Echinococcus granulosus sensu stricto İçindeki Genetik Varyasyonun Mitokondriyal Sitokrom Oksidaz b (mt-cytb) Gen Sekansları Kullanılarak İn Silico Yöntemle Analiz Edilmesi

Echinococcus granulosus sensu lato (s.l.) is a zoonotic species complex of worldwide importance that causes cystic echinococcosis (CE), differing in their life cycles and host selection. In this study, haplotype diversity, genetic variation, and population structure were investigated using the mitochondrial cytochrom oxidase b (mt-cytb) sequence of E. granulosus sensu stricto (s.s.) isolates submitted to GenBank from different parts of the world. For this purpose, 418 gene sequences belonging to the cytb gene from 26 different locations and 12 different host species were included in the analysis. Mutations were detected at 114 different points in the cytb gene sequence and 102 haplotypes were identified. Tajima's D, Fu's Fs and Fu's LD values showed significant and high negative values. It has been shown that there are haplotype differences and genetic variation among the created subpopulations in the sequences analyzed in the study. This study may serve as a basis for large-scale studies on the worldwide epidemiology, geographical distribution and cytb gene-based population structure of E. granulosus s.s.

Echinococcus granulosus sensu lato (s.l.), kistik ekinokokozise (KE) neden olan, yaşam döngüleri ve konak seçimleri açısından farklılıklar gösteren ve dünya çapında öneme sahip zoonotik bir tür kompleksidir. Bu çalışmada, dünyanın farklı yerlerinden GenBank'ta kayıt altına alınan E. granulosus sensu stricto (s.s.) izolatlarının mitokondriyal sitokrom oksidaz b (mt-cytb) dizilimi kullanılarak haplotip çeşitliliği, genetik varyasyonu ve popülasyon yapısı araştırılmıştır. Bu amaçla cytb genine ait 26 farklı lokasyondan ve 12 farklı konak türüne ait 418 gen dizisi analizlere dahil edildi. Cytb gen dizisinde 114 farklı noktada mutasyon gözlendi ve 102 haplotip tanımlandı. Tajima's D, Fu's Fs ve Fu’s LD değerleri anlamlı ve yüksek negatif değerler gösterdi. Analiz edilen dizilerde haplotip farklılıkları olduğu ve oluşturulan alt popülasyonlar arasında genetik varyasyonunun olduğu gösterildi. Bu çalışmanın, E. granulosus s.s.’nin dünya çapındaki epidemiyolojisi, coğrafi dağılımı ve cytb genine dayalı popülasyon yapısı hakkında büyük ölçekli çalışmalara temel teşkil edebileceği düşünülmektedir.

Giriş

Echinococcus granulosus sensu lato (s.l.), kistik ekinokokozise (KE) neden olan, yaşam döngüleri ve konak seçimleri açısından farklılıklar gösteren ve dünya çapında öneme sahip zoonotik bir tür kompleksidir[1]. Echinococcus granulosus’un erişkinleri köpek, kurt, çakal gibi evcil ve yabani karnivorların ince bağırsaklarına yerleşirken, larvası olan hidatik kist ise koyun, keçi, sığır, domuz, insan ve diğer birçok evcil ve yabani memelilerin başta karaciğer ve akciğer olmak üzere çeşitli organ ve dokularına yerleşmektedir[2]. Bu tür kompleksindeki varyantlar mitokondriyal DNA (mt-DNA) analizine dayalı genotiplendirme çalışmaları ile E. granulosus sensu stricto (s.s.) (G1 ve G3), Echinococcus equinus (G4), Echinococcus ortleppi (G5), Echinococcus canadensis (G6/G7 ve G8/G10), E. felidis olarak sınıflandırılmıştır[3]. Echinococcus spp. cinsindeki parazitler, hermafrodit olup erişkin parazitler hem çapraz hem self-fertilizasyonla çoğalırken, larval dönemde protoskolekslerin eşeysiz olarak çoğaldığı bir döngüye sahiptirler. Erişkinlerin kendi kendine döllenmesi Echinococcus spp. popülasyonlarındaki genetik polimorfizme neden olmuş ve türleşmenin yolunu açmıştır[4,5]. Echinococcus spp. içerisindeki genetik varyasyon, farklı konakçı grupları veya türler için enfektivitedeki farklılıkları yansıtabilir; bu nedenle popülasyon yapısını genetik olarak karakterize etmek büyük önem taşımaktadır[6].

