. Sunulan değerler incelendiğinde, vajinal yöntemle çözdürülen spermalarda spermatozoonların doğrusal hareket etme oranlarının sıcak suda çözdürülenlere göre daha yüksek bir potansiyel taşıması dikkat çekicidir. Diğer taraftan, başın yayılım genişliği olan ALH ile yalpalama şiddeti olan WOB değerinin ise çözdürme yöntemleri arasında farklılık göstermediği (P>0.05) tespit edilmiştir.
Kaczyk22, su banyosunda çözdürme yöntemi ile payetin doğrudan tohumlama kataterine yerleştirilerek ineğin vajinasında çözdürülmesi yöntemini karşılaştırmak amacıyla yaptığı çalışmasında, sperma kalitesi açısından motilite yönünden bir fark olmadığını belirtirken, senkronize edilen besi sığırlarında iki yöntemle çözdürülen dondurulmuş spermalarla yapılan tohumlamalarda ise gebe kalma oranlarının benzer olduğunu belirlemiştir. Benzer şekilde, Koch ve ark.17, süt ineklerinin suni tohumlama uygulamalarında kullanılan dondurulmuş boğa sperması içeren payetlerin çözdürülmesinde farklı yöntemlerin kullanılmasının gebe kalma oranı üzerindeki etkisini araştırmak amacıyla yaptıkları çalışmalarında, 38⁰C sıcaklıktaki su banyosunda çözdürülerek tohumlanan ineklerin gebelik oranı (87/348; %28) ile doğrudan ineğin vajinasında çözdürülerek tohumlanan hayvanların gebelik oranları (85/385; %32) arasında önemli bir farklılığın gözlenmediğini bildirmişlerdir. Vajinal ve su banyosunda çözdürme yöntemi kullanılarak suni tohumlama uygulamaları yapılan bu çalışmalarda elde edilen gebelik sonuçlarının benzer olması, çalışmamızda belirtilen dondurulmuş boğa spermasının çözdürme sonrası spermatolojik özellikleri üzerine her iki çözdürme yöntemi arasında ortaya çıkan farklılıkların elde edilecek gebelik oranlarını olumsuz yönde etkileyecek düzeyde olmadığı görüşünü desteklemektedir.
Dondurulmuş sperma payetlerinin çözdürülmesinden tohumlanacak ineğin genital organına nakledilinceye kadar geçen zaman içerisinde farklı sıcaklık değişimlerine maruz kalması, spermatozoonların hareket yeteneklerini ve yaşam süresini olumsuz yönde etkileyebilir. Bunun önlenmesindeki etkin yollardan birisi donmuş spermanın stabil sıcaklık derecesine sahip olan vajina içerisinde çözünmesinin sağlanmasıdır. Buna ilaveten, vajinal çözdürme yönteminde diğer standart çözdürme yöntemi olarak kabul edilen su banyosu içerisinde çözdürme yöntemine göre sıcak suya ihtiyaç duyulmaması, payetin çözdürülmesi ve kataterin hazırlanması sırasındaki kritik protokollerden etkilenmemesi gibi avantajlarından dolayı saha koşullarında geniş sayıda tohumlamaların yapıldığı işletmeler açısından daha pratik bir uygulama rahatlığı sağlayabilir. Ayrıca vajinal çözdürme yöntemi, saha şartlarındaki suni tohumlama uygulamalarında inek başına geçen sürenin de daha kısa olmasını sağlayacaktır. Bununla birlikte, suni tohumlama tankından alınan payetin gerekli kontroller yapılamadan katatere yerleştirilmesi, payetin kesimi esnasında sperma seviyesinin görülememesi ve kataterin hazırlanmasından ineğin vajinasına yerleştirilinceye kadar geçen sürenin herhangi bir sebeple uzaması gibi durumlar vajinal çözdürme yöntemi sonrası elde edilecek sperma kalitesini olumsuz yönde etkileyebilecek risk faktörleri olarak sıralanabilir. Ayrıca bu yöntem uygulanırken, çözdürme işleminin tohumlanacak hayvana çok yakın bir yerde yapılması zorunluluğu, kataterin hazırlandıktan sonra belirli bir alana taşınması ihtimalini de ortadan kaldırmaktadır.
Sonuç olarak, payetler içerisinde dondurulmuş boğa spermasının doğrudan tohumlama kataterine yerleştirilerek ineğin vajinasında çözdürülmesi (soğuk tohumlama) yönteminin payetlerin su banyosunda çözdürülmesi yöntemine göre çözdürme sonrası progresif motilite oranını etkilemediği tespit edilirken, total motilite, yüksek mitokondriyal aktiviteye sahip spermatozoon oranı ve hızlı spermatozoon oranı yönünden bir azalmaya yol açtığı gözlenmiştir. Ancak belirlenen bu farklılıklara rağmen elde edilen değerlerin spermanın suni tohumlama uygulamalarında kullanılabilirliği açısından kabul edilebilir referans sınırları içerisinde olduğu belirlenmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemin saha koşullarında bilimsel olarak rahatlıkla kullanılabilmesi için daha geniş bir popülasyonda çalışılarak, kullanılan yöntemlere göre spermatolojik özelliklerin bireysel farklılıklardan ve çözdürme sonrası inkübasyon süresinden etkilenme düzeyinin de belirlenmesi faydalı olacaktır.
)
)
)
)
)
)
