Araştırma ve Yayın Etiği: Bu çalışma için Dicle Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu’ndan etik kurul onayı gerekmediğine dair 26.12.2023 tarih ve 2023/624659 karar no’lu belge alınmıştır.
Araştırma Materyali: Bu çalışmada körpe ıspanaklar materyal olarak kullanıldı. Tüketici seviyesinde satışa sunulan taze körpe ıspanaklar (baby spinach) uluslararası düzeyde faaliyet gösteren bir zincir marketin Diyarbakır ili sınırları içerisinde yer alan satış noktasından temin edildi. Körpe ıspanakların orijinal ambalajı içinde, yıkama işlemi uygulanmadan ayıklama işlemine tabi tutulmuş, herhangi bir sanitizer ile muamele edilmemiş olmasına dikkat edildi. Deneysel aşamanın gerçekleştirileceği günler marketin sebze/meyve reyon sorumlusu ile bireysel iletişime geçilerek ürünün satış noktasına ulaşacağı tarihler belirlendi. Böylece körpe ıspanakların taze olarak temin edilmesi sağlandı. Soğuk zincir altında Dicle Üniversitesi Veteriner Fakültesi Besin/Gıda Hijyeni ve Teknolojisi Ana Bilim Dalı laboratuvarına getirilen körpe ıspanaklar 24 saat içinde deneysel çalışmalarda kullanılmak üzere orijinal ambalajında buzdolabı koşullarında (+4 ⁰C) bekletildi. Organoleptik açıdan (koku, tekstür, görünüm vb.) uygun olmayan ıspanak yaprakları çalışmaya dahil edilmedi.
Körpe Ispanakların Hazırlanması: Her bir ıspanak yaprağı örneği boyu 8 cm ve eni 2 cm olacak şekilde ayarlanan steril metal levhalar kullanılarak bir bisturi yardımı ile toplam 16 cm2’lik alana sahip parçalar şeklinde kesildi. Daha sonra kesilen ıspanakların her bir yüzü UV-C lambası altında 15 dakika bekletildi.
Körpe Ispanakların Salmonella ve E. coli O157:H7 İle Kontaminasyonu: Ispanakların kontaminasyonu için Dicle Üniversitesi Veteriner Fakültesi Besin Hijyeni ve Teknolojisi Bölümü kültür koleksiyonunda bulunan ATCC 14028 (Salmonella Typhimurium), RSKK 91 (Salmonella Enteritidis), ATCC 43894 (E. coli O157:H7) ve ATCC 43895 (E. coli O157:H7) suşları kullanıldı.
Her patojenin 2 suşu -20 ⁰C’den çıkarılarak bir öze yardımıyla Tryptic Soy broth (TSB) (LABM, UK) besiyerine aktarıldıktan sonra 37 ⁰C’de 18-24 saat bekletildi. Patojen suşların aktifleşmesi için bu basamak iki kez tekrar edildikten sonra TSB içinde bulunan her patojenin 2 suşu santrifüj (4200 rpm’de 10 dk) (Nüve NF 800R, Türkiye) sonrası üstte kalan süpernatant uzaklaştırıldı. Geriye kalan pelete 9 mL %0.1’lik Pepton Water (PW) (LABM, UK) ilave edilerek yıkandı ve tekrar santrifüj (4200 rpm’de 10 dk) edildi. Üstte kalan süpernatant uzaklaştırıldıktan sonra geriye kalan her bir patojen suşa ait pelete 5 mL %0.1’lik PW ilave edilerek pipetaj ile homojenize edildi. Daha sonra homojen hale getirilen peletler bakteri yoğunluğu 108 kob/mL düzeyinde olacak şekilde bir tüpte birleştirilerek ıspanakların kontaminasyonunda kullanıldı23.
Her bir körpe ıspanak örneği [eni 8 cm ve boyu 2 cm (16 cm2), abaxial yüz)] nokta inokulasyon yöntemine göre bir pipet yardımıyla kontamine edildi. Ispanak yüzeylerinin kontaminasyonu sonrası patojenlerin tutunmasını sağlamak amacıyla her bir ıspanak örneği steril cam petrilerde oda sıcaklığında laminer flow kabini içinde 2 saat bekletilerek kontaminasyon aşaması gerçekleştirildi24.
Sanitizer Solüsyonların Hazırlanması ve Deney Grupların Oluşturulması: Sanitizer olarak kullanılacak solüsyonlar ulusal düzeyde satışına izin verilen tüketici tarafından kolaylıkla ulaşılabilen ve piyasada yaygın olarak bulunabilen firmalara ait ürünlerden seçildi. Gözleme dayalı yapılan ön piyasa araştırmaları sonucunda bu özellikleri karşılayan 4 farklı firmaya ait sebze/meyve sanitizer solüsyonu ıspanak yapraklarının sanitasyonu için kullanıldı. Daha sonra ıspanak örnekleri kontrol dahil toplam 5 gruba ayrıldı. Her tekrarda 30 ıspanak örneği olacak şekilde toplam 3 tekrarda 90 körpe ıspanak kullanıldı. Sanitasyon amacıyla hazırlanan tüm solüsyonların kullanılmadan önce oda sıcaklığında olmasına dikkat edildi.
1. grup (Kontrol): Salmonella ve E. coli O157:H7 ile kontamine edilen ancak hiçbir işlem uygulanmayan grup.
2. grup: Sodyum hipoklorit ve aktif klor içeren ticari sanitizer solüsyon. Üretici firmanın önerdiği şekilde 500 ml steril suya 25 mL yıkama sıvısı ilave edilerek hazırlandı (sırasıyla aktif madde oranları %0.024, %0.0229).