Mt-DNA’nın, haploid olması, hızlı evrimleşmesi, çoklu kopya sayısı ve maternal olarak aktarılmasından dolayı popülasyon çalışmalarında faydalı genetik belirteçler sağlamaktadır. Aynı zamanda yakın akraba türler arasındaki filogenetik ilişkileri yeniden yapılandırmada ve büyük veri setleri ile taksonomideki sorunlu konuların çözümünde nükleer DNA'dan daha etkili olduğu bilinmektedir[5,7,8]. Eccinococcus cinsinin tartışmalı taksonomisi araştırılırken, tam mitokondriyal genomlardan elde edilen nükleotid ve amino asit dizilerinin birleştirilmiş veri setleri analiz edilmiş ve Echinococcus spp.’nin kökeni çıkarılmıştır[5]. Güncel çalışmalarda ise E. granulosus’un mt-DNA'sındaki genetik değişkenliğin daha önce belirlenenin aksine daha yüksek olduğu bildirilmiştir[9,10].

Echinococcus granulosus'un moleküler tanımlanması için birçok mt-DNA belirteci kullanılmıştır. cox1, cox2, nad1, nad3, nad5, 12S rRNA ve rrnS, rrnL (ribozomal RNA'nın daha büyük alt birimi) ve cytochrom b (cytb) geninin kısa gen bölgeleri gibi mt-DNA belirteçleri kullanılarak Echinococcus spp.’nin genetik çeşitliliği ve popülasyon yapısı değerlendirilmiştir[11-17]. Daha önceden yapılan çalışmalar cox1 geninin E. granulosus'un tür içi düzeydeki genetik çeşitliliğini araştırmak açısından en uygun aday olduğunu belirtmiştir[18,19]. Ancak uzun yıllar süren araştırmalardan sonra, cox1 gen dizisinin (1609 bp) G1 veya G3 genotiplerinin ayrımında yetersiz olduğu belirtilmiştir[17]. Yapılan genotiplendirme çalışmalarına mümkün olduğunca çok sayıda ayrım gücü olan konumun dahil edilmesi önerilmiş ve nad5 gen bölgesinden sonra cytb gen bölgesinin 3 tanısal bilgilendirici alana sahip olmasından dolayı genotip ayrımında umut verici belirteç olduğu ifade edilmiştir[17].

Bu çalışmada, National Center for Biotechnology Information (NCBI) veri tabanında yayınlanmış E. granulosus s.s. cytb gen sekansları kullanılarak mitokondriyal değişkenliğin ve popülasyonların genetik yapısının incelenmesi ve cytb geninin E. granulosus s.s.’nun tür içi genetik çeşitliliğinin belirlenmesindeki uygunluğunun araştırılması amaçlanmıştır.

Gereç ve Yöntem

Veri Toplanması: Bu çalışmada biyoinformatik analiz için 31 Haziran 2023 tarihine kadar NCBI veri tabanına kaydedilen E. granulosus s.s.’nun tam cytb gen dizileri kullanıldı. Sekans verileri aranırken arama çubuğuna "Echinococcus granulosus sensu stricto" veya "Echinococcus" veya "cytb" terimlerinin çeşitli kombinasyonları girildi. Seçilen gen sekans dizileri manuel olarak tarandı ve uygun diziler çalışmaya dahil edildi. Veri seçimi ve özellikleri, PRISMA (Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses)[20] akış diyagramı doğrultusunda oluşturuldu (Şekil 1). Analizlerde kullanılan dizilerin erişim numaraları, coğrafi konumları ve konak özellikleri ise Tablo 1’de gösterildi.

