Dondurulmuş Boğa Spermatozoonlarının Progresif Motilitesi, Kinematik Parametreleri ve Mitokondriyal Membran Potansiyeli Üzerine Vajinal Çözdürme Yönteminin Etkisi

Bu çalışmanın amacı, donmuş boğa spermasında iki farklı çözme yönteminin (inek vajinasında ya da ılık su banyosunda) çözülme sonrası spermatolojik parametreler üzerindeki etkilerini karşılaştırmaktı. Çalışmada dört adet Simental boğaya ait toplam kırk sekiz adet 0.25 mL'lik payet kullanıldı. Payetler ılık suda çözdürme (standart) yönteminde 38⁰C'deki su banyosunda 25 saniyede çözdürülürken, vajinal çözdürme yönteminde ineğin vajinasında 3 dakikada çözdürüldü. Çözdürülen boğa spermasının hareketlilik ve kinematik parametre değerleri bir bilgisayar destekli sperm analiz (CASA) sistemi kullanılarak değerlendirildi. Ayrıca spermatozoanın mitokondriyal membran potansiyeli Flow-sitometri ile belirlendi. Ilık su banyosunda çözdürülen örneklerle karşılaştırıldığında vajinal çözdürme yöntemi ile çözdürülen spermalarda; total motilite, yüksek mitokondriyal aktiviteye sahip spermatozoon oranı, hızlı spermatozoon oranı ve VCL önemli derecede daha düşük (P<0.05) iken, ölü spermatozoon oranı, LIN ve STR önemli derecede daha yüksekti (P<0.05). Bununla birlikte, progresif motilite, VAP, VSL, WOB, ALH, BCF açısından iki çözdürme yöntemi arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık yoktu (P>0.05). Sonuç olarak donmuş boğa spermasını doğrudan tohumlama kateterine yerleştirip ineğin vajinasında çözdürülmesi; çözdürme sonrası yeterli spermatolojik kalitenin elde edilmesini sağlayabilir. Bununla birlikte, bu yöntemi saha koşullarında kullanmadan önce, daha büyük popülasyonlardaki bireysel farklılıkların ve inkübasyon süresinin çözülme sonrası spermatolojik özellikler üzerindeki etkilerini belirlemek faydalı olabilir.

The objective of this study was to compare the effects of two different thawing methods (in the vagina of cow or in warm water bath) on post-thaw spermatological parameters in frozen bull semen. A total forty-eight-0.25 mL straws belonging four Simmental bulls were used in this study. While straws were thawed in a water bath at 38⁰C for 25 seconds in warm water thawing (standard) method, they were thawed in the vagina of cow by holding for 3 minutes in vaginal thawing method. Motility and kinematic parameter values of thawed bull semen were evaluated using a computer-assisted sperm analyzer (CASA). In addition, mitochondrial membrane potential of spermatozoa was determined by using flow-cytometry. While the total motility, the rate of sperm with high mitochondrial activity, the rate of rapid spermatozoon and VCL was significantly lower (P<0.05), the rate of dead spermatozoon, LIN and STR was significantly higher (P<0.05) in vaginal thawing method compared to samples thawed in warm water bath. However, there was no statistically significant difference between the two thawing methods in terms of progresif motility, VAP, VSL, WOB, ALH, and BCF (P>0.05). In conclusion, it can provide sufficient spermatological quality after thawing by placing frozen bull semen directly into the insemination catheter and thawing it in the cow's vagina. However, it may useful to determine the effects of individual differences in larger populations and incubation time on post-thaw spermatological characteristics before using this method in field conditions.

Giriş

Gliserolün kriyoprotektif etkisinin keşfedilmesinin ardından spermanın dondurulması alanında önemli gelişmeler kaydedilmiş ve özellikle boğa spermasının dondurularak uzun süreli olarak saklanabilmesindeki başarı; Dünya genelinde sığır yetiştiriciliği alanında yürütülen suni tohumlama uygulamalarının önemli ölçüde yaygınlaşmasını sağlamıştır[1,2]. Suni tohumlama yönteminin saha şartlarında etkin bir şekilde uygulanmaya devam etmesi, her şeyden önce yapılan uygulamalar sonucunda yeterli düzeyde gebelik oranı elde edilmesine bağlıdır. Başarılı bir fertilizasyonun gerçekleşebilmesi; spermatozoon ve ovumun dişi genital kanalda uygun yer, ortam ve zamanda karşılaşmasına bağlıdır. Bunun için spermatozoonların kendi hareket yetenekleri ile dişi genital kanalda ilerleyerek fertilizasyon bölgesine ulaşmaları gerekir. Bu sebeple ineklerde suni tohumlama uygulamalarında kullanılacak dondurulmuş boğa spermasının çözdürme sonrası kalitesinin belirli standartların üzerinde olması gerekir[3,4]. Çözdürülmüş bir payet içerisindeki spermanın spermatolojik özelliklerinin belirlenmesinde en yaygın olarak kullanılan yöntem; spermanın motilite oranının belirlenmesidir. Bunun yanında, spermatozoonların birtakım hareket özelliklerinin bilinmesi de spermatozoonların hareket çeşitliliğinin değişik yönlerden karşılaştırılması açısından önemlidir. Spermatozoonların hareket özelliklerinin doğru tespit edilmesinde, Bilgisayar Destekli Sperm Analiz (CASA) sistemleri önemli bir araçtır. Bu açıdan, CASA sistemleri sayesinde total ve progresif motilite değerleri ile birlikte çeşitli kinematik parametreleri de ayrıntılı bir şekilde incelenebilir [5,6].

