[ Ana Sayfa | Editörler | Danışma Kurulu | Dergi Hakkında | İçindekiler | Arşiv | Yayın Arama | Yazarlara Bilgi | E-Posta ]
Fırat Üniversitesi Sağlık Bilimleri Veteriner Dergisi
2014, Cilt 28, Sayı 1, Sayfa(lar) 001-004
[ Özet ] [ PDF ] [ Benzer Makaleler ] [ Yazara E-Posta ] [ Editöre E-Posta ]
Östrüs Siklusunun Farklı Dönemlerindeki Dişi Köpeklerde Kan Progesteron ve 17β-Östradiol Seviyelerinin RIA ve ECLIA Yöntemleriyle Karşılaştırılması
Burhan YÜCEL, Oktay YILMAZ, Mehmet UÇAR
Afyon Kocatepe Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Doğum ve Jinekoloji Anabilim Dalı, Afyonkarahisar, TÜRKİYE
Anahtar Kelimeler: Progesteron, 17β-östradiol, RIA, ECLIA, dişi köpek
Özet
Bu çalışmada, seksüel siklusun değişik dönemlerindeki köpeklerin serum örneklerinde radioimmunoassay (RIA) yöntemiyle ölçülen progesteron (P4) ve 17β-östradiol (E2) düzeylerinin elektrokemiluminesans immunoassay (ECLIA) yöntemiyle karşılaştırılması ve ECLIA yönteminin köpeklerde P4 ve E2 düzeylerinin belirlenmesindeki doğruluğunun tespit edilmesi amaçlandı. Çalışmada çeşitli ırklardan, 10-30 kg canlı ağırlığında, 25 adet dişi köpek kullanıldı. Seksüel siklusların tespiti için vaginal sitoloji kullanıldı. RIA ve ECLIA yöntemlerine göre elde edilen serum P4 ve E2 düzeyleri arasındaki korelasyon karşılaştırıldı.

Köpeklerin %60'ının anöstrüste (n=15), %16'sının proöstrüste (n=4), %16'sının östrüste (n=4) ve %8'inin (n=2) diöstrüste oldukları belirlendi. Sunulan çalışmada her bir hayvana ait serum örneğinin RIA ve ECLIA yöntemleri ile belirlenen serum P4 (ng/mL, P<0.001; r=0.998) ve E2 (pg/mL, P<0.001; r=0.998) değerlerinin birbirine benzer olduğu ve istatistiksel olarak önemli olduğu tespit edildi.

Sonuç olarak, köpeklerde P4 ve E2 ölçümlerinde ECLIA'nın da RIA gibi doğru sonuç veren bir metod olduğu ve test süresinin kısa olması nedeniyle daha etkili bir şekilde kullanılabileceği kanısına varıldı.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Kaynaklar
  • Giriş
    Köpeklerde progesteron (P4) ve östrojen (E2) gibi steroid hormon düzeylerinin tespiti seksüel siklusun dönemi hakkında güvenilir bilgi vermektedir. Bu hormonların tespitinde, sıklıkla radioimmunoassay (RIA) metodu kullanılmakla1 birlikte günümüzde elektrokemiluminesans immunoassay (ECLIA) yöntemi de kullanılmaya başlanmıştır2.

    İşaretlenmiş antijen veya antikorların tespit edilmesi prensibine dayalı olan RIA, yarışmalı bağlanmayı sergilemektedir. Serum örneği içerisinde bulunan işaretlenmiş ve işaretlenmemiş her iki antijen, spesifik antikor üzerindeki bağlanma bölgelerini eş zamanlı olarak tamamlamaya çalışmaktadır1. Luminesans metotlarından elektrokemiluminesans (ECL) bazı solüsyon türleri veya elektrot yüzeyine bağlanan türleri ile bir elektrot arasındaki elektron transferinin bir sonucu olarak direkt ya da indirekt olarak üretilen kemiluminesans olarak ifade edilebilmektedir2.