Veri Analizleri: Veri analizleri için MEGA X (21) programında ClustalW modülü kullanılarak hizalama yapıldı. Tüm dizilerin hizalanması için bir referans dizi (Erişim no: NC_044548) kullanıldı. Dizilerin her iki ucu hizalandıktan sonra dizilerin uzunlukları eşitlendi ve 1065 bp'lik diziler elde edildi. Verilerin analizi için MEGA X programı kullanılarak Maksimum Likelihood (ML) analizi uygulandı. Nükleotid dizilerinin ML analizinde kullanılmak üzere en uygun baz değişim modelleri, Akaike Bilgi Kriteri (AIC) ve Bayesian Bilgi Kriteri (BIC) analizi ile belirlendi. Diziler Nexus[22] formatına dönüştürüldü ve haplotip ağını oluşturmak için PopART (Population Analysis with Reticulate Trees) [23] yazılımı kullanıldı. Minimum Spanning Networks kullanılarak haplotipler oluşturuldu ve haplotipler arasındaki ilişkiler analiz edildi. Nükleotid içeriği, haplotip sayıları, haplotip ve nükleotid değişim değerleri ve moleküler haplotipler arasındaki mutasyon miktarına ilişkin istatistikler, DnaSP 6 programı kullanılarak belirlendi. Çeşitlilik, nötralite, fikzasyon indeksleri ve gen akışı analizi ise DnaSP 6 programı kullanılarak hesaplandı[24].

Bulgular

Nükleotid Varyasyonu: Bu çalışmada 11 ara konaktan (n = 415) ve bir son konaktan (n = 3) elde edilmiş E. granulosus s.s. izolatına ait 418 cytb gen dizisi kullanılmıştır. 418 dizinin 366’sı G1, 52’si G3 örneklerinden oluşmaktaydı. Analiz edilen cytb gen dizisi (1068 bp) içinde insersiyon/delesyon türü mutasyon tespit edilmedi. Pi: 0.001 değeri ile düşük nükleotid çeşitliliği tespit edildi. Analiz edilen 1068 bp uzunluğundaki dizi içerisinde 59’u parsimony informative alan olmak üzere toplam 114 polimorfik alan bulunmaktaydı. G1 ve G3'ün ayırt edilmesi için kullanılabilecek pozisyon sayısı üç (246., 721., 1026. nükleotidler) olarak belirlendi. Bu konumların tamamında G1 örnekleri aynı nükleotid ile temsil edilirken G3 örnekleri de kendi arasında aynı nükleotid ile temsil ediliyordu. 246. nükleotid tüm G1 örneklerinde T bazı ile tüm G3 örneklerinde ise C bazı ile temsil edilirken, 721. nükleotid tüm G1 örneklerinde T bazı ile tüm G3 örneklerinde ise C bazı ile temsil ediliyordu. 1026. nükleotidde ise bütün G1 örneklerinde A bazı bulunurken bütün G3 örneklerinde G bazı mevcuttu. Tanımlayıcı olan bu üç nokta mutasyonunun tamamı transisyonel mutasyondu ve aminoasit diziliminde değişikliğe neden olmuyordu. G1 genotipine ait dizilerden bir tanesinde ise 1026. nükleotidde G3 karakteristik G bazı bulunmasından dolayı G1 ve G3 haplotiplerinin ortasında kalarak Hap012 haplotipini oluşturdu.

Haplotip Analizi: Haplotip analizi neticesinde cytb gen dizisine dayalı, 114 nokta mutasyonunun gözlemlendiği 102 farklı haplotip elde edildi. 22 haplotip (Hap013, 014, 017, 073-090, 102) G3 genotipine karşılık gelirken, 80 haplotip G1 genotipine aitti. En yüksek temsile sahip iki ana haplotip Hap001 ve Hap013 olarak belirlendi. Bu haplotiplerde sırasıyla %42.58 (G1) ve %6.45 (G3) frekans değerleri hesaplandı. G1 genotipi için, diğer haplotipler, incelenen 1068 nükleotid arasında 1-5 nokta mutasyonuyla ana haplotip Hap001'den ayrıldı. G3 genotipi için ise diğer haplotipler, incelenen 1068 nükleotid arasında 1-3 nokta mutasyonuyla ana haplotip Hap013'den ayrıldı. Haplotip ağı, her biri birbirine bağlı iki yıldız benzeri konfigürasyonun merkezini oluşturan Hap001 ve Hap013 haplotiplerinin etrafında karmaşık bir yapı gösterdi. Analizlerde kullanılan diziler elde edildiği konak özelliklerine göre haplotip ağı oluşturularak değerlendirildi (Şekil 2).