Spermatozoonun kuyruk bölümünün orta kısmında bulunan mitokondriler, oksidatif fosforilizasyon yoluyla ATP üreterek kuyruğunun koordineli bir şekilde kamçısal hareket etmesini sağlarlar. ATP üretiminin devamlılığı için yüksek mitokondriyal membran potansiyeli gereklidir. Ancak spermatozoonların mitokondrilerinde oluşan bir hasar, ATP üretiminde ve dolayısıyla spermatozoon hareketliliğinde bir azalmaya yol açar. Bu nedenle, dondurulmuş spermadaki spermatozoonların çözdürme sonrası fizyolojik durumunu incelemek amacıyla hareket özelliklerinin yanında mitokondriyal membran potansiyelinin de belirlenmesi önemlidir. Bu açıdan spermatolojik muayeneler kapsamında özel floresan boyalar yardımıyla süspansiyon halinde bulunan spermatozoonların flow sitometri cihazının kılcal kanalı boyunca tek tek geçmesi sağlanarak mitokondriyal membran potansiyelinin değerlendirilmesi oldukça hızlı ve güvenilir bir şekilde yapılmaktadır [7-9].

Birçok türde dondurulmuş sperma ile yapılan suni tohumlama uygulamaları sonucu elde edilen gebe kalma oranları, doğal aşım sonucu elde edilen oranlara göre daha düşük olmasına rağmen, özellikle sığır yetiştiriciliğinde elde edilen sonuçların oldukça tatmin edici olması, bu türde suni tohumlama yönteminin kullanılabilirliği açısından önemli bir uygulama alanı oluşturmuştur. Bununla birlikte, sığırlarda suni tohumlama sonucu elde edilen gebelik oranlarını etkileyen en önemli faktörler arasında; hayvanın fizyolojik durumu, tohumlama zamanı, çevresel faktörler ve tohumlamada kullanılan spermanın kalitesi sayılabilir. Bu faktörler içinde suni tohumlama uygulamalarında kullanılacak dondurulmuş spermanın çözdürme sonrası kalitesinin yüksek olması oldukça önemlidir. Bu yüzden saha şartlarında kullanılan dondurulmuş boğa spermalarının, çözdürme sonrası belirlenen kalite standartlarını taşıması istenmektedir[10,11].

Dişi genital kanala aktarıldığı sırada kullanılan payetlerdeki dondurulmuş sperma kalitesinin düşük olması veya herhangi bir sebebe bağlı olarak azalması, suni tohumlama uygulamalarındaki başarı oranını düşürürken, aynı zamanda önemli bir ekonomik kaybın oluşmasına da yol açabilir[12,13]. Bu yüzden saha koşullarında yapılan uygulamalar sırasında, dondurulmuş sperma payetlerinin sıvı azot tankından alınmasından hayvana uygulanıncaya kadar geçen her aşama titizlikle ve kurallarına uygun bir şekilde yürütülmelidir. Bu uygulamalar içerisinde dondurulmuş sperman içeren payetlerin çözdürülme prosedürü ve çözüldükten sonra maruz kaldığı ortam oldukça önemli bir aşama olup spermatozoonların motilitesini ve hareket özelliklerini etkileyebilir [14]. Bu açıdan, çözdürme işlemi sırasında hatalı uygulamaların yapılması, en iyi şartlarda dondurulmuş kaliteli payetlerin bile çok düşük motilite sonuçları vermesine neden olabilir[15].

Günümüzde dondurulmuş sperma payetlerinin sıcak su banyosu içerisinde tutularak çözdürülmesi; pratikliği ve saha şartlarında uygulanabilirliği açısından günümüzde en iyi çözdürme yöntemi olarak kabul edilmektedir. Yapılan çalışmalarda[16-18] saha şartları düşünüldüğünde; dondurulmuş boğa sperması içeren 0.25 mL hacmindeki mini payetlerin 38⁰C’deki su banyosu içerisinde 25-30 saniyede çözdürülmesi tavsiye edilmektedir. Su banyosu sıcaklığının 38⁰C olmasının en önemli avantajı; kolay ayarlanabilmesi ve payetin bu sıcaklık derecesinde 25 saniyeden daha uzun bir süre tutulması durumunda bile spermanın sıcaklığının hayvanın vücut sıcaklığını aşamamasıdır[19]. Bu yöntemin dışında, dondurulmuş boğa sperması içeren payetin su banyosunda 22⁰C veya 28⁰C’de 25 saniye süre ile tutularak çözdürülmesi ya da payetin gömlek cebinde veya avuç içinde tutularak çözdürülmesi gibi yöntemler, hatalı çözdürme yöntemleri olarak kabul edilmekte olup çözdürme işleminden sonra yeterli motilitenin sağlanamaması nedeniyle pratik olarak kullanılması uygun görülmemektedir. Diğer taraftan, dondurulmuş sperma payetinin sıvı azot tankından alındıktan sonra ineğin vajinası içerisinde tutularak çözdürülmesi yönteminin sıcak su banyosunda çözdürme yöntemine göre özel koşullarda kullanılabilecek alternatif bir yöntem olarak önerildiği görülmektedir. Bu amaçla yapılan uygulamalar, tohumlanacak ineğin hemen yakınında bulundurulan sıvı azot tankından alınan payetin çok kısa bir sürede ineğin vajinası içerisine konularak belirli bir süre bekletilip çözdürülmesi şeklindedir. Ancak bu şekilde gerçekleştirilen çözdürmelerde normale yakın bir oranda motilite sağlanabilmesine rağmen, payetin aşırı soğuk olması tohumlanacak inekte stres faktörlerinin uyarılmasına neden olmaktadır. Bu sebeple, yöntemin kullanılması zorunlu bir hal alırsa, stres faktörlerini azaltmak için payetin işletmedeki bir başka ineğin vajinasında çözdürülmesi tavsiye edilmektedir. Ayrıca, payetin azot tankından alınmasından sonra uzun süre taşınmasını gerektiren bir ortam varsa bu yöntem önemli bir risk oluşturabilir[20,21].

