Kayseri İlinde Satılan Çiğ Sütlerde Staphylococcus aureus ve Enterotoksinlerinin Varlığı Üzerine Araştırmalar

Bu çalışmada, Kayseri ilinde satışa sunulan çiğ sütlerde bulunan Staphylococcal Enterotoksinlerin (SEs) ELISA testleri ile tespiti ve çiğ sütlerden izole edilen S.aureus izolatlarının sahip olduğu enterotoksin genlerinin m-PCR metodu ile belirlenmesi amaçlandı.

Çalışmada, incelenen 100 adet çiğ süt numunesinin 60'ında (%60) Staphylococcus spp. üremesi tespit edildi. İncelenen 300 adet izolata yapılan katalaz ve koagülaz testi ile 42'sinin (%14) S. aureus olduğu belirlendi. Belirlenen 42 adet S. aureus izolatının m-PCR metodu ile incelenmesi sonucunda 31 izolatta (%73.8) enterotoksin genlerininin varlığı tespit edildi. Bu enterotoksinlerin sırasıyla 12'sinin (%38.7) sea, 2'sinin (%6.5) seb, 5'inin (%16.1) sec, 10' unun (%32.3) sed ve 2'sinin (%6.5) hem sea hem de sed gen dağılımına sahip olduğu belirlendi. Belirlenen 42 adet izolata ait çiğ sütlerin ELISA tekniği ile incelenmesi sonucunda ise 28 örnekte (%66.6) SEs varlığı belirlendi. Uygulanan ELISA testleri sonucunda numunelerdeki SEs'lerin sırasıyla 10'unun (%35.7) SEA, 2'sinin (%7.1) SEB, 5'inin (%17.8) SEC, 9'unun (%32.2) SED ve 2'sinin (%7.1) hem SEA hem de SED olduğu tespit edildi. S. aureus izole edilmeyen çiğ sütlerde SEs varlığına rastlanmadı.

Bu çalışmada, Kayseri ili ve merkez ilçelerde satışa sunulan çiğ sütlerde S. aureus ve enterotoksinlerinin varlığı ortaya konulmuş ve bu toksinlerin halk sağlığı açısından göz ardı edilmemesi gereken bir tehlike oluşturabileceği sonucuna varılmıştır.

The aim of this study was to identify Staphylococcal enterotoxins (SEs) by ELISA in raw milk samples marketed in Kayseri, and to detect S. aures isolates having enterotoxin genes using mPCR method in raw milk samples.

Sixty out of 100 raw milk samples (60%) were identified with Staphylococcus spp. 42 out of 300 isolates (14%) studied were identified as S. aures using catalase and coagulase tests. The presence of Staphylococcal enterotoxin genes was identified in 31 out of 42 S. aureus isolates (73.8%) by using mPCR method. It was determined that these enterotoxins contained 12 (38.7%) sea, 2 (6.5%) seb, 5 (16.1%) sec, 10 (32.3 %) sed ve 2 (6.5%) both sea and sed gene distribution, respectively. The presence of SEs was identified in 28 out of 42 raw milk samples (66.6%) by using ELISA technique. It was determined that these SEs had 10 (35.7%) SEA, 2 (7.1 %) SEB, 5 (17.8 %) SEC, 9 (32.2%) SED ve 2 (7.1%) both SEA and SED distribution, respectively. No SEs was identified in raw milk samples without S. aureus.

In this study, the presence of S. aureus and their enterotoxins were effective in raw milk retailed in Kayseri and vicinity and it was concluded that these toxins should not be ignored for public health.

Introduction

Staphylococcus aureus, mikrobiyal kaynaklı besin zehirlenmelerinin etiyolojik ajanı olarak oldukça önemli bir yere sahiptir[1,2]. Bu bakteri, insanlarda besin zehirlenmelerinin yanısıra septisemi, toksik şok sendromu (TSS), otoimmun hasatalıklar ve süt ineklerinde mastitise neden olur[3,4,5].