Çeşitlilik, Nötralite ve Fikzasyon İndeksleri Analizi: Çeşitlilik ve nötrlük indeksleri cytb nükleotid verileri kullanılarak hesaplandı. E. granulosus s.s. izolatlarının haplotip çeşitliliği değeri 0.804±0.019 olarak belirlendi ve yüksek haplotip çeşitliliği gösterdi. Varyant nükleotid varlığını ve popülasyon genişlemesini gösteren Tajima's D değeri önemli ölçüde negatifti (P<0.001). Bu durum, son popülasyon genişlemesini veya genetik otostop varlığını gösteren negatif Fu's Fs değeriyle de desteklendi. Nitekim, yakın geçmişte ortaya çıkan faydalı bir mutasyonun frekansı pozitif seçilim sonucunda artarken, bağlantılı olduğu genetik varyasyonlar da onunla birlikte aktarılır. Genetik otostop olarak tanımlanan bu olgunun sonucunda pozitif seçilime uğrayan mutasyonun yakınlarındaki DNA dizilerinde de çeşitlilik azalır. Analizlere ait indeks değerleri Tablo 2’de gösterilmiştir.

Farklı coğrafi bölgelere göre E. granulosus s.s. populasyonlarının karşılaştırılması: 26 farklı grup E. granulosus s.s. izolatı için popülasyon farklılaşma derecesi (Fst) ve haploid göç sayısı (Nm) hesaplandı (Tablo 2). En yüksek genetik farklılaşma Fransa-Meksika ile Hindistan-Meksika popülasyonları arasında (0.68), en düşük genetik farklılaşma ise Pakistan-Yunanistan popülasyonları arasında (-0.11) hesaplandı. Ortalama Fst değeri ise 0.219 olarak belirlendi. Ortalama Fst değerinin nispeten yüksek olması alt popülasyonların genetik olarak farklı olabileceğini gösterdi.

Farklı konak türlerine göre E. granulosus s.s. populasyonlarının karşılaştırılması: 11 farklı konak özelliğine göre oluşturulan grup E. granulosus s.s. izolatı için popülasyon Fst ve Nm hesaplandı (Tablo 2). En yüksek genetik farklılaşma deve-yaban domuzu ile dingo-deve populasyonları arasında (0.82), en düşük genetik farklılaşma ise koyun ve insan popülasyonları arasında (-0.001) hesaplandı. Ortalama Fst değeri ise 0.39 olarak belirlendi. Ortalama Fst değerinin nispeten yüksek olması alt popülasyonların genetik olarak farklı olabileceğini gösterdi.

Tartışma

Mitokondriyal DNA, korunmuş yapısı, yüksek mutasyon oranı, rekombinasyon olmaması ve yüksek oranda evrimsel geçişi nedeniyle tür içi varyasyonların ve diğer popülasyon genetiği çalışmalarının araştırılmasında önemli bir rol oynamaktadır[7]. Bu çalışmada, NCBI veri tabanına 26 farklı ülkeden kaydedilen 12 konağa ait E. granulosus s.s. (G1 ve G3) izolatlarının mitokondriyal cytb geninin tam dizilimi analiz edildi ve E. granulosus s.s. genetik çeşitliliği ve popülasyon yapısı incelendi.