Bu yöntemin modifiye edilmiş bir alternatifi ise; azot tankından alınan payetin suni tohumlama katateri içine direkt olarak yerleştirilip ucu kesildikten sonra pistole kılıfı takılarak hazırlanan kataterin, suni tohumlama yapılacak ineğin vajinasına hızlı bir şekilde yerleştirilip çözünmenin ineğin genital kanalında sağlanması şeklindedir. Bu şekildeki bir uygulamanın saha şartlarında denendiği bazı çalışmalarda[17,22] suda çözdürme yöntemiyle karşılaştırıldığında benzer gebelik oranları elde edildiği ileri sürülmektedir. Bu yöntem, diğer vajinal çözdürme yöntemine göre sıvı azotun soğutucu etkisinden hayvanın strese girmesini önlediği gibi aynı zamanda sıcaklığın sabit kalması ve stabil bir çözünme sağlanması açısından da bir avantaj sağlayabilir. Bununla birlikte, kataterin hazırlanması ve hayvana uygulanma süresi içinde gerçekleşen çözünme hızı elde edilecek sperma kalitesini olumsuz yönde etkileyebilir. Yapılan saha çalışmalarında[17,22] vagina içinde çözdürme yönteminin çözdürme sonrası spermatolojik özellikleri etkilenme düzeyi hakkında ayrıntılı bir veriye rastlanmamıştır. Bu açıdan, soğuk tohumlama olarak adlandırılan ve alternatif bir çözdürme yöntemi olarak düşünülen vajinal çözdürme yönteminde, payetlerdeki spermatozoonların başlangıç total ve progresif motilite değerleri, yüksek mitokondriyal membran potansiyeli ve kinematik parametrelerinin etkilenme düzeyinin bilimsel yöntemlerle ortaya koyulması, saha uygulamalarında kullanılabilirliğinin belirlenmesi açısından oldukça faydalı olacaktır. Ayrıca payetler içerisinde dondurulmuş boğa spermalarının vajinal yöntemle çözdürülmesi neticesinde normal standart protokol olan su banyosunda çözdürme yöntemine benzer bir spermatolojik başarı sağlanırsa; suni tohumlama öncesi yapılan hazırlıklara daha pratik bir uygulama şekli kazandırılarak pozitif bir etki sağlanabilir.

Bu bilgiler ışığında yürütülen bu çalışma, vajinal çözdürme yöntemi ile su banyosunda çözdürme yönteminin dondurulmuş boğa spermatozoonlarının çözdürme sonrası total ve progresif motilitesi ile kinematik parametreleri ve mitokondriyal membran potansiyeli üzerine etkilerinin karşılaştırılması amacıyla yapıldı.

Gereç ve Yöntem

Araştırma ve Yayın Etiği: Çalışma için Fırat Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu (FÜHADYEK)’ndan onay alındı (Tarih: 22.03.2023 - Protokol No: 2023/05-06).

Araştırmanın Yeri: Araştırmanın hayvan üzerinde yapılan deneysel aşamaları; Fırat Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Hayvan Hastanesi, Suni Tohumlama Uygulama biriminde yapılırken, laboratuvar muayene ve analizleri ise Fırat Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Dölerme ve Suni Tohumlama Anabilim Dalı Androloji Laboratuvarında gerçekleştirildi.

Hayvan Materyali: Araştırmada materyal olarak her grup için Simental ırkından 4 farklı damızlık boğaya ait farklı zamanlarda üretilmiş dondurulmuş sperma örneklerinden 6 adet payet olmak üzere her iki çözdürme yöntemi için toplam 48 payet kullanıldı. Gobletler içerisinde temin edilen 0.25 mL’lik payetler, araştırma süresince sıvı azot tankındaki sıvı nitrojen içerisinde (-196⁰C’de) muhafaza edildi. Araştırma sırasında, dondurulmuş sperma payetlerinin vajinada çözdürülmesi amacıyla; hayvan materyali olarak 3-4 yaşlarında genel sağlık durumu iyi ve herhangi bir reprodüktif problemi olmayan bir inek kullanıldı.

Deneysel Aşama: Dört boğa için dondurulmuş sperma içeren payetler; kontrol grubu (n=24) ve araştırma grubu (n=24) olarak iki gruba ayrıldı. Kontrol grubundaki payetler; sıvı azot tankından alınıp 38⁰C’de hazırlanmış su banyosu içinde 25 saniye süreyle bekletilerek çözdürüldü. Sürenin sonunda su banyosundan alınıp bir peçete ile kurulanan payetler, suni tohumlama kataterine yerleştirilerek üzerine pistole kılıfı takılıp normal prosedürlere uygun şekilde hazır hale getirildi. Bu işlemin ardından katater, hazır tutulan bir ineğin vajinası içerisine yerleştirilerek 3 dakika boyunca sabit olarak tutuldu. Araştırma grubundaki payetler ise; sıvı azot tankından alınıp doğrudan suni tohumlama kataterine yerleştirildi. Bunun ardından bir makas yardımıyla ucu kesilen payetlerin üzerine pistole kılıfı geçirildi. Hazır hale getirilen katater, hızlı bir şekilde (10 saniyeden daha az bir sürede) hazır tutulan ineğin vajinası içerisine sokuldu. Katater, cervixin hemen önüne kadar ilerletilip burada 3 dakika boyunca tutularak donmuş spermanın vajina sıcaklığında (38.4⁰C’de) çözünmesi sağlandı. Her iki grup için de, tamamlanan inkübasyon süresinin ardından hayvanın vajinasından çıkartılan katater içerisindeki sperma, 37⁰C’ye ısıtılmış bir ependorf tüpüne aktarılıp sıcaklığı korunarak hızlı bir şekilde muayene laboratuvarına nakledildi. Bunu takiben, laboratuvarda gerekli spermatolojik muayene ve analizler gerçekleştirilerek sonuçlar kaydedildi.

