Subklinik mastitis en sık karşılaşılan mastitis formudur. Memede makroskopik olarak yangı ve sütte gözle görülür bir değişiklik olmamasına rağmen süt üretiminde azalma ve süt kalitesinde düşmeye sebep olur². Subklinik mastitis diğer mastitislere oranla daha fazla şekillenmesi ve %3-26 oranında süt kaybına neden olmasından dolayı önemlidir³.

Serbest radikal eşlenmemiş elektron taşıyan atom veya atom gruplarıdır⁴. Serbest radikallerin zararlı etkilerinden korunmak için hücreler enzimatik ve nonenzimatik antioksidan savunma sistemlerini kullanırlar. Serbest oksijen radikalleri başlıca; superoksid dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GSH-Px), katalaz (CAT) gibi enzimatik ve glutatyon (GSH), α-tokoferol, karotenoitler ve C-vitamini gibi enzimatik olmayan çeşitli antioksidanlarla uzaklaştırılabilir^5,6. Serbest radikallerin artmış üretimi ve mevcut antioksidan moleküller arasındaki dengesizlik oksidatif strese sebep olur⁷. Mastitisin teşhisi, meme ve sütün klinik muayenesi, sütün kimyasal, fiziksel, hücresel ve mikrobiyolojik muayenesi ile yapılabilmektedir. Ayrıca bu hastalığın kan ve vücut sıvılarında meydana getirdiği biyokimyasal değişiklikler de araştırılmıştır⁸. Mastitisli ineklerin kanında oksidan ve antioksidan parametrelerin değişimi ile ilgili çeşitli araştırmalar yapılmasına rağmen^1,9-13 mastitisin sütün oksidan (MDA)^9,14 ve antioksidan (GSH, GSH-Px ve CAT)¹⁰ durumunu nasıl etkilediği ile ilgili sınırlı sayıda çalışmaya rastlanılmıştır. Bu nedenle subklinik mastitisin ineklerin sütündeki oksidan (MDA) ve antioksidan (GSH, GSH-Px ve CAT) parametreleri nasıl etkilediğinin araştırılması amaçlanmıştır.

Alınan sütler 3000 g'de 10 dakika santrifüj edilerek üst kısımda biriken yağ uzaklaştırıldı. Geriye kalan sütte CAT ve GSH-Px aktivitesi ile MDA ve GSH seviyesi belirlendi.

MDA seviyesi Placer ve ark.¹⁵'nın metoduna göre tespit edildi. Oluşan MDA, tiyobarbitürük asitle (TBA) pembe renkli bir kompleks oluşturmakta ve bu çözeltinin absorbansı 532 nm'de spektrofotometrik olarak ölçülerek lipid peroksidasyonun derecesi saptanmaktadır. MDA düzeyi nmol/ml olarak hesaplandı.

GSH-Px aktivitesi Beutler¹⁶ metoduna göre ölçüldü. GSH-Px aktivitesi, NADPH oksidasyonunu takiben spektrofotometrik olarak 340 nm'de sistemin optik dansitesindeki düşüşten hesaplanır. GSH-Px aktivitesi U/g protein şeklinde hesaplandı.

GSH konsantrasyonu Beutler ve ark.¹⁷ metoduna göre ölçüldü. GSH seviyesi, 5.5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (Ellmann's solüsyonu) ile sülfhidril gruplarının sarı renk oluşturması ve bu rengin 412 nm'de ölçülmesi esasına dayanır. GSH seviyesi μmol/ g protein olarak verildi.

CAT aktivitesi Aebi¹⁸'nin bildirdiği metoda göre tespit edildi. Aktivite ölçümü ortamındaki H₂O₂'nin CAT vasıtasıyla suya dönüşümü sağlanırken meydana gelen absorbans azalmasının 240 nm'de ölçülmesi esasına dayanmaktadır. Harcanan H₂O₂ miktarından CAT aktivitesi sonuçları k/g protein cinsinden verildi.

Protein miktarını ölçmede ise Lowry metodu¹⁹ kullanıldı.

İstatistiksel analiz: Gruplar arasındaki farkın kontrolünde SPSS 12.0 paket programı kapsamında varyans analizi ve Duncan testinden faydalanıldı, sonuçlar ortalama ± standart hata olarak verildi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: Subklinik mastitisli ineklerin sütünde MDA ve GSH düzeyleri ile GSH-Px ve CAT aktiviteleri (Ort ± Std hata).