Staphylococcus aureus enterotoksijenik stafilokoklar içerisindeki en önemli türdür. Enterotoksin protein yapıda heterojen bir gruptur[6-9]. Besin zehirlenmeleri ile ilişkili olarak beş temel (A, B, C, D, E) enterotoksin bulunmaktadır[1,9,10]. Besin zehirlenmesine neden olan en yaygın enterotoksinler tip A ve tip D'dir[1,9]. Son dönemlerde yapılan çalışmalarda SEs yeni tiplerinin (G, H, I, J, K L, M, N ve O) var olduğu bildirilmiştir[1,3,11,12]. SEs'lerin hemen hemen tamamı gastroenteritis ve kusmaya neden olur. Ayrıca T hücrelerini stimule etmesinden dolayı süperantijen yeteneğine sahiptir[2,3]. Moleküler çalışmalar sonucunda SEs'lerin her birinin ayrı ayrı gen bölgeleri tarafından determine edildiği belirtilmiştir[3]. SEs'lerin en önemli özelliği ısıya dayanıklı olmalarıdır[13-15]. Gıdalardaki enterotoksinler pişirme, pastörizasyon veya diğer ısı uygulamaları ile tamamen inaktive edilememektedir[13,15].

Stafilokok etkenlerine bağlı gıda zehirlenmeleri genellikle 106 kob/g veya daha yüksek sayıya ulaşan bakteriler tarafından sentezlenen enterotoksinlerin besinler yolu ile alımı sonucu oluşmaktadır[16,17]. Bu nedenle gıda zehirlenmelerinin oluşumunda enterotoksin ihtiva eden besinlerin tüketilmesi önemli rol oynamaktadır[1,15]. Zehirlenmeye neden olan aracı gıdaların ortak özelliği; çoğunlukla bu gıdaların pişirilmiş ya da az pişirilmiş, elle hazırlanmış olmalarıdır[2,8,13,14,18,19].

Enzim- Linked Immunosorbent Assay (ELISA) metodu besinlerden SEs'lerin saptanmasında kullanılan yaygın bir metot dur[10]. Son dönemlerde, enterotoksijenik S. aureus identifikasyonu için, Polimerase Chain Reaction (PCR), PCR-ELISA gibi gelişmiş ve hızlı tekniklerden yararlanılmaktadır[9,20-22].Türk Gıda Kodeksi yönetmeliği gıda maddelerindeki bulaşanların maksimum limitleri hakkındaki 2008/26 nolu tebliğ'de tüm gıda maddelerinde SEs'lerinin bulunmasının gıdanın tüketimine mani bir hal olarak değerlendirilmesi hükmü getirilmiştir[23].

Bu çalışmada, Kayseri ili ve çevresinde satışa sunulan çiğ sütlerde bulunan S. aureus enterotoksinlerinin ELISA ile tespiti ve çiğ sütlerden izole edilen S.aureus izolatlarının sahip olduğu enterotoksin genlerinin mPCR metodu ile belirlenmesi ve çiğ sütün tüketici sağlığı açısından güvenilirliğinin belirlenmesi amaçlanmıştır.

Material and Method

Numuneler: Çalışmada, Kayseri ili ve çevresindeki farklı satış noktalarından Eylül 2008-Ocak 2009 tarihleri arasında 100 adet 50'şer ml çiğ süt numunesi toplandı. Numuneler, soğuk zincirde laboratuvara getirildi ve bekletmeden incelemeye alındı.

Standart Suş: Çalışmada izolasyon işleminin her aşamasında, S. aureus ATCT 29213 (SEA), S. aureus NCTC 10652 (SEA, SED), S. aureus NCTC 10654 (SEB), S. aureus NCTC 10655 (SEC) standart suşları kullanıldı.

Primerler: Çalışmada elde edilen izolatlar beş adet primer (Tablo 1) kullanılarak m-PCR tekniği ile incelendi.

Etken İzolasyonu: Staphylococcus aureus izolasyonu amacıyla çiğ süt numuneleri yayma plak yöntemi ile Egg-Yolk Tellurit (Merck 1.03785.0001) içeren Baird Parker Medium (BPM, Oxoid CM275) besiyerine ekildi ve 37º C'de 2 -3 gün inkübasyona bırakıldı. Bu süre sonunda BPM'de üreyen S. aureus şüpheli beş adet koloni tekrar BPM besiyerine yayma plak tekniği ile ekilerek 37º C'de 24 saat bekletildi. Üreyen şüpheli koloniler fenotipik özelliklerinin belirlenmesi amacıyla Brain Heart İnfuzyon Broth (BHI, Acumedia, 7116A) besi yerine inokule edildi ve ekim 37º C'de 24 saat inkübe edidi[12,15].