Spermatolojik Muayene ve Analizler
Motilite Değerleri ve Kinematik Parametreleri:
Sperma örneklerine ait total ve progresif motilite değerleri ile kinematik parametreleri Bilgisayar Destekli Sperm Analiz (CASA) cihazıyla (ISASv1.2, Proiser®) belirlendi. Alınan sperma örneği, özel bir sperma sulandırıcısı (Bioxcell) ile 1:10 oranında sulandırıldıktan sonra 3 μL alınarak özel lam (Spermtrack 20 μm) üzerine damlatılıp lamel kapatıldıktan sonra sistemine bağlı faz-kontrast mikroskobun 37⁰C’ye sabitlenmiş ısıtma tablalı sehpasına yerleştirildi. Ardından programın motilite modülündeki görüntü sistemi üzerinden en az 5 farklı saha incelenerek ortalama değerler kaydedildi. Bu muayene esnasında total ve progresif motilite değerleri ile birlikte spermatozoonların hareket özelliklerine bağlı olarak oluşan kinematik parametrelerine ait değerlerden VCL (Eğrisel yol hızı-μm/s), VAP (Ortalama yol hızı-μm/s), VSL (Doğrusal yol hızı-μm/s), LIN (Doğrusallık oranı-%), STR (Gidiş doğrultusu-%), WOB (Yalpalama oranı-%), ALH (Başın yer değiştirme genliği-μm/s) ve BCF (Başın çapraz geçişi–Hz) (Şekil 1) tespit edildi. Bunun yanında spermatozoonlar hız değerlerine göre; hızlı hareket eden spermatozoonlar (hızlı), orta hızda hareket eden spermatozoonlar (orta), yavaş hareket eden spermatozoonlar (yavaş) ve hareket etmeyen spermatozoonlar (hareketsiz-ölü) şeklinde sınıflandırıldı (yavaş ˂ 25 μm ˂ orta ˂ 50 μm ˂ hızlı) (23).

Yüksek Mitokondriyal Membran Potansiyeli: Yüksek mitokondriyal membran potansiyeline sahip spermatozoonların oranı, floresan bir boya olan JC-1 (T3168, ThermoFisher Scientific, USA) ayracı ile floresan boyama tekniği kullanılarak Flow sitometri cihazı (Cytoflex, Beckman Coulter®, USA) yardımıyla belirlendi. Muayene sırasında 1:4 oranında fosfat buffer sulandırıcısı ile sulandırılmış sperma örneklerinden 100 μL alınarak 37⁰C’de tutulan 0.5 mL’lik mikro tüplere konuldu. Bu sperma örneklerinin üzerine 2.5 μL JC-1 ilave edilerek 37⁰C’de 30 dakika süreyle karanlık bir ortamda inkübe edildi. Bu sürenin tamamlanmasının ardından floresan boya ilave edilmiş sperma solüsyonu Flow sitometri cihazındaki özel bölmeye yerleştirilerek gerekli sayım analizleri yapıldı. Oluşan grafiklerde (Şekil 2) spermatozoonlar boya alma özelliklerine göre değerlendirilip yüksek ve düşük mitokondriyal potansiyele sahip olanlar şeklinde orantısal (%) olarak sınıflandırıldı (24).

İstatistiki Analiz: İstatistiki analizler için SPSS (Version 22.0) istatistik programı kullanıldı. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunuldu. Verilerin değerlendirilmesi amacıyla öncelikle normallik testi uygulandı. Normal değer gösteren veriler için gruplar arası farklılıkların belirlenmesi amacıyla t-testi kullanıldı. Diğer taraftan nonparametrik değer gösteren veriler için ise Mann-Whitney-U testi kullanıldı. Tüm analizlerde P değerinin 0.05’den daha küçük olduğu durumlar istatistiksel açıdan önemli olarak kabul edildi.

Bulgular

Yapılan çalışmada dondurulmuş sperma örneklerinin iki farklı çözdürme yöntemi kullanılarak çözdürülmesi sonrası belirlenen total ve progresif motilite değerleri ile ortalama yüksek mitokondriyal aktiviteye sahip spermatozoon oranları Tablo 1’de sunuldu. Sunulan değerler incelendiğinde; vajinal yöntemle çözdürülen spermalarda sıcak suda çözdürülen örneklere göre çözdürme sonrası ortalama total motilite ve yüksek mitokondriyal membran potansiyeline sahip spermatozoon oranında önemli derecede bir azalma olduğu (P<0.05) belirlenirken, progresif motilite değeri açısından ise çözdürme yöntemleri arasında istatistiki yönden önemli derecede bir farklılık olmadığı (P>0.05) tespit edildi.

Sunulan çalışmada dondurulmuş sperma örneklerinin iki farklı çözdürme yöntemleri kullanılarak çözdürülmesi sonrası belirlenen hız ölçüt değerlerinin oransal dağılımı Tablo 2’de gösterildi. Buna göre, vajinal yöntemle çözdürülen spermalarda sıcak suda çözdürülen örneklere göre çözdürme sonrası hızlı hareket eden spermatozoon oranının önemli derecede (P<0.05) düşük olduğu ve ölü spermatozoon oranının ise önemli derecede (P<0.05) yüksek olduğu belirlendi. Bununla birlikte, çözdürme yöntemleri arasında diğer hız ölçütlerinin (orta hızlı-yavaş) oransal dağılımı açısından önemli derecede bir farklılık oluşmadığı (P>0.05) bulundu.

