Materyal olarak bir lokantadan müşteriler için hazırlanan taze çiğ köfteler kullanıldı. Esansiyel yağlar ise çiğ köfte içerisine belirli oranlarda direk olarak eklendi. Her bir tekerrür için, 1050 g çiğ köfte kullanıldı.
1. İnokulumun hazırlanması: Refik Saydam Hıfzı Sıhha Enstitüsü kültür koleksiyonundan temin edilen 5 farklı Salmonella suşu (RSKK 95091, 96046, 19, 91, 92), ayrı ayrı 10 ml'lik nutrient besi yerinde 35ºC de 24 saat çoğaltıldı ve santrifüjle supernatant uzaklaştırılıp peletler steril serum fizyolojik ile yıkandı. Tekrar santrifüj edildi ve daha sonra tüm peletler %0.1 peptonlu suda süspansiyon haline birleştirilerek 17 ml'ye tamamlandı. Bu karışımdaki patojen yoğunluğu 109 kob/ml olarak belirlendi.
2. Çiğ köftenin inokulasyonu ve esansiyel yağların uygulanması: Deneysel dizaynı gösteren akış şeması Şekil 1' de verilmiştir. İnokulasyondan önce numuneden tuz, pH ve Salmonella analizleri için örnekler alındı. Kalan miktara Salmonella mix kültürü ilave edildi ve karıştırıldı. İnokülasyon seviyesini belirlemek için alınan 25'şer g'lık iki örnekten sonra kalan 900 g'lık çiğ köfte, 6 eşit gruba ayrıldı. Ağırlığının %1.8(v/w)'i oranında, I.gruba steril serum fizyolojik (kontrol), II. gruba carvone (Sigma-Aldrich), III. gruba cineole (Merck), IV. gruba eugenol (Merck), V. gruba linalool (Merck) ve VI. gruba limonen (Merck) ilave edildi ve iyice karıştırıldı. Esansiyel yağlar kullanılmadan önce filtrasyonla (0.2 mikron) sterilize edildi. Örnek alınmadan önce çiğ köfteler 15 dk oda sıcaklığında bekletildi ve daha sonra 4ºC'de 3 saat muhafaza edildi. Esansiyel yağların uygulanmasından 30 dk ve 3 saat sonra her gruptan alınan çift seri örneklerde XLD agara ekim yapıldı.
Büyütmek İçin Tıklayın |
Şekil 1: Salmonella inokulasyonu ve farklı esansiyel yağların çiğ köfteye ilave edilmesi |
3. Örneklerin alınması ve analizi: Her gruptan 0. ve 3. saatlerde 25 g'lık 2'şer örnek alındı. Her örnek 225 ml steril peptonlu suda 2 dk homojenize edildikten sonra 1/10'luk düzende 1/108'e kadar seyreltilerek, her dilüsyondan çift seri XLD agar (Acumedia) plaklarına 0.1 ml yüzey yayma yöntemi ile ekimler yapıldı ve 35ºCC' de 24 saat inkübe edildi16. Sayım yapılan plaklardan tesadüfen seçilen 3 koloni, polyvalent Salmonella antiserumu ile (Serobact, Eurobio) “O” antijenin varlığına bakılarak doğrulandı. Bu sayım tekniğinin duyarlılık seviyesi 10 kob/g' olduğu için, patojen seviyesinin duyarlılık derecesinin altına düştüğü durumlarda sırasıyla 35ºCC' de 24 saat %0.1 peptonlu suda ve daha sonra 42ºCC'de 24 saat Rappaport-Vassiliadis (Merck) ve Tetrathionate Broth (Oxoid) besi yerlerinde zenginleştirmeye tabi tutuldu 16.
4. Eugenolün minimum antimikrobiyel etki seviyesinin belirlenmesi: Bu amaçla, çiğ köfte Salmonella ile inoküle edildikten sonra 5 gruba ayrıldı. I. grup kontrol olmak üzere %0, II. gruba %0.5, III. gruba %1.0, IV. gruba %1.5 ve V.gruba %1.8 oranında eugenol ilave edildi. Uygulamadan 1 saat sonra gruplardan alınan 3'er örnekten patojen sayısı tespit edildi. Akış şeması şekil 2' de verilmiştir.
5. Diğer analizler: Çiğ köftelerin tuz oranı Mohr yöntemi15 ile, 3 saatlik bekletmeden sonra gruplardan 1'er örnek alınarak, pH'sı (EDT. GP 353) ve su aktivitesi (Testo 650) belirlendi.
6. Deneysel dizayn ve verilerin istatistiksel analizi: Deneyler 1'er hafta arayla 3 tekerrürden oluştu. log10 kob/g'a çevrilen veriler “tekerrür sayısı x örnekleme zamanı x test grupları x her test grubundan bir seferde alınan örnek sayısı” olacak şekilde 3x4x6x3 faktöryel dizayna uygun olarak fix etkiler ve değişkenler arası interaksiyonlar yönünden varians analizine tabi tutuldu. General Linear Models (GLM) prosedürlerine göre, en düşük kareler ortalamaları Fisher's Least significant difference (LSD) testi kullanılarak ayrıştırıldı ve bunda istatistiksel önem seviyesi %5 olarak kabul edildi. Su aktivitesi ve pH değerlerinde sadece standart sapma değerleri hesaplandı. Verilerin analizi, Statistical Analysis System (versiyon 6.1, SAS Institute Inc., Cary, North Caroline USA) kullanılarak yapıldı.
)
)
)
)
)