    Küçük hayvan reprodüksiyonu ile ilgilenen veteriner hekimler, sıklıkla etkili uygun çiftleşme ve suni tohumlama zamanının belirlenmesi, doğum zamanının tespit edilmesi ve hipoluteodizm gibi patolojik durumların belirlenebilmesi için serum P4 ve E2 ölçümüne ihtiyaç duymaktadırlar3,4. RIA tekniği, pek çok klinisyen ve akademisyen tarafından hormon ölçümlerinde sık olarak kullanılmaktadır. Günümüzde bu tekniğin tehlikeli radyoaktif materyal ile çalışıyor olması, uygulama zamanının uzun sürmesi ve pahalı bir yöntem olması farklı yöntemlerin kullanılmasına yöneltmektedir5,6. Kemiluminesans yöntemi ile bazı çalışmalar yapılmış olup6,7, ECLIA ve RIA yöntemleri ile östrojen ve progesteronun karşılaştırıldığı bir çalışma bulunmamaktadır. Bu nedenle sunulan çalışmada, seksüel siklusun farklı dönemlerindeki köpeklerin serum örneklerinde RIA yöntemiyle ölçülen P4 ve E2 düzeyleri ECLIA yöntemiyle karşılaştırılarak, ECLIA yönteminin köpeklerde P4 ve E2 düzeylerini doğru tespit edip etmediği araştırılmıştır.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Kaynaklar
  • Materyal ve Metot
    Bu çalışmanın materyalini, Afyon Kocatepe Üniversitesi Hayvan Hastanesine ovariohisterektomi amacıyla getirilen çeşitli ırklardan, sağlıklı ve en az birbuçuk yaşını dolduran 25 adet dişi köpek oluşturdu. Çalışmada hayvanların kullanılabilmesi için Afyon Kocatepe Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu’nun 17.02.2010 tarih ve 44 sayılı kararı ile onay alındı.

    Çalışmadaki köpeklerin östrüs siklusunun evresini belirlemek için vaginal smear yapıldı. Vaginal sitoloji için örnek alınmasını takiben 10 mL’lik steril vakumlu tüplere kan örnekleri alındı. Kan örnekleri 3000 rpm’de 10 dakika santrifüj edildi ve serum P4 ve E2 analizleri yapılıncaya kadar -20 ºC’de muhafaza edildi.

    Her bir hayvana ait serum P4 ve E2 düzeyleri RIA ve ECLIA yöntemleriyle belirlendi. RIA protokolünde P4 analizleri için immunojen olarak progesteron-11α-BSA kullanılan liyofilize tavşan antiserumu (P 5289, Sigma), E2 analizleri için immunojen olarak 17β-östradiol-6-BSA kullanılan liyofilize tavşan antiserumu (E 2885, Sigma) seçilerek işlemler yaklaşık 2.5 saat içerisinde gerçekleştirildi.

    Köpek serumunda P4 ve E2 düzeylerinin ECLIA yöntemiyle in vitro kantitaf tayini için Cobas e601 (Roche, Almanya) immünolojik test analizörü kullanıldı. Toplam 18 dakika süren P4 analizleri için Anti-progesteron-Abbiyotin (Biyotinli monoklonal anti-progesteron antikor (fare); 0.15 mg/L, fosfat tamponu 25 mmol/L, pH 7.0; koruyucu madde) ve Progesteron-peptid-(Ru(bpy)3 2+) (Rutenyum kompleksi ile işaretli bir sentetik peptide bağlanmış progesteron (bitki kaynaklı), 10 ng/mL; fosfat tamponu) kullanılırken, E2 analizleri için anti-östradiol-Abbiyotin (Biyotinli poliklonal anti-östradiol antikor (tavşan); 45 ng/mL, mesterelon 130 ng/mL MES buffer 50 mmol/mL, pH 6.0; koruyucu madde) ve Östradiol-peptid- (Ru(bpy)3 2+) (Rutenyum kompleksi ile işaretli bir sentetik peptide bağlanmış östradiol, 2.75 ng/mL, MES buffer 50 mmol/L, pH 6.0; koruyucu madde) kullanıldı.