Yapılan çalışmada dondurulmuş sperma örneklerinin iki farklı çözdürme yöntemi kullanılarak çözdürmesi sonrası belirlenen ortalama kinematik parametre değerleri Tablo 3a ve b’de sunuldu. Verilen değerlere göre, vajinal yöntemle çözdürülen spermalarda sıcak suda çözdürülen örneklere göre çözdürme sonrası ortalama VCL değerinin önemli derecede (P<0.05) düşük olduğu belirlendi. Bununla birlikte, diğer hız değerleri olan VAP ve VSL değerleri ile başın yayılım genişliği olan ALH değerlerinin çözdürme yöntemleri arasında benzerlik gösterdiği (P>0.05) görüldü.

Diğer taraftan hız değerlerine göre hesaplanan ve spermatozoon hareketlerinin doğrusallığını gösteren LIN ve STR değerlerinin çözdürme sonrası vajinal yöntemle çözdürülen spermalarda, sıcak suda çözdürülen örneklere göre önemli derecede (P<0.05) yüksek olduğu dikkati çekti. Bununla birlikte, spermatozoon başının yalpalama şiddeti olan WOB değeri ile başın geçiş frekansı olan BCF değeri açısından çözdürme yöntemleri arasında her hangi bir farklılık (P>0.05) tespit edilmedi.

Tartışma

Yapılan çalışmada, vajinal yöntemle çözdürülen dondurulmuş boğa spermalarında sıcak suda çözdürülen örneklere göre çözdürme sonrası ortalama statik (ölü) spermatozoon oranının önemli derecede arttığı gözlenirken, buna uyumlu olarak ortalama total motilite değerinin de önemli derecede azaldığı (%67.8 - %81.0; P<0.05) belirlenmiştir. Bununla birlikte, çözdürme sonrası ortalama progresif motilite değeri açısından kullanılan iki yöntem arasında istatistiki yönden önemli derecede bir farklılık oluşmadığı (%48.2 - %50.9; P>0.05) dikkati çekmiştir. Dondurulmuş sperma payetlerinin çözdürme sonrası kalite standartlarını tespit etmek için motilite oranlarının belirlenmesi oldukça önemlidir. Spermanın motilitesinin belirlenmesinin temel amacı; spermatozoon hareket çeşitleri ve bunların kapsadığı oranları tespit etmektir. Spermatozoonlar hareket çeşitlerine göre genel olarak 5 grup altında incelenirler. Bunlar; herhangi bir yönde hızlı ve güçlü hareket eden (progresif), herhangi bir yönde ama yavaş hareket eden, yerinde sallanan, kendi ekseni etrafında dönme şeklinde hareket eden ve hareketsiz (ölü/statik) olan spermatozoonlardır. Total motilite oranı; muayene yapılan spermada hangi oranda hareketli ya da hareketsiz spermatozoon bulunduğunun bir göstergesidir. Ancak bu oran içerisinde çok yavaş ilerleyen, kendi etrafında dönen veya olduğu yerde titreme ya da sallanma hareketi yapan spermatozoonların hareketlerinde doğrusallık özelliği olmadığı için hızlı hareket etseler bile fertilite yetenekleri düşüktür. Bu yüzden, yapılan muayenelerde total motilitenin yanında progresif spermatozoon oranın da belirlenmesi oldukça önemlidir [1,21]. Progresif motilite, spermatozoonun dişi üreme kanalındaki ileriye doğrusal hareketi için gerekli olup aynı zamanda fertiliteyle de önemli derecede ilişkilidir. Bu yüzden, motilite belirlenirken, total motiliteye göre özellikle progresif motilite oranı daha belirleyici bir rol oynamakta olup CASA sistemi ile yapılan analizlerde progresif motilitenin %35’in üzerinde olması gerektiği vurgulanmaktadır[5,25]. Ayrıca Ülkemizde Tarım ve Orman Bakanlığı’nın gerek yurt dışından getirilen gerekse de ülkemizde üretilen dondurulmuş boğa spermasının satışa sunulabilmesi için CASA sistemi ile yapılan motilite değerlendirmelerinde total motilitenin %40’ın üzerinde olması ve payet içerisinde en az 7 milyon motil spermatozoon şartı aranmaktadır[26]. Yürütülen çalışmada dondurulmuş boğa spermasının iki farklı yöntemle çözdürülmesi sonrası elde edilen sonuçlar değerlendirildiğinde, total motilite oranları arasında önemli bir farklılık belirlenmesine rağmen bulunan değerlerin belirtilen referans değerlerinin üzerinde olduğu, bunun yanında benzer bulunan progresif motilite oranlarının da yüksek olması nedeniyle suni tohumlama uygulamalarında bu spermaların kullanılabileceği görülmektedir.