Çeşitli mt-DNA bazlı Echinococcus cins, tür ve genotip tanımlama yöntemleri geliştirilmiş olmasına rağmen G1 ve G3 genotiplerinin farklılaşması tartışmalı kalmıştır[17]. Nad5 gen fragmanı (680 bp), tutarlı bir şekilde tanısal olan üç pozisyon ve tamamen tutarlı olmayan üç pozisyon ile G1 ve G3'ü ayırt etme potansiyeline sahip bölgeler içinde ilk sırada yer almaktadır. Ancak Kinkar ve ark.[17] analize mümkün olduğunca çok sayıda potansiyel olarak farklılaştırıcı konumun dahil edilmesi gerektiğini bildirmiştir. Echinococcus granulosus s.s.'nun mitokondriyal değişkenliğini ve popülasyon genetik yapısını araştıran bir çalışmada Avrupa’nın farklı ülkelerinden elde edilen 312 izolat cox1 gen bölgesinin kısmi gen fragmanı (446 bp) kullanılarak analiz edilmiş ve 351 bp uzunluğundaki bölgede 18 nokta mutasyonu belirlenmiştir[10]. Cytb gen bölgesinin tam dizisini kullanarak yapılan bir çalışmada ise 18 izolat analiz edilmiş ve 11 nokta mutasyonu belirlenmiştir[25]. Bu çalışmada ise 1068 bp uzunluğundaki cytb gen dizisinde 114 nokta mutasyonunda 59 informatif alan bulunmaktaydı. Bunlardan üçü tanısal anlamda tutarlıydı. Bu nedenle cytb ile nad5 gen fragmanları birlikte kullanıldığında G1 ile G3’ün ayrımında yüksek doğruluk elde edilebileceği düşünülmektedir. Cytb gen bölgesindeki tanısal alanların tutarlı olması genotiplendirme çalışmalarında yaygın olarak kullanılan cox1 ve nad1 genine göre daha uygun olduğunu göstermektedir. Cytb geninin diğer gen bölgelerine göre negatif yönü ise tanısal pozisyonların büyük bir gen bölgesine yayılmış olmasıdır. Özellikle düşük kalitedeki DNA örneklerinde uzun bir bölgenin çoğaltılması zor olduğu için tanısal alanların kısa alanlarda bulunması gerektiği bildirilmiştir[17].

İncelenen gen bölgesinin uzunluğu potansiyel olarak genetik çeşitlilik araştırmalarının sonuçlarını etkilemektedir[26,27]. Çin’de yapılan bir çalışmada 45 E. granulosus izolatının 1609 bp uzunluğundaki cytb geni çoğaltılmış ve tamamı G1 genotipine ait on haplotip tespit edilmiştir. Bu sonuçlar, cytb gen analizine göre örnekler arasında genetik çeşitliliğin düşük (Hd=0.626) olduğunu göstermiştir[28]. Cox1+nad3 (701 bp) gen bölgeleri kullanılarak yapılan bir çalışmada ise 66 izolata ait gen dizisi analiz edilmiş ve 21 nokta mutasyonuyla 23 haplotip gözlenmiştir[13]. Nad1 ve cox1 gen bölgeleri ile yapılan bir çalışmada 60 izolat analiz edilmiştir. Nad1 bölgesi için 12, cox1 bölgesi için 23 haplotip belirlenmiş ve her iki gen bölgesi için de düşük nükleotid (π), yüksek haplotip çeşitliliği (Hd) ve negatif/önemsiz Tajima’s D değeri gözlendiği bildirilmiştir[29]. Başka bir çalışmada ise cytb gen analizine göre 18 izolat içerisinde 7 haplotip tespit edilmiş; haplotip çeşitliliği yüksek (Hd=0,837) nükleotid çeşitliliği düşük (π=0,00341), Tajima’s D ve Fu’s Fs değerleri negatif ancak önemsiz olarak belirlenmiştir. Aynı çalışmada Hap-2 ve Hap-6 ana haplotiplerinin sırasıyla G3 ve G1 genotiplerinden oluştuğu ve baskın genotipin G3 olduğu bildirilmiştir[26]. Bu çalışmada ise in silico olarak analiz edilen 418 izolat içerisinde 102 haplotip belirlenmiş ve yüksek haplotip, düşük nükleotid çeşitliliği belirlenmiştir (Hd = 0,807, π = 0,001). Yine bu çalışmada Hap001 ve Hap013 ana haplotipleri sırasıyla G1 ve G3 genotiplerinden oluşurken, baskın genotip G1 genotipi olarak belirlenmiştir. Alvi ve ark.[25]’nın belirttiğinin aksine bu çalışmada Tajima’s D ve Fu’s Fs değerleri önemli derecede negatifti. Fu's Fs populasyon demografik genişlemesine karşı hassastır ve bu da genellikle büyük negatif Fu’s Fs değerlerine yol açmaktadır[30]. Bu veriyle uyumlu olarak bizim çalışmamızda da önemli ölçüde negatif Tajima’s D ve Fu’s Fs değerleri popülasyon genişlemesinin bir göstergesi olarak değerlendirilmektedir. Düşük nükleotid ve yüksek haplotip çeşitliliğinin kombinasyonu, küçük bir popülasyon boyutundan hızlı bir popülasyonun yayıldığını göstermektedir[25,31]. Aynı zamanda düşük nükleotid çeşitliliği, popülasyonlarda olası darboğaz olaylarının yaşandığını göstermektedir.