3. grup: Potasyum tuzlarını içeren ticari sanitizer solüsyon. Üretici firmanın önerdiği şekilde 500 mL steril suya 2.5 mL yıkama sıvısı ilave edilerek hazırlandı (yoğunluk < %0.8).
4. grup: Klor içeren ticari sanitizer solüsyon. Üretici firmanın önerdiği şekilde 500 mL steril suya 2.5 mL yıkama sıvısı ilave edilerek hazırlandı (Yoğunluk [g/l, 20°C]: 1.04).
5. grup: Bitkisel kekik yağı, ayçiçek lesitini ve laktik asit içeren ticari sanitizer solüsyon. Kullanıma hazır olarak satışı olan yıkama solüsyonu üretici firmanın önerdiği şekilde püskürtme işlemi uygulanan grup (oranlar sırasıyla 0.0206 mL/L, 0.0002 mL/L, 0.01250 mL/L).
Salmonella ve E. coli O157:H7 suşları ile kontamine edilen ıspanaklar, 1. grup (kontrol grubu) ve 5. grup hariç, 2, 3 ve 4. gruplar üretici firma tarafından önerildiği şekliyle hazırlanan 500 mL’lik kaplarda bulunan sanitizer solüsyon içerisine 1, 5 ve 10 dk. daldırılıp çıkarıldıktan sonra steril poşetlere konuldu. 5. grupta ise üretici firmanın direktiflerine göre püskürtme ile 1, 5 ve 10 dk bekletildikten sonra steril poşetlere konuldu. Kontrol grubunda ise herhangi bir sanitizer kullanılmadı. Ispanak örneklerinin 1, 5 ve 10 dk sanitasyonundan hemen sonra ve 24. saat 4⁰C’de muhafazası sırasında patojenlerde meydana gelen sayısal değişimler mikrobiyolojik analizler ile belirlendi.
Mikrobiyolojik Analizler: Sanitizerlerin 1, 5 ve 10 dk (0. gün) uygulanması sırasında ve bunların 4 ⁰C’de 24 saat muhafazası sonrasında Salmonella ve E. coli O157:H7 sayısında meydana gelen değişimleri belirlemek amacıyla her örneklem zamanında körpe ıspanak örneklerinin bulunduğu steril poşetlere 20 mL steril tamponlanmış peptonlu su (BPW) (LABM, UK) ilave edildi. Ispanak ve BPW içeren her bir numune alma poşeti 2 dakika karıştırıcıda (stomacher) homojenize edildikten sonra1/10’luk düzende seri dilüsyonlar yapıldı.
Salmonella ve E. coli O157:H7 Sayısının Belirlenmesi: Salmonella sayısının belirlenmesi için her dilüsyondan 0,1 ml alınarak çift seri halinde Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) (LABM, UK) agar plaklarına yüzey yayma yöntemi ile ekim yapıldı ve 37 ⁰C’de 18-24 saat inkübasyon sonrası XLD agarda üreyen tipik koloniler (siyah veya siyah merkezli) sayılarak not edildi. Ayrıca, Salmonella sayısının tespit edilebilir limitlerin altına düşmesi durumuna karşı örneklerde var/yok testi uygulandı (25).
E. coli O157:H7 sayısı her dilüsyondan 0.1 mL alınarak, Cefixim Tellurite (CT) içeren Sorbitol MacConkey (CT-SMAC) (LABM, UK) agar plaklarına yüzey yayma yöntemi ile ekim yapılarak, 35 ⁰C’de 18-24 saat inkübasyon sonrası CT-SMAC agar besiyerinde üreyen sorbitol negatif koloniler sayılarak not edildi. Ayrıca, E. coli O157:H7 sayısının tespit edilebilir limitlerin altına düşmesi durumuna karşı örneklerde var/yok testi uygulandı25.
Salmonella ve E. coli O157:H7 ile kontamine edilen körpe ıspanakların sanitasyonu sırasında sanitizer solüsyonlara geçen Salmonella ve E. coli O157:H7 sayılarının ve canlılık durumlarının tespiti amacıyla 1, 5 ve 10. dakikalarda her bir sanitasyon solüsyonundan 1 mL alındı. Daha sonra 1/10’luk düzende seri dilüsyonlar hazırlanarak yukarıda açıklandığı şekilde Salmonella ve E. coli O157:H7 için tespiti için mikrobiyolojik analizler gerçekleştirildi.
Salmonella ve E. coli O157:H7 Sayısının (kob/cm2) Hesaplanması: Elde edilen veriler aşağıdaki formül kullanılarak kob/cm2 çevrildi.
log kob/cm2 = log [kob/ml x sulandırma miktarı/toplam yüzey alan (cm2)] log kob/cm2 = log10 [kob/ml x 20/16]
İstatiksel Analiz: Salmonella ve E. coli O157:H7 sayıları log kob/cm2’ye dönüştürülerek 5x4x3 (test grubu x örnekleme zamanı x tekerrür) faktöriyel deneme desenine uygun olarak varyans analizine tabi tutuldu. Ortalamalar Fisher’in en küçük kareler farkı (Fisher’s LSD) testi kullanılarak ayrıştırıldı ve grup içi ve gruplar arası farklılıklar karşılaştırıldı. Bu amaçla, Statistical Analysis System (SAS) paket programı (Version 8, 1999, SAS InstituteInc., Cary, NC, ABD) kullanıldı. İstatistiksel önem derecesi P<0.05 olarak kabul edildi.