Spermatozoonların hareket yeteneklerinin devamı için gerekli olan enerji (ATP), yapısında bulunan mitokondriler tarafından oksidatif fosforilizasyon yoluyla üretilmektedir. İç mitokondriyal membran üzerinde oldukça kompleks bir yapıya sahip olup bu bölgede bulunan metabolitler, burada bulunan alt birimlerden geçerek enerji üretiminde kullanılırlar. Elektron transfer zincirinin son proteini olan Sitokrom C, Kompleks III’den aldığı elektronları sitokrom oksidaza indirgeyip kompleks IV’e geçirerek kompleks V’de ATP üretilmesini sağlar. Sitokrom C proteini normal şartlarda sağlam mitokondriyal membrandan dışarı çıkamaz. Ancak, sıcaklığın aniden düşmesine bağlı olarak spermatozoonun soğuk şokuna uğraması sonucu mitokondriyal membranın yapısının değişmesi ve geçirgenliğinin artması, sitokrom C düzeyinin sızmaya bağlı olarak düşmesine ve bunun sonucunda da mitokondriyal membran potansiyelinin azalmasına neden olabilir[27,28]. Nitekim Forero Gonzales ve ark.[29] dondurulup çözdürülmüş boğa spermasında, çözdürme sonrası mitokondriyal membran potansiyelinde bir azalmanın oluştuğunu ve bu durumun kriyoprezervasyon sırasında şekillenen soğuk şoku nedeniyle spermatozoonların mitokondriyal membran zarlarının lipit ve protein faz değişikliği sonucunda kararsız hale gelmesinden kaynaklandığını bildirmişlerdir. Diğer taraftan, Khalil ve ark.[30] ise dondurulmuş boğa spermasının çözdürme sonrası mitokondriyal membran potansiyelinde %15 oranında düştüğünü, bu durumun ise genel olarak kabul edilebilir sınırlar içerisinde kaldığını belirtmiştir. Yapılan çalışmamızda, vajinal yöntemle çözdürülen dondurulmuş boğa spermalarında sıcak suda çözdürülen örneklere göre çözdürme sonrası ortalama yüksek mitokondriyal aktiviteye sahip spermatozoon oranında önemli derecede bir azalma olduğu (P<0.05) belirlenmiştir. Yüksek mitokondriyal membran potansiyeline sahip spermatozoon oranındaki azalmanın total motilite değerlerinde belirlenen azalma ile benzer düzeyde olduğu görülmekle birlikte, bu düşüşün progresif motilite sonuçlarını etkilemediği görülmektedir. Bu sonuç, mitokondriyal membran potansiyelindeki aktivite azalmasının daha çok progresif motilite yeteneğine sahip olmayan spermatozoonlarda meydana geldiği şeklinde açıklanabilir.

Yapılan çalışmada spermatozoonlar hız değerlerine göre sınıflandırıldığında, çözdürme yöntemleri arasında orta hızlı ve yavaş hareket eden spermatozoon oranları yönünden önemli derecede bir farklılık oluşmadığı (P>0.05) görülürken, vajinal yöntemle çözdürülen spermalarda sıcak suda çözdürülen örneklere göre çözdürme sonrası hızlı hareket eden spermatozoon oranının önemli derecede (P<0.05) düşük olduğu ve bu düşüşün ölü (hareketsiz) spermatozoon oranındaki artışla paralellik gösterdiği belirlenmiştir. Elde edilen bu veriler, vajinal çözdürme yönteminin sıcak suda çözdürme yöntemine göre hızlı hareket eden spermatozoon oranında %10-15 oranında bir azalmaya yol açtığını göstermektedir. CASA sistemlerinde progresif motilitenin belirlenmesi özel bir sınıflandırma sistemi ile yapılmaktadır. Bu sistemde spermatozoonlar hem hareket hızlarına (50 μm ˂ hızlı) hem de hareketleri sırasında izledikleri yolun doğrusallık düzeyine göre (0.80 ˂ STR veya LIN) değerlendirilip referans değerlerin üzerinde değer taşıyan spermatozoonlar progresif olarak sınıflandırılırlar[31]. Elde edilen bulgular değerlendirildiğinde, dondurulmuş boğa spermasının su banyosunda çözdürülmesi yöntemi vajinal çözdürme yöntemine göre daha hızlı bir çözünme ortamı oluşturduğu için hızlı hareket eden spermatozoon oranının artmasına yol açmış olabilir. Ayrıca her iki yöntem arasında progresif motilite oranının benzer olması, su banyosunda çözdürülen payetlerdeki spermatozoonların hız değerleri yüksek olmasına rağmen progresif hareket özelliğine sahip olmadığını göstermektedir.

Yapılan çalışmada, vajinal yöntemle çözdürülen spermalarda sıcak suda çözdürülen örneklere göre çözdürme sonrası ortalama VCL değerinin önemli derecede (P<0.05) düşük olmakla beraber, ortalama VAP ve VSL değerlerinin çözdürme yöntemleri arasında benzerlik gösterdiği (P>0.05) görülmüştür. Kinematik parametre değerleri açısından VAP değeri, spermatozoonun hareket özelliğinin belirlenmesi açısından oldukça önemlidir. Nitekim Nagy ve ark.[32] CASA sistemi yardımıyla belirledikleri spermatozoonların kinematik parametre değerleri ile bu spermalarla yaptıkları tohumlamalar sonucunda elde ettikleri gebelik sonuçlarını değerlendirdiklerinde, kinematik parametreler açısından özellikle VAP değerinin fertilitenin tahmin edilmesinde en kullanışlı parametre olduğunu bildirilmişlerdir. Benzer şekilde Robayo ve ark. [33], koç spermatozoonlarının motilite ve kinematik parametrelerinin CASA’da belirlenmesinin ardından servikal mukustaki hareket yeteneklerini inceledikleri çalışmalarında, spermatozoonların koyun servikal mukusunda ilerleyişi ile VAP değerlerinin arasında pozitif yönde bir ilişkinin olduğunu tespit etmişlerdir.

Sunulan çalışmada, hız değerlerine göre hesaplanan ve spermatozoon hareketlerinin doğrusallığını gösteren LIN ve STR değerlerinin vajinal yöntemle çözdürülen spermalarda, sıcak suda çözdürülen örneklere göre önemli derecede (P<0.05) yüksek olduğu gözlenmiştir. Bu durum, sıcak suda çözdürülen örneklere göre vajinal yöntemle çözdürülen spermalarda, VCL değerinin düşük olmasına rağmen VAP ve VSL değerinin birbirine benzer olmasından kaynaklanmaktadır. Spermatozoonun doğrusal olmayan hareketlerinde VAP değeri VSL’ye göre oldukça yüksek iken, düzenli ve düz bir hat üzerinde devam eden spermatozoon hareketinde VAP değeri genellikle VSL’ye çok yakındır. Sunulan değerler incelendiğinde, vajinal yöntemle çözdürülen spermalarda spermatozoonların doğrusal hareket etme oranlarının sıcak suda çözdürülenlere göre daha yüksek bir potansiyel taşıması dikkat çekicidir. Diğer taraftan, başın yayılım genişliği olan ALH ile yalpalama şiddeti olan WOB değerinin ise çözdürme yöntemleri arasında farklılık göstermediği (P>0.05) tespit edilmiştir.