Günümüzde mastitisin tanısında sütün mikrobiyolojik inceleme ve somatik hücre sayımı dışında kullanılan bazı biyokimyasal parametreler vardır. Yangı sırasında süte özgü birçok enzimin aktivitesinde değişiklikler görülür. Süt sentezi ile bağlantılı enzimler azalırken yangı reaksiyonu ile ilgili enzimler artış gösterir². Mastitisli ineklerin kanında enzimatik antioksidanların azaldığı (CAT, GSH-Px, SOD) bildirilmektedir^9,10,21,22. Yarım ve Salmanoğlu^10, subklinik mastitisli ineklerin sütünde de GSH-Px ve SOD aktivitesini düşük bulmuşlardır. Mevcut çalışmada da subklinik mastitisli ineklerin sütündeki CAT aktivitesinin değişmediği fakat sütteki GSH-Px aktivitesinin sağlıklılara göre düşük düzeyde tespit edilmiş ancak bunun istatistiksel olarak önemsiz olduğu saptanmışdır. Bu azalma enzimin substratı olan GSH'un sütteki seviyesinin mastitisin derecesine bağlı olarak azalmasıyla ilişkili olabilir. Atroshi ve ark.^23, mastitis olgularında yangıya bağlı olarak meydana gelen serbest radikallerin etkisi sonucu antioksidan kullanımının arttığını bunun sonucunda da enzimlerin düzeylerinin azaldığını belirtmişlerdir.

Mastitisli ineklerin kanında enzimatik olmayan antioksidan parametrelerin değişimi ile ilgili çeşitli araştırmalarda vitamin A, E ve C, β-karoten, GSH, Se düzeylerinin sağlıklı ineklerden düşük olduğu saptanmıştır^{1,9,11,12,21,23-25}. Bizim çalışmamızda da mastitis sonucu sütte GSH düzeyinde önemli azalmanın olduğu tespit edildi. Sütte aşırı miktarlarda nötrofil, makrofaj, lenfosit, eozinofil ve meme dokusunun çeşitli epitel hücrelerinin bulunması, meme bezinin yangısından dolayı mikroorganizmalara meme dokusunun cevabı olarak göz önünde tutulur²⁶. Mastitis enfeksiyonlarında yangıya ve somatik hücre sayısındaki (SHS) artışa bağlı olarak kanda lökosit sayısında artış meydana gelmektedir. Mastitiste memede doku hasarı sonucu sütün kalitesi bozulmakta, bölgede lökositlerden makrofajlar ve nötrofillerin sayısı artmaktadır. Enfeksiyon etkeninin meme kanalını enfekte etmesi nedeni ile süte geçen lökosit ve epitel hücrelerinden enzimlerin serbest hale geçmesi sütteki enzim seviyesini yükseltmektedir^27,28. Lökositler, özellikle aktif olan fagositler meme hastalıklarında gereken performansı artırmak için antioksidanlara ihtiyaç duyar. Lökositlerin fonksiyonlarını geliştirmek için antioksidanların gücü, bunların hastalıklı memelerdeki yararlı etkilerini kısmen açıklayabilir²⁹. Mevcut çalışmada, mastitis sonucu sütte GSH düzeyinde azalma lökositlerin antioksidan olarak GSH'ı kullanmalarıyla ilişkilendirilebilir. Plazma GSH konsantrasyonu da ineklerdeki somatik hücre sayısı negatif korelasyon göstermekte^30,31 olup GSH'un oksidatif hasardan dokuları korumada ve lökositler tarafından fagositozda etkili olduğu bildirilmektedir²². Buna paralel olarak mastitis sonucu sütün total antioksidan kapasitesi, vitamin E ve Se düzeylerinin düştüğünü bildiren çeşitli çalışmalar mevcuttur^9,23,25,26. Nitekim yapılan araştırmalarda, antioksidanların azalmasının mastitis riskini artırabileceği ve antioksidan takviyesinin ise bunun önlenmesinde önemli olduğu belirtilmektedir^9,23,24,32.

GSH-Px enzimi nötrofiller ve makrofajların aktivitelerinde olumlu yönde etkide bulunur²³. Lökositlerin aktiviteleri için gerekli olan GSH-Px enziminin fagositoz sırasında lökositler tarafından kullanılması sonucu GSH-Px enzim aktivitesi azalmaktadır³³. GSH'un düzeyinde mastitis seviyesine bağlı olarak görülen azalma, GSH'u substratı olarak kullanan enzimlerden biri olan GSH-Px enzim aktivitesinin de azalmasına sebep olmuştur. Bu CMT ⁺³ şiddetindeki mastitisde sütte antioksidanların yetersiz kalabileceğinin açık göstergesidir.