İzolatların Fenotipik Karakterizasyonu: BHI'da üreyen şüpheli kültürlere Gram boyama, katalaz ve koagülaz testleri uygulandı[24].

DNA Ekstraksiyonu: Baird Parker Medium besiyerinde üreyen şüpheli kolonilere ait DNA'lar GF-1 Nukleik asit ekstraksiyon kiti (Vivantis, GF-BA-100) kullanılarak ekstrakte edildi.

Multipleks PCR: m-PCR'da primer büyüklüğü 69 ile 306 bp arasında değişen tür spesifik primerler kullanıldı. Reaksiyon karışımı final konsantrasyonu 50 µl olacak şekilde hazırlandı. Reaksiyon karışımı; 2 μl DNA örneği, 5 μl 10x PCR buffer (Vivantis),4 mM MgCl2 (Vivantis), 0,2 mM dNTP Mix (Vivantis), 20-30 pmol SA-U, SA-A, SA-B, SA-C/ENT-C ve SA-D primerleri, 1 U Taq polymerase (Vivantis) olacak şekilde hazırlandı[9]. Reaksiyon PCR cihazında (Thermo) 35 siklus olacak şekilde 94°C'de 30 s, 50°C'de 30 s ve 72°C'de 30 s, son ektensiyon 72°C'de 2 dk olarak gerçekleştirildi. Amplifikasyon sonucunda elde edilen PCR ürünleri % 1,5'lik agaroz jelde 90 V gerilimde 45 d elektroforez (Thermo EC330) işlemine tabi tutulduktan sonra, UVP jel dökümantasyon sistemi (Vilber Laurmat ECX-20-M) kullanılarak görüntülendi[9].

Enzim- Linked Immunosorbent Assay (ELISA):Toplanan örneklerde, Staphylococcus aureus enterotoksinlerinin (SET A,B,C,D,E) varlığı Ridascreen^® SET A,B,C,D,E (r-biopharm, Germany, Art.no:R1101) kiti kullanılarak Enzim-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) metodu ile belirlendi[25].

Results

Çalışmada, incelenen 100 adet çiğ süt numunesinin 60'ında (%60) Staphylococcus spp. üremesi tespit edildi. İncelenen 300 adet izolata yapılan katalaz ve koagülaz testi ile 42'sinin (%14) S. aureus olduğu belirlendi. Bu izolatlardaki enterotoksin genleri ( sea, seb, sec, sed) m-PCR ile saptandı (Tablo 2). Belirlenen 42 adet S. aureus izolatının m-PCR metodu ile incelenmesi sonucunda 31 izolatta (%73.8) enterotoksin genlerininin varlığı tespit edildi. Bu SEs'lerin sırasıyla 12'sinin (%38.7) sea, 2'sinin (%6.5) seb, 5'inin (%16.1) sec, 10' unun (%32.3) sed ve 2'sinin (%6.5) hem sea hem de sed gen dağılımına sahip olduğu belirlendi (Resim 1). Belirlenen 42 adet izolata ait çiğ sütlerin ELISA testleri ile incelenmesi sonucunda ise 28 örnekte (%66.6) SEs varlığı belirlendi. ELISA yöntemi ile yapilan analizler sonucunda numunelerdeki SEs'lerin sırasıyla; 10'unun (%35.7) SEA, 2'sinin (%7.1 ) SEB, 5'inin (%17.8 ) SEC, 9'unun (%32.2) SED ve 2'sinin (%7.1) hem SEA hem de SED olduğu tespit edildi (Tablo 3). S. aureus izole edilmeyen çiğ sütlerde yapılan analizler sonucunda SEs varlığına rastlanmadı.

Ayrıca bu çalışmada 1 Nolu örnek için kullanılan primerlerin, iki farklı base pair (S.aureus enterotoksin D 306bp, 790 bp) büyüklüğünde bandlar oluşturduğu daha önceki araştırmacılar tarafından bildirilmiştir[9].

Discussion

Staphylococcus aureus'un gıdalara bulaşması genel olarak insanlar, hayvanlar ve ekipmanlar aracılığı ile gerçekleşir. S.aureus insanların el ve üst solunum yollarında bulunabilmekte, süt ve süt ürünlerine bu yolla bulaşabilmektedir[18,26].