Yıldız benzeri konfigürasyonlar popülasyonun demografik genişlemesini ve nadir mutasyonların fazlalığını göstermektedir[32,33]. Çalışmamızda E. granulosus s.s.’nun yıldız benzeri medyan ağı tarihsel bir popülasyon genişlemesine işaret etmektedir. Bu durum Fu'S Fs testi ile de desteklenerek E. granulosus’un belirli popülasyon genişleme olaylarını yaşadığını göstermektedir.

Fst, genetik yapıya bağlı olarak popülasyon farklılaşmasının bir ölçüsü olup 0.15'ten büyük bir Fst değeri, popülasyonların ayırt edilmesinde anlamlı olarak kabul edilmektedir[34]. Echinococcus granulosus s.s. türleri arasındaki gen akışının derecesini tahmin etmek için yapılan bir çalışmada cox1 dizi verileri coğrafi özelliklerine göre gruplandırılarak Fst değeri hesaplanmış ve 0.01825 ila 0,18746 arasında değişen Fst değerleri bulunmuş ve alt popülasyonların genetik olarak farklılaşmadığı belirtilmiştir[10]. Başka bir çalışmada farklı coğrafi bölgelerden elde edilen 120 Echinococcus spp. izolatının popülasyon farklılaşması araştırılmış ve popülasyonlar arasındaki Fst değerlerinin 0.037 ile 0.229 arasında değiştiği ve istatistiksel olarak anlamlı olduğu bildirilmiştir[27]. Bu çalışmada coğrafi konuma göre belirlenen popülasyonlardan elde edilen Fst (0.21) değerlerine göre alt popülasyonlarda önemli bir farklılık bulunmuştur. Wright[35], birden küçük bir Nm değerinin alt popülasyonlar arasında sınırlı gen değişimine işaret ettiğini bildirmiştir. Bu çalışmada da 0.89 olan Nm değerinin düşük olması, düşük bir genetik değişimin veya düşük gen akışının[36] olabileceğini düşündürmektedir. Veri tabanından elde edilen dizilerin konak özelliklerine göre oluşturulan alt popülasyonlarda ise Fst ve Nm değerleri 0.39 olarak belirlenmiştir. Bu durum konaklar arası popülasyon farklılaşmasının daha yüksek olduğunu göstermiştir. Genetik uzaklık en yüksek (0.82) yaban hayvanları ve evcil hayvanlar arasında belirlenmiştir. Bu durumun farklı erişkin parazitler arasında otogami ve geitinogami üreme şekillerinden kaynaklı olabileceği düşünülmektedir. En düşük genetik mesafenin ise koyun ve insan popülasyonları arasında görülmesi de E. granulosus s.s.’nun yaşam çemberinde evcil yaşam döngüsünün hala ön planda olduğunu göstermektedir.