    P4 analizinde kullanılan testteki ölçüm aralığı 0.095- 191 nmol/L (alt ölçüm sınırı; 0.030 ng/mL, ana eğrinin maksimum değeri; 60.00 ng/mL) ve fonksiyonel duyarlılığı ise 0.48 nmol/mL (0.15 ng/mL) değerlerinde değişti. E2 analizinde kullanılan testeki ölçüm aralığı 18.4-15.781 pmol/L (alt ölçüm sınırı; 5.00 pg/mL, ana eğrinin maksimum değeri; 4300 pg/mL) ve fonksiyonel duyarlılığı ise 0.44 pmol/L (12 pg/mL) değerlerinde değişti.

    Her bir hayvandan elde edilen serumların RIA ve ECLIA yöntemlerine göre P4 ve E2 analizleri sonucunda elde edilen veriler SPSS 16.0 programında regresyon analiziyle karşılaştırıldı.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Kaynaklar
  • Bulgular
    Çalışmada değerlendirilen köpeklerin (n=25) %60’ının anöstrüste (n=15), %16’sının proöstrüste (n=4), %16’sının östrüste (n=4) ve %8’inin (n=2) diöstrüste oldukları belirlendi.

    Anöstrüs, proöstrüs, östrüs ve diöstrüs dönemlerinde bulunan köpeklerin RIA ve ECLIA yöntemlerine göre ortalama P4 ve E2 değerleri Tablo 1’de verilmektedir.


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Tablo 1: Seksüel siklusun farklı dönemlerinde RIA ve ECLIA yöntemleriyle elde edilen ortalama progesteron ve 17β-östradiol değerleri (± SEM).

    Sunulan çalışmada her bir hayvana ait serum örneğinin RIA ve ECLIA yöntemleri ile belirlenen P4 (ng/mL) değerlerinin birbirine benzer olduğu ve istatistiksel olarak önemli olduğu belirlendi (P<0.001; r=0.998) (Şekil 1). Aynı zamanda her bir hayvana ait serum örneğindeki E2 (pg/mL) değerlerinin de birbirine benzer olduğu ve istatistiksel olarak önemli olduğu belirlendi (P<0.001; r=0.998) (Şekil 2).


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Şekil 1: RIA ve ECLIA yöntemleri ile aynı örnekte ölçülen progesteron (ng/mL) değerleri. a=RIA (P<0.001; r=0.998)


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Şekil 2: RIA ve ECLIA yöntemleri ile aynı örnekte ölçülen 17β-östradiol (pg/mL) değerleri. a= RIA (P<0.001; r=0.998)

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Kaynaklar
  • Tartışma
    Köpeklerde kan P4 ve/veya E2 düzeylerinin tespiti, seksüel siklus tespiti ile ovaryum kökenli tümörler gibi patolojik olguların tespitinde kullanılan bir muayene yöntemidir. Kullanılan hormon analiz yönteminin kısa sürede en doğru ve ekonomik şekilde sonuç vermesi, teşhis için oldukça önemli bir kriterdir4-6.

    Anöstrüste, E2 konsantrasyonunun 8-15 pg/mL arasında değiştiği8, pik değerinin 17.2-97.7 pg/mL olduğu9, diöstrüs döneminde ise bazal seviyelerde bulunduğu belirtilmektedir10-12. Sunulan çalışmada vaginal sitoloji ile anöstrüs ve diöstrüs dönemlerinde olduğu belirlenen köpeklerin E2 düzeylerinin RIA ve ECLIA yöntemlerine göre sırasıyla 6.26 pg/mL ve 6.20 pg/mL ile 4.45 pg/mL ve 4.46 pg/mL olduğu belirlendi. Çalışmada elde edilen değerler diğer bildirimlerle8-12 uyumlu bulundu.