Çalışmada, incelen 100 adet çiğ süt numunesinin 42'sinden S. aureus izole edildi. Yapılan mPCR reaksiyonu sonucunda 42 adet S. aureus izolatının 31'inde enterotoksin genlerininin ve bu izolatlara ait çiğ sütlerin 28'inde ELISA testleri ile SEs varlığı tespit edildi (Tablo 2). Bu izolatların sırasıyla 12'sinin sea, 2'sinin seb, 5'inin sec, 10'unun sed ve 2'sinin hem sea hemde sed enterotoksin genlerini taşıdığı belirlendi (Şekil 1). Bu izolatların elde edildiği çiğ süt numunelerine uygulanan ELISA testleri sonucunda 10'unun SEA, 2'sinin SEB, 5'inin SEC, 9'unun SED ve 2 tanesinin hem SEA hem de SED SEs'lerini içerdiği belirlendi (Tablo 3). S. aureus izole edilmeyen çiğ sütlerde yapılan analizler sonucunda SEs varlığına rastlanmadı.

Çalışmamızda, sea gen bölgesi taşıyan 2 ve sed gen bölesi taşıyan 1 izolata ait çiğ süt numunlerine yapılan ELISA testleri sonucunda herhangi bir SEs varlığına rastlanmadı. Bu durum entrotoksijenik S. aureus'ların ilgili gen bölgelerine sahip olmalarına rağmen süte enterotoksin salgılamayabileceği sonucunu düşündürmektedir.

Küplülü ve ark[27] 250 adet pastörize süt numunesinin 2'sinde SEA eneterotoksini saptamışlardır. Bu çalışmada 100 adet çiğ süt numunesinden 28'inde SEs'leri belirlendi. Çalışmada, enterotoksin tespit edilen süt sayısının yüksek çıkmasının nedeni incelenen süt numunelerinin çiğ olmasına bağlanabilir. Boynukara ve ark[28], 408 süt numunesinden elde ettikleri 106 S. aureus suşunun 27 tanesinin enterotoksijenik olduğunu belirtmişlerdir. Reverse Passive Latex Agglutination (RPLA) testi ile 25 (%23.6) suşun SEA, 2 (%1.9) suşun ise SEB yönünden pozitif olduğunu bildirmişlerdir. Umoh ve ark[29] inceledikleri 42 çiğ süt örneğinin 13'ünden (%31) enterotoksijenik S. aureus izole etmişlerdir. İzolatların 5'inin SEA, 3'ünün SED SEs'lerini ürettiğini bildirmişlerdir.

Çiğ sütlerde enterotoksin genlerinin varlığının tespiti amacı ile Tkacikova ve ark[21] 75 çiğ süt örneğinin 32'sinden S. aureus izole etmişlerdir. İzolatlara yapılan mPCR sonucunda 32 izolatın 15'inden sec, 15'inden sed ve 2'sinden sea ve seb genlerinin varlığını tespit etmişlerdir. Adwan ve ark[14] inceledikleri 250 çiğ süt numunesinin 100'ünden S. aureus izole etmişlerdir. Araştırmacılar 100 adet S. aureus izolatının 4'ünde sea, 20'sinde seb, 4'ünde sec, 6'sında sed, 3'ünde see geninin varlığını bildirmişlerdir. Tkacikova ve ark[21] ve Adwan ve ark[14] tarafından yapılan araştırmalar SEs tipleri açısından bizim çalışmamızla benzerlik göstermektedir.

Sonuç olarak, Kayseri ili ve çevresinde satışa sunulan çiğ sütlerin, S. aureus ve SEs bakımından % 60'nın Türk Gıda Kodeksi yönetmeliği gıda maddelerindeki bulaşanların maksimum limitleri hakkındaki 2008/26 nolu tebliğine uygun olmadığı ve dolayısı ile halk sağlığı açısından risk oluşturabileceği sonucuna varılmıştır. Yetersiz hijyenik koşullar nedeni ile sütler S. aureus ile kontamine olmaktadır. Tüm dünyada önemli bir hayvansal gıda olan olan süt, Türkiye'de genellikle çiğ olarak satışa sunulmaktadır. Çiğ sütlerde hızla üreyen S. aureus'ların ürettikleri enterotoksinler sütün kalitesini ve hijyenini önemli ölçüde etkilemektedir. SEs ihtiva eden sütlerin kaynatılması veya pastörize edilmesi, sütteki enterotoksinlerin ortadan kaldırılmasında yeteri kadar etkili değildir. Bu nedenle tüketici sağlığı açısından HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Point) sisteminin uygulanması önemlidir. Bütün bu bilgiler ışığında, hayvan sağlığından başlayarak sağımda kullanılan araç ve gereçlerin, sağımdan sonra kullanılan saklama ve taşıma kaplarının temizliğine dikkat edilerek sütte S. aureus üremesi ve enterotoksin varlığı kontrol altına alınabilir ya da en aza indirilebilir.