Echinococcus granulosus s.l.'ya ilişkin güncel epidemiyolojik çalışmalarda birden fazla lokus kullanılmaya başlanmıştır. Daha fazla gen kullanılması, E. granulosus s.l.'nun genotipleri arası ve genotip içi taksonomik durumu ve filogenisini anlamaya yardımcı olacaktır. Bu çalışma ile cytb gen bölgesi G1 ve G3 genotiplerinin ayrımında kullanılacak alternatif gen bölgesi olarak değerlendirilmiş ve popülasyonlar arasında yüksek derecede genetik çeşitlilik belirlenmiştir. Bu veriler E. granulosus s.l.’nun genetik varyasyonuna ilişkin yararlı temel bilgiler oluşturmaktadır. E. granulosus s.s’nun yaygınlığı ve popülasyon yapısı ile ilgili yapılan çalışmalar dünya çapında nad5 gen dizilerine dayanmaktadır. Bu çalışma ile nad5 genine ek olarak cytb geninin de kullanılmasıyla genotip ayrımlarının daha doğru bir şekilde yapılabileceği belirlenmiştir.

References

1. Craig PS, McManus DP, Lightowlers MW, et al. Prevention and control of cystic echinococcosis. Lancet Infect Dis 2007; 7: 385-394.
2. Torgerson P, Carmona C, Bonifacino R. Estimating the economic effects of cystic echinococcosis: Uruguay, a developing country with upper-middle income. Ann Trop Med Parasitol 2000; 94: 703-713.
3. Vuitton DA, McManus DP, Rogan MT, et al. International consensus on terminology to be used in the field of echinococcoses. Parasite 2020; 27: 1-41
4. Haag KL, Araujo AMd, Gottstein B, et al. Breeding systems in Echinococcus granulosus (Cestoda; Taeniidae): Selfing or outcrossing? Parasitology 1999; 118: 63-71.
5. Nakao M, McManus DP, Schantz PM, Craig PS, Ito A. A molecular phylogeny of the genus Echinococcus inferred from complete mitochondrial genomes. Parasitology 2006; 134: 713-722.
6. Thompson RA, McManus DP. Towards a taxonomic revision of the genus Echinococcus. Trends Parasitol 2002; 18: 452-457.
7. Mueller RL, Macey JR, Jaekel M, Wake DB, Boore JL. Morphological homoplasy, life history evolution, and historical biogeography of plethodontid salamanders inferred from complete mitochondrial genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences 2004; 101: 13820-13825.
8. Brown WM, George Jr M, Wilson AC. Rapid evolution of animal mitochondrial DNA. Proc Natl Acad Sci 1979; 76: 1967-1971.
9. Ma S, Maillard S, Zhao H, et al. Assessment of Echinococcus granulosus polymorphism in Qinghai province, People’s Republic of China. Parasitol Res 2008; 102: 1201-1206.
10. Casulli A, Interisano M, Sreter T, et al. Genetic variability of Echinococcus granulosus sensu stricto in Europe inferred by mitochondrial DNA sequences. Infect Genetic Evol 2012; 12: 377-383.
11. Bowles J, McManus D. NADH dehydrogenase 1 gene sequences compared for species and strains of the genus Echinococcus. Int J Parasitol 1993; 23: 969-972.
12. Casulli A, Manfredi MT, La Rosa G, et al. Echinococcus ortleppi and E. granulosus G1, G2 and G3 genotypes in Italian bovines. Vet Parasitol 2008; 155: 168-172.
13. Umhang G, Chihai O, Boué F. Molecular characterization of Echinococcus granulosus in a hyperendemic European focus, the Republic of Moldova. Parasitol Res 2014; 113: 4371-4376.
14. Hu D, Song X, Wang N, et al. Molecular identification of Echinococcus granulosus on the Tibetan Plateau using mitochondrial DNA markers. Genet Mol Res 2015; 14: 13915-13923.
15. Boubaker G, Marinova I, Gori F, et al. A dual PCR-based sequencing approach for the identification and discrimination of Echinococcus and Taenia taxa. Mol Cell Prob 2016; 30: 211-217.
16. Samari H, Laurimäe T, Reghaissia N, et al. Molecular characterization of Echinococcus granulosus sensu lato genotypes in dromedary camels from extreme Sahara of Algeria based on analysis of nad2 and nad5 genetic markers. Acta Trop 2022; 234: 106616.