    Plazma E2 konsantrasyonunun erken folliküler evrede dereceli olarak arttığı13, östrüsün dördüncü gününde ise proöstrüsten daha düşük bir düzeyde (18 pg/mL) seyrettiği ifade edilmektedir. Ortalama E2 konsantrasyonun LH piki sırasında 44±9.2 pg/mL olduğu, sonra hızlı bir şekilde azalarak östrüsün sonunda (8.7±1.1 pg/mL) bazal seviyeye ulaştığı bildirilmektedir14. Sunulan çalışmada E2 düzeylerinin RIA ve ECLIA yöntemlerine göre sırasıyla proöstrüs dönemlerinde 19.34 pg/mL ve 19.28 pg/mL, östrüsde 9.06 pg/mL ve 9.11 pg/mL olduğu belirlendi. Sözü edilen dönemlerde gözlenen E2 düzeylerinin diğer çalışmalarla13,14 uyumlu olduğu gözlendi.

    Ortalama plazma P4 konsantrasyonun proöstrüsün son 12-48 saatinde bazal seviyede (<0,5 ng/mL) olduğu bildirilirken, proöstrüsün sonunda veya östrüsün başlangıcında yükseldiği aktarılmaktadır8,15-17. Sunulan çalışmada P4 düzeyleri proöstrüs döneminde RIA’de 1.14 ng/mL, ECLIA’de 1.20 ng/mL olduğu belirlendi. Araştırmada vaginal sitoloji verilerine göre proöstrüs döneminde olduğu belirlenen köpeklerin kan P4 düzeylerinin 0.5 ng/mL’den yüksek çıkması, araştırmacıların8,15-17 da bildirdiği şekilde köpeklerin geç proöstrüs döneminde olmasından kaynaklanabilir.

    LH pikinden önce 0.5 ng/mL’yi aşarak yükselmeye başlayan progesteron düzeyinin takip eden 15-25. günlerde artışına devam ettiği ve LH piki sonrası 20-25. günlerde 47±3.1 ng/mL’ye ulaştığı belirtilmektedir16,18-20. Bu çalışmada östrüste olan köpeklerde P4 düzeylerinin RIA ve ECLIA ile sırasıyla 15.68 ng/mL ve 15.44 ng/mL olduğu ve diğer dönemlere göre en yüksek P4 düzeylerinin tespit edildiği gözlendi. Köpeklerde, östrüsün P4 hormonu etkisi altında gerçekleşiyor olması21 da çalışmada elde edilen bulguları desteklemektedir.

    Progesteron pikinin genellikle ovulasyondan sonraki 20-30 günde elde edildiği ifade edilmektedir22. Sunulan çalışmada RIA ve ECLIA yöntemlerine göre diöstrüs döneminde olduğu belirlenen köpeklerin P4 düzeylerinin sırasıyla 3.68 ng/mL ve 3.59 ng/mL olduğu belirlendi. Bunun nedeninin ise vaginal sitoloji değerlendirmelerine göre köpeklerin diöstrüste oldukları belirlenmesine rağmen kan örneklerinin alındığı zamanın P4 düzeyinin yükselmeye veya düşmeye başladığı zaman ile uyum göstermesinden kaynaklandığı düşünülmektedir.

    Klinik uygulamalarda, P4 konsantrasyonu hakkında bilgi sahibi olmak, klinik ve endokrinolojik karşılaştırma sonrası kesin bir teşhise olanak sağlayabilmektedir23. P4 tespiti için kullanılan yarı kantitatif metotlar kan örneklerinin test edilmesine olanak vermelerine rağmen yeterli oranda doğruluğa ve güvenilirliliğe sahip değildirler24,25. RIA günümüzde hala önemini koruyan bir kantitatif metottur. Pratikte RIA’ler radioaktifi boşa harcama probleminin önlenmesi ve otomasyonun sağlanabilmesi amaçlarıyla sıklıkla analizörler üzerinde non-radio izotopik immunoassaylar ile yer değiştirmektedirler23.