Kaczyk[22], su banyosunda çözdürme yöntemi ile payetin doğrudan tohumlama kataterine yerleştirilerek ineğin vajinasında çözdürülmesi yöntemini karşılaştırmak amacıyla yaptığı çalışmasında, sperma kalitesi açısından motilite yönünden bir fark olmadığını belirtirken, senkronize edilen besi sığırlarında iki yöntemle çözdürülen dondurulmuş spermalarla yapılan tohumlamalarda ise gebe kalma oranlarının benzer olduğunu belirlemiştir. Benzer şekilde, Koch ve ark.[17], süt ineklerinin suni tohumlama uygulamalarında kullanılan dondurulmuş boğa sperması içeren payetlerin çözdürülmesinde farklı yöntemlerin kullanılmasının gebe kalma oranı üzerindeki etkisini araştırmak amacıyla yaptıkları çalışmalarında, 38⁰C sıcaklıktaki su banyosunda çözdürülerek tohumlanan ineklerin gebelik oranı (87/348; %28) ile doğrudan ineğin vajinasında çözdürülerek tohumlanan hayvanların gebelik oranları (85/385; %32) arasında önemli bir farklılığın gözlenmediğini bildirmişlerdir. Vajinal ve su banyosunda çözdürme yöntemi kullanılarak suni tohumlama uygulamaları yapılan bu çalışmalarda elde edilen gebelik sonuçlarının benzer olması, çalışmamızda belirtilen dondurulmuş boğa spermasının çözdürme sonrası spermatolojik özellikleri üzerine her iki çözdürme yöntemi arasında ortaya çıkan farklılıkların elde edilecek gebelik oranlarını olumsuz yönde etkileyecek düzeyde olmadığı görüşünü desteklemektedir.

Dondurulmuş sperma payetlerinin çözdürülmesinden tohumlanacak ineğin genital organına nakledilinceye kadar geçen zaman içerisinde farklı sıcaklık değişimlerine maruz kalması, spermatozoonların hareket yeteneklerini ve yaşam süresini olumsuz yönde etkileyebilir. Bunun önlenmesindeki etkin yollardan birisi donmuş spermanın stabil sıcaklık derecesine sahip olan vajina içerisinde çözünmesinin sağlanmasıdır. Buna ilaveten, vajinal çözdürme yönteminde diğer standart çözdürme yöntemi olarak kabul edilen su banyosu içerisinde çözdürme yöntemine göre sıcak suya ihtiyaç duyulmaması, payetin çözdürülmesi ve kataterin hazırlanması sırasındaki kritik protokollerden etkilenmemesi gibi avantajlarından dolayı saha koşullarında geniş sayıda tohumlamaların yapıldığı işletmeler açısından daha pratik bir uygulama rahatlığı sağlayabilir. Ayrıca vajinal çözdürme yöntemi, saha şartlarındaki suni tohumlama uygulamalarında inek başına geçen sürenin de daha kısa olmasını sağlayacaktır. Bununla birlikte, suni tohumlama tankından alınan payetin gerekli kontroller yapılamadan katatere yerleştirilmesi, payetin kesimi esnasında sperma seviyesinin görülememesi ve kataterin hazırlanmasından ineğin vajinasına yerleştirilinceye kadar geçen sürenin herhangi bir sebeple uzaması gibi durumlar vajinal çözdürme yöntemi sonrası elde edilecek sperma kalitesini olumsuz yönde etkileyebilecek risk faktörleri olarak sıralanabilir. Ayrıca bu yöntem uygulanırken, çözdürme işleminin tohumlanacak hayvana çok yakın bir yerde yapılması zorunluluğu, kataterin hazırlandıktan sonra belirli bir alana taşınması ihtimalini de ortadan kaldırmaktadır.

Sonuç olarak, payetler içerisinde dondurulmuş boğa spermasının doğrudan tohumlama kataterine yerleştirilerek ineğin vajinasında çözdürülmesi (soğuk tohumlama) yönteminin payetlerin su banyosunda çözdürülmesi yöntemine göre çözdürme sonrası progresif motilite oranını etkilemediği tespit edilirken, total motilite, yüksek mitokondriyal aktiviteye sahip spermatozoon oranı ve hızlı spermatozoon oranı yönünden bir azalmaya yol açtığı gözlenmiştir. Ancak belirlenen bu farklılıklara rağmen elde edilen değerlerin spermanın suni tohumlama uygulamalarında kullanılabilirliği açısından kabul edilebilir referans sınırları içerisinde olduğu belirlenmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemin saha koşullarında bilimsel olarak rahatlıkla kullanılabilmesi için daha geniş bir popülasyonda çalışılarak, kullanılan yöntemlere göre spermatolojik özelliklerin bireysel farklılıklardan ve çözdürme sonrası inkübasyon süresinden etkilenme düzeyinin de belirlenmesi faydalı olacaktır.