References

1. Rosec JP, Guiraud JP, Dalet J, Richard N. Enterotoxin production by Staphylococci isolated from foods in France. Food Microbiol 1997; 35: 213-221.
2. Orwin PM, Fitzgerald JR, Leung DYM, et al. Characterization of Staphylococcus aureus enterotoxin L. Infection and Immunity 2003; 71(5): 2916-2919.
3. Omoe K, Imanishi K, Hu D, et al. Biological properties of Staphylococcal enterotoxin-like toxin type R. Infection and Immunity 2004; 72(6): 3664-3667.
4. Hata E, Katsuda K, Kobayashi H, et al. Bacteriological characteristics of Staphylococcus aureus isolates from humans and bulk milk. J Dairy Sci 2008; 91: 564-569.
5. Stevens DL, Ma Y, Salmi DB, et al. Impact of antibiotics on expression of virulence- associated exotoxin genes in methicillin-sensitive and methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Infec Dis 2007; 195(15): 202-211.
6. Gran HM, Wetlesen A, Mutukumira AN, Rukure G, Narvhus CA. Occurrence of pathogenic bacteria in raw milk, cultured pasteurized milk and naturally soured milk produced at small-scale dairies in Zimbabwe. Food Control 2003; 14: 539-544.
7. Ünlütürk A, Turantaş F. Gıda güvenliği, mikrobiyolojik kriterler ve hızlı mikrobiyolojik yöntemler. İzmir: Mengi Tan Basımevi, 1999; 20, 289-294.
8. Soejima T, Nagao E, Kubota T, Yamagata H, Kagi H. Comparasion between ultrafiltration and trichloroacetic acid precipitation method for concentration of Staphylococcus aureus enterotoxin in dairy samples. Int J Food Microbiol 2004; 93: 185-194.
9. Sharma NK, Rees CED, Dodd CER. Development of a Single-Reaction multiplex PCR toxin typing assay for Staphylococcus aureus strains. App Env Microbiol 2000; 66(4) :1347-1353.
10. Strachan NJC, John PG, Milliar IG. Application of a rapid automated immunosensor for the detection of Staphylococcus aureus enterotoxin B in cream. Int J Food Microbiol 1997; 35: 293-297.
11. Omoe K, Ishikawa M, Shimoda Y, et al. Detection of seg, seh, and sei genes in Staphylococcus aureus isolates and determination of the enterotoxin productivities of S. aureus isolates harboring seg, seh, or sei genes. J Clin Microbiol, 2002; 40: 857-862.
12. Scherrer D, Corti S, Muehlherr JE, Zweifel C, Stephan R. Phenotypic and genotypic characteristics of Staphylococcus aureus isolates from raw bulk-tank milk samples of goats and sheep. Vet Microbiol 2004; 101: 101-107.
13. Jay JM. Staphylococcal gasteroenteritis, In: Modern Food Microbiology. 4th Edition, New York: Avi Book, 1992; 455-471.
14. Adwan G, Abu-Shanab B, Adwan K.Enterotoxigenic Staphylococcus aureus in raw milk in the North of Palestina. Türk J Biol 2005; 29: 229-232.
15. Rall VLM, Vieira FP, Rall R, et al. PCR detection of Staphylococcal enterotoxin genes in Staphylococcus aureus strains isolated from raw and pasteurized milk. Vet Microbiol 2008; 132: 408-413.
16. Erol İ, İşeri Ö. Staphylococal Enterotoksinler AÜ Vet Fak Derg 2004; 51: 239-245.
17. Sutherland J, Varnam A. Enterotoxin-producing Staphylococcus, Shigella, Yersinia Vibrio, Aeromonas and Plesiomonas. In: Blacburn CW, McClure J. (Editors). Foodborne Pathogens, Hazard, Risk Analysis and Control. Washington DC: CRC Press, 2002; 384-415.
18. Normanno G, Firinu A, Virgilio S, et al. Coagulase-positive Staphylococci and