    Sunulan çalışmada her bir hayvana ait serum örneğinin RIA ve ECLIA yöntemleri ile belirlenen P4 (Şekil 1) ve E2 (Şekil 2) değerlerinin birbirine benzer ve istatistiksel olarak önemli olduğu belirlendi (P<0.001; r=0.998). Anckaert ve ark.26 yaptıkları araştırmalarında kan P4 değerlerini MiniVidas ve ECLIA ile karşılaştırmış ve her ikisi arasında elde ettiği sonuçlar yönünden korelasyon gözlendiğini bildirmişlerdir. Chapwanya ve ark.6 kemoluminisens assay (Immulit) ve RIA yöntemleriyle köpeklerde kan P4 düzeylerini karşılaştırdıkları çalışmalarında immulit assay tekniğinin RIA ile benzer sonuçlar verdiğini belirtmektedirler. Bu çalışma da RIA yöntemiyle elde edilen sonuçların ECLIA yöntemiyle elde elden sonuçlarla istatistiksel olarak benzerlik gösterdiği tespit edildi.

    Sonuç olarak, ECLIA’in köpeklerde serum P4 ve E2 konsantrasyonlarının tespitinde kullanılan RIA yöntemi kadar doğru ve güvenilir bir yöntem olduğu kanısına varıldı. Bununla birlikte, veteriner hekimlerin ve akademisyenlerin bu tür steroid hormonların analizlerinde hem zaman hem de ekonomik yönden fayda sağlamaları nedeniyle ECLIA yönteminin RIA yönteminin yerini alacak bir yöntem olduğu düşünülmektedir.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Kaynaklar
  • Kaynaklar

    1) Tembhare DB. Techniques in Life Sciences: Radioimmunoassay of Hormones. Mumbai: Himalaya Publishing House, 2008.

    2) Kulmala S, Suomi J. Current status of modern analytical luminescence methods. Analytica Chemica Acta 2003; 500: 21-69.

    3) Concannon PW, Powers ME, Holder W. Pregnancy and parturition in the bitch. Biol Reprod 1977; 16: 427-431.

    4) Johnston SD, Root Kustritz MV, Olson PNS. Breeding Management and Artificial Insemination of the bitch. In: Johnston SD, Root Kustritz MV, Olson PNS. (Editors). Canine and Feline Theriogenology. Philadelphia: WB Saunders 2001: 41-65.

    5) Hannon W, Atkinson MA, Ball DJ, et al. Assessing the quality of immunoassay systems: Radioimmunoassays and enzyme, fluorescence, and luminescence immunoassay; approved guidelines. CLSI I/LA23-A 2004; 24: 1-36.

    6) Chapwanya A, Clegg T, Stanley P, Vaughan L. Comparision of the immulite and RIA assay methods for measuring peripheral blood progesterone levels in Greyhound bitches. Theriogenology 2008; 70: 795-799.

    7) Kutzler MA, Mohammed HO, Lamb SV, Meyers-Wallen VN. Accuracy of canine parturition date prediction from the initial rise in progesterone concentration. Theriogenology 2003; 60: 1187-1196.

    8) Feldman EC, Nelson RW. Canine female reproduction. In: Pedersen D. (Editor). Canine and Feline Endocrinology and Reproduction. 2nd Edition, Philadelphia: WB Saunders 1996: 399-475.

    9) Christiansen IBJ. Cytological examination of the vaginal smear. In: Christiansen IBJ. (Editor). Reproduction in The Dog and Cat. London: Bailliare Tindall 1984: 55-80.

    10) Edqvist LE, Johnsson EDB, Kasstrom H, Olsson SE, Richkind M. Blood plasma levels of progesterone and oestradiol in the dog during the oestrus cycle and pregnancy. Acta Endocrinol 1975; 78: 554-564.