Meme bezi yangılarında fagositik hücrelerin yangı yerine göçü sonucu aktivitelerine bağlı olarak daha fazla oksijen kullanılmasıyla lipit peroksidasyonu oluşmakta ve lipit peroksidasyonunun bir ürünü olan MDA düzeyi artmaktadır³⁴. Mastitisde plazma MDA düzeyinin arttığını bildiren araştırmalara^9,11,13,14 rağmen Dündar ve ark.¹⁴'nın tespit ettiği gibi bu çalışmada da mastitiste süt MDA düzeyinin değişmediği saptanmıştır. Zıt olarak, inek ve buffalolarda subklinik ve klinik mastitiste süt MDA düzeyinin arttığı bildirilmiştir^9,13. Diğer taraftan Kızıl ve ark.¹² ile Ranjan ve ark.^35, subkilinik mastitisde değilde klinik mastitiste kan lipit peroksit düzeyinin önemli artış gösterdiğini belirtmişlerdir.

Mastitise karşı direnç ve immun sistemin arttırılması için meme bezi hastalıklarında antioksidanlar çok önemlidir³². Subklinik mastitis sonucu sütteki MDA düzeyinin değişmediği, fakat antioksidan özelliğe sahip GSH seviyesinde önemli azalmanın olduğu belirlenmiştir. Subklinik mastitisin süt üretiminde azalma ve süt kalitesinde düşmeye sebep olduğu bilinmektedir. Antioksidan kapasitede görev alan GSH'un sütte azalması, subklinik mastitiste sütün kalitesinin düşmesinde etkili diğer bir faktör olabilir.

1) Kaya I, Guven A. Mastitisli ineklerde kan vitamin A, β-karoten ve vitamin E düzeylerinin belirlenmesi. Kafkas Üniv Vet Fak Derg 2008; 14: 57-61.

2) Yagcı IP. Koyunlarda subklinik mastitis: Etiyoloji, epidemiyoloji ve tanı yöntemleri. Kafkas Üniv Vet Fak Derg 2008; 14: 117-122.

3) Sandholm M, Mattila T. Biochemical aspects of bovine mastitis. Isr J Vet Med 1986; 42: 405-415.

4) Machlin LJ, Bendich A. Free radical tissue damage: protective role of antioxidant nutrients. FASEB J 1987; 1: 441-446.

5) Miller JK, Brzezinska-Slebodzinska E. Oxidative stress, antioxidants and animal function. J Dairy Sci 1993; 76: 2812-2823.

6) Stahl W, Sies H. Antioxidant defense: vitamins E and C and carotenoids. Diabetes 1997; 46: 14-18.

7) Miller JK, Brzezınska-Slebodzınska E, Madsen FC. Oxidative stress, antioxidants, and animal function. J Dairy Sci 1993; 76: 2812-2823.

8) Yuksel M, Kandemir FM, Deveci H, Ozdemir N. Sağlıklı ve subklinik mastitisli ineklerde kan serumu ALP, ALT ve glukoz düzeyleri üzerine çalışma. Atatürk Üniversitesi Vet Bil Derg 2009; 4: 163-168.

9) Simsek H, Aksakal M. Subklinik mastitisli ineklerde kan ve sütte lipit peroksidasyon ve bazı antioksidanlar üzerine E vitamininin etkisi. Ankara Üniv Vet Fak Derg 2005; 52: 71-76.

10) Yarim G, Salmanoglu B. Subklinik mastitisli süt ineklerinde meme içi levamizol uygulanmasında süt ve kanda glutatyon peroksidaz, süperoksit dismutaz, alkalen fosfotaz ve immunoglobulin G düzeyleri. Ankara Üniv Vet Fak Derg 2002; 49: 89-94.

11) Deveci HA, Guven A. Mastitisli ineklerde kan MDA ve GSH düzeylerinin araştırılması. Kafkas Üniv Vet Fak Derg 2008; 14: 63-66.

12) Kızıl O, Akar Y, Saat N, Kızıl M, Yuksel M. The plasma lipid peroxidation intensity (MDA) and chain-breaking antioxidant concentrations in the cows with clinic or subclinic mastitis. Revue Méd Vét 2007; 158: 529-533.

13) Kumar M, Kumar R, Sharma A, Jain VK. Investigations on prevalance and oxidative stress aspects of mastitis in buffaloes. Ital J Anim Sci 2007; 6: 978-979.

14) Dundar Y, Eryavuz A, Aslan R, Ucar M. Malondialdehyde and glucose-6 phosphate dehydrogenase levels in healthy and subclinical mastitic cows. Yüzüncü Yıl Üniv Sağ Bil Derg 2000; 6: 84-86.