17. Kinkar L, Laurimäe T, Acosta-Jamett G, et al. Distinguishing Echinococcus granulosus sensu stricto genotypes G1 and G3 with confidence: A practical guide. Infect Genetic Evol 2018; 64: 178-184.
18. Haag K, Ayala F, Kamenetzky L, Gutierrez A, Rosenzvit M. Livestock trade history, geography, and parasite strains: the mitochondrial genetic structure of Echinococcus granulosus in Argentina. J Parasitol 2004; 90: 234-239.
19. Nakao M, Li T, Han X, et al. Genetic polymorphisms of Echinococcus tapeworms in China as determined by mitochondrial and nuclear DNA sequences. Int J Parasitol 2010; 40: 379-385.
20. Liberati A, Altman DG, Tetzlaff J, et al. The PRISMA statement for reporting systematic reviews and meta-analyses of studies that evaluate health care interventions: Explanation and elaboration. Ann Int Med 2009; 151: 65-94.
21. Kumar S, Stecher G, Li M, Knyaz C, Tamura K. MEGA X: molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Mol Biol Evol 2018; 35: 1547.
22. Maddison DR, Swofford DL, Maddison WP. NEXUS: An extensible file format for systematic information. Syst Biol 1997; 46: 590-621.
23. Leigh JW, Bryant D. POPART: Full-feature software for haplotype network construction. Methods Ecol Evol 2015; 6: 1110-1116.
24. Rozas J, Ferrer-Mata A, Sánchez-DelBarrio JC, et al. DnaSP 6: DNA sequence polymorphism analysis of large data sets. Mol Biol Evol 2017; 34: 3299-3302.
25. Alvi MA, Ali RMA, Li L, et al. Phylogeny and population structure of Echinococcus granulosus (sensu stricto) based on full-length cytb-nad2-atp6 mitochondrial genes – First report from Sialkot District of Pakistan. Mol Biochem Parasitol 2023; 253: 111542.
26. Romig T, Ebi D, Wassermann M. Taxonomy and molecular epidemiology of Echinococcus granulosus sensu lato. Vet Parasitol 2015; 213: 76-84.
27. Yanagida T, Mohammadzadeh T, Kamhawi S, et al. Genetic polymorphisms of Echinococcus granulosus sensu stricto in the Middle East. Parasitol Int 2012; 61: 599-603.
28. Zhong X, Wang N, Hu D, et al. Sequence analysis of cytb gene in Echinococcus granulosus from Western China. Korean J Parasitol 2014; 52: 205.
29. Alvi MA, Ohiolei JA, Saqib M, et al. Echinococcus granulosus (sensu stricto)(G1, G3) and E. ortleppi (G5) in Pakistan: Phylogeny, genetic diversity and population structural analysis based on mitochondrial DNA. Parasite Vector 2020; 13: 1-10.
30. Su J, Ji W, Wei Y, et al. Genetic structure and demographic history of the endangered and endemic schizothoracine fish Gymnodiptychus pachycheilus in Qinghai-Tibetan Plateau. Zool Sci 2014; 31: 515-522.
31. Sharma M, Fomda BA, Mazta S, et al. Genetic diversity and population genetic structure analysis of Echinococcus granulosus sensu stricto complex based on mitochondrial DNA signature. PLoS One 2013; 8: e82904.
32. Slatkin M, Hudson RR. Pairwise comparisons of mitochondrial DNA sequences in stable and exponentially growing populations. Genetics 1991; 129: 555-562.
33. Harpending H, Rogers A. Genetic perspectives on human origins and differentiation. Annu Rev Genomics Hum Genet 2000; 1: 361-385.
34. Frankham R, Briscoe DA, Ballou JD. Introduction to conservation genetics: Cambridge university press 2002.
35. Wright S. The interpretation of population structure by F-statistics with special regard to systems of mating. Evolution 1965; 395-420.
36. Eltaher S, Sallam A, Belamkar V, et al. Genetic diversity and population structure of F3: 6 Nebraska winter wheat genotypes using genotyping-by-sequencing. Front Genet 2018; 9: 76.