References

1. Hafez ESE, Hafez B. Reproduction in Farm Animals. 7th Edition, London: Blackwell Publishing, 2013.
2. Holt WV. Basic aspects of frozen storage of semen. Reprod Sci 2000; 62: 3-22.
3. Bearden HJ, Fuquay JW, Willard ST. Applied Animal Reproduction. 6th Edition, New Jersey: Pearson Prentice Hallm, 2004.
4. Shukla M. Applied Veterinary Andrology and Frozen Semen Technology. 1st Edition, New India Publishing Agency, New Delhi; 2011.
5. Kathiravan P, Kalatharan J, Karthikeya G et al. Objective sperm motion analysis to assess dairy bull fertility using computer-aided system - A review. Reprod Domest Anim 2011; 46: 165-172.
6. Amann RP, Waberski D. Computer-assisted sperm analysis (CASA): Capabilities and potential developments. Theriogenology 2014; 81: 5-17.
7. Moraes CR, Meyers S. The sperm mitochondrion: Organelle of many functions. Anim Reprod Sci 2018; 194: 71-80.
8. Paoli D, Gallo M, Rizzo F, et al. Mitochondrial membrane potential profile and its correlation with increasing sperm motility. Fertil Steril 2011; 95: 2315-2329.
9. Cossarizza A, Salvioli S. Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC‐1. Curr Protoc Cytom 2000; 13: 1-7.
10. Watson PF. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Reprod Sci 2000; 60-61: 481-492.
11. Loomis P. “What is progressive motility?”. http://info.selectbreeders.com/blog/bid/ 152768/What-Is-Progressive-Motility, 04.06.2021.
12. Barth AD. Factors affecting fertility with artificial insemination. Vet Clin North Am Food Anim Pract 1993; 9: 275-289.
13. Amann RP, Hammerstedt RH. In vitro evaluation of sperm quality: an opinion. J Androl 1993; 14: 397-406.
14. Nur Z, Ak K. Donmuş spermanın saklanması ve eritilmesi. Uludag Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi 2003; 22: 97-102.
15. Nur Z, Dogan I, Soylu MK, Ak K. Effect of different thawing procedures on the quality of bull semen. Revue Med Vet 2003; 154: 487-490.
16. Chaiprasat S, Benjakul W, Chartchue A. Effect of bull semen thawing methods on sperm progressive motility. Chiang Mai Vet J 2006; 4: 25-29.
17. Koch J, Weber LP, Heppelmann M, et al. Effect of different thawing methods for frozen bull semen and additional factors on the conception rate of dairy cows in artificial insemination. Animals 2022; 12: 2330, 1-17.
18. Kaya A, Çoyan K, Yıldız C, Ataman MB. Dondurulmuş boğa spermasını değişik ısı ve sürelerde çözdürmenin spermatolojik özellikler ve payet iç ısısı üzerine etkisi. Hayvancılık Araştırma Dergisi 1998; 8(1-2): 29-33.
19. Barth AD, Bowman PA. Determination of the best practical method of thawing bovine semen. Can Vet J 1988; 29: 366-269.
20. Çoyan K, Tekeli T. İneklerde Suni Tohumlama. Konya: Bahçıvanlar Basım; 1996.
21. Sönmez M. Veteriner Hekimlikte Reprodüksiyon, Suni Tohumlama ve Androloji Ders Notları. Fırat Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Dölerme ve Suni Tohumlama Anabilim Dalı, Elazığ, 2022.
22. Kaczyk BL. A comparison of semen thawing for artifıcial insemination in cattle. Master’s Thesis, MIR Center, Angelo State University San Angelo, Texas, USA, 2011.
23. Krause W. Computer-assisted semen analysis systems: Comparison with routine evaluation and prognostic value in male fertility and assisted reproduction. Hum Reprod 1995; 10: 60-66.
24. Kanno C, Kang SS, Kitade Y, et al. Simultaneous evaluation of plasma membrane integrity, acrosomal integrity, and mitochondrial membrane potential in bovine spermatozoa by flow cytometry. Zygote 2016; 24: 529-536.
25. Li Y, Kalo D, Zeron Y, et al. Progressive motility-a potential predictive parameter for semen fertilization capacity in bovines. Zygote 2016; 24: 70-82.
26. Tarım ve Orman Bakanlığı. “Cinsiyeti belirlenmemiş dondurulmuş boğa sperması raporu”. https://tarimorman.gov.tr/HAYGEM/Belgeler/Hayvanc%C4%B1l%C4%B1k/%C4%B0thalat%C4%B0hracat/DONDURULMU%C5%9E%20SPERMA%20%C4%B0HTALATI/RAPORLAR/Cinsiyeti%20Belirsiz%20Sperma%20Raporlama.xls / 10.6.2023.
27. Eljarah AH. Effects of Cryopreservation and Constituents of Semen Extenders on Mitochondrial Function of Bull Spermatozoa. PhD Thesis, Louisiana State University and Agricultural & Mechanical College USA, 2007.
28. Gillick K, Crompton M. Evaluating cytochrome c diffusion in the intermembrane spaces of mitochondria during cytochrome c release. J Cell Sci 2008; 121: 618-626.
29. Forero-Gonzalez RA, Celeghini ECC, Raphael CF, et al. Effects of bovine sperm cryopreservation using different freezing techniques and cryoprotective agents on plasma, acrosomal and mitochondrial membranes. Andrologia 2012; 44: 154-159.
30. Khalil WA, El-Harairy MA, Zeidan AEB, et al. Evaluation of bull spermatozoa during and after cryopreservation: Structural and ultrastructural insights. Int J Vet Sci Med 2018; 6: 49-56.
31. Sönmez M, Fırat F. Bilgisayar destekli sperma analiz (CASA) sistemiyle yapılan incelemelerde spermatozoonların motilitesini ve kinematik değerlerini etkileyen faktörler. Fırat Üniversitesi Sağlık Bilimleri Veteriner Dergisi 2022; 36: 153-164.
32. Nagy A, Polichronopoulos T, Gaspardy A, et al. Correlation between bull fertility and sperm cell velocity parameters generated by computer-assisted semen analysis. Acta Vet Hung 2015; 63: 370-81.
33. Robayo I, Montenegro V, Valdes C, et al. CASA assessment of kinematic parameters of ram spermatozoa and their relationship to migration efficiency in ruminant cervical mucus. Reprod Dom Anim 2008; 43: 393-399.