    11) Hadley JC. Total unconjugated oestrogen and progestrone concentrations in peripheral blood during pregnancy in the dog. J Reprod Fertil 1975; 44: 453-460.

    12) Nett TM, Akbar AM, Phemister RD, et al. Levels of luteinizing hormone, estradiol an progesterone in serum during the estrous cycle and pregnancy in the Beagle bitch. Proc Soc Exp Biol Med 1975; 148: 134-139.

    13) de Gier J, Kooistra HS, Djajadiningrat-Laanen SC, Dieleman SJ, Okkens AC. Temporal relations between plasma concentrations of luteinizing hormone, folliclestimulating hormone, estradiol-17β, progesterone, prolactin, and α-melanocyte-stimulating hormone during the follicular, ovulatory, and early luteal phase in the bitch. Theriogenology 2006; 65: 1346-1359.

    14) Onclin K, Murphy B, Verstegen JP. Comparisons of estradiol, LH and FSH patterns in pregnant and nonpregnant beagle bitches. Theriogenology 2002; 57: 1957-1972.

    15) Concannon PW, Hansel W, Visek W. Pregnancy and parturation in the bitch. Biol Reprod 1975; 16: 517-526.

    16) Tsutsui T. Peripheral plasma gestagen levels during in the estrous cycle and pregnancy in the bitch. Jpn J Anim Reprod 1982; 31: 150-156.

    17) England GCW, Anderton DJ. Determination of progestogen concentrations in the vaginal fluid of bitches in oestrus. Vet Rec 1992; 130: 143-144.

    18) Concannon PW, Hansel W. Prostaglandin F2α induced luteolysis, hypotermia and abortions in the Beagle bitches. Prostaglandins 1977; 13: 533-542.

    19) England GCW, Allen WE, Porter DJ. A comparison of radioimmunoassay with quantitative and qualitative enzyme-linked immunoassay for plasma progestagen detection in bitches. Vet Rec 1989; 125: 107-108.

    20) Mestre J, Wanke M, Sucheyre S. Exfoliate vaginal cytology and plasma concentrations of progesterone, luteinizing hormone and oestradiol-17 β during oestrus in the bitch. J Small Anim Prac 1990; 31: 568-570.

    21) Alaçam E. Evcil Hayvanlarda Doğum ve İnfertilite. 5. Baskı. Ankara: Medisan Yayınevi, 2005.

    22) Johnston SD. Diagnostic and therapeutic approach to infertility in the bitch. JAVMA 1980; 176: 1335-1338.

    23) Brugger N, Otzdorff C, Walter B, Hoffmann B, Braun J. Quantitative determination of progesterone (P4) in canine blood serum using an enzyme-linked fluorescence assay. Reprod Dom Anim 2011; 46: 870-873.

    24) Laiblin C. Estrus detection in the bitch with a progesterone rapid test (EIA) – a senssible supplement to vaginal cytology. Tierärztl Prax 1991; 19: 197-199.

    25) Hospes R, Richter BR, Riesenbeck A, Bostedt H. Untersuchungen zur Zuverlässigkeit handelsüblicher Progesterone-Schnelltests in der gynäkologischen Diagnostik beim Hund. Tierärztl Prax 2004; 32: 247-251.

    26) Anckaert E, Mees M, Schiettecatte J, Smitz J. Clinical validation of a fully automated 17β-estradiol and progesterone assay (VIDAS) for use in monitoring assisted reproduction treatment. Clinl Chem Lab Med 2002; 40: 824-831.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Kaynaklar
  • [ Başa Dön ] [ Özet ] [ PDF ] [ Benzer Makaleler ] [ Yazara E-Posta ] [ Editöre E-Posta ]
    [ Ana Sayfa | Editörler | Danışma Kurulu | Dergi Hakkında | İçindekiler | Arşiv | Yayın Arama | Yazarlara Bilgi | E-Posta ]