15) Placer ZA, Cushman LL, Johnson BC. Estimation of product of lipid peroxidation (malonyldialdehyde) in biochemical systems. Anal Biochem 1966; 16: 359-364.

16) Beutler E. Red cell metabolism. In, Beutler E (Editor). A manual of biochemical methods. New York: Grunef and Strottan 1975: 67-69.

17) Beutler E, Duron O, Kelly BM. Improved method for the determination of blood glutathione. J Lab Clin Med 1963; 61: 882-888.

18) Aebi H. Catalase in vitro. Method Enzymol 1984; 105: 121-126.

19) Lowry OH, Rosenbrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurements with the folin phenol reagent. J Biol Chem 1951; 193: 265-275.

20) Gurbulak K, Canooglu E, Abay M, Atabay O, Bekyurek T. İneklerde subklinik mastitisin farklı yöntemlerle saptanması. Kafkas Üniv Vet Fak Derg 2009; 15: 765-770.

21) Atroshi F, Parantianen J, Sankari S, Osterman T. Prostaglandins and glutathione peroxidase in bovine mastitis. Res Vet Sci 1986; 40: 361-366.

22) Erskine RJ, Eberhart RJ, Hutchınson LJ, Scholz RW. Blood selenium concentrations and glutathione peroxidase activities in dairy herds with high and low somatic cell counts. J Am Vet Med Assoc 1987; 190: 1417-1421.

23) Atroshi F, Tyopponen J, Sankari S, Kangasniemi R, Parantainen J. Possible roles of vitamin E and glutathione metabolism in bovine mastitis. Internat J Vit Nutr Res 1987; 57: 37-43.

24) Musal B, Ulutaş Pa, Turkyılmaz S. Blood vitamin C, vitamin A, β-carotene, ceruloplasmin, glutathione and malondialdehyde concentrations in cows with subclinical mastitis treated with intramammary antibiotics. Revue Méd Vét 2007; 158; 633-640.

25) Batra TR, Singh K, Ho SK, Hıdıroglu M. Concentration of plasma and milk vitamin E and plasma β-carotene of mastitic and healthy cows. J Vit Nutr Res 1991; 62: 233-237.

26) Atakisi O, Oral H, Atakisi E, et al. Subclinical mastitis causes alterations in nitric oxide, total oxidant and antioxidant capacity in cow milk. Res Vet Sci 2010; 89: 10-13.

27) Prin-Mathieu C, Le RY, Faure GC, Laurent F, Béné MC, Moussaoui F. Enzymatic activites of bovine peripheral blood leukocytes and milk polymorphonuclear neutrophils during intramammary inflammation caused by lipopolysaccharide. Clin Diagn Lab Immunol 2002; 9: 812-817.

28) Zargham KM, Muhammed G, Umar A, Ali KS. A preliminary comparison of plasma fibrinogen concentrations, leukocyte numbers and erythrocyte sedimentation rate as non-spesific indicators of inflammatory conditions in buffalo (Bubalis bubalis). Vet Res Commun 1997; 21: 265-271.

29) Erskine RJ. Nutrition and mastitis. Update on bovine mastitis. Vet Clin North Am: Food Anim Pract 1993; 9: 551-556.

30) Erskine RJ, Eberhart VMD, Grasso MS, Scholz RW. Induction of Escherichia coli mastitis in cows fed selenium deficient or selenium-supplemented diets. Am J Vet Res 1989; 50: 2093-2099.

31) Ndiweni N, Field TR, Williams MR, Booth JM, Finch JM. Studies on the incidence of clinical mastitis and blood levels of vitamin E and selenium in dairy herds in England. Vet Rec 1991; 129: 86-88.

32) Mohamed HE. Antioxidants status and degree of oxidative stress in mastitic and healthy camel (Camelus dromedarius). Res J Anim Sci 2007; 1: 92-94.

33) Serfass RE, Ganther HE. Effects of dietary selenium and tocopherol on glutathione peroxidase and superoxide dismutase activities in rat. Phago-Life Sci 1976; 19: 1139-1144.

34) Mayer SJ, Wterman AE, Keen PM, Craven N. Oxygen concentration in milk of healty and mastitic cows andimplications of oxygen tension. J Dairy Sci 1988; 55: 513-519.

35) Ranjan R, Swarup D, Naresh R, Patra RC. Enhanced erythrocytic lipid peroxides and reduced plasma ascorbic acid, and alteration in blood trace elements level in dairy cows with mastitis. Vet Res Commun 2005; 29: 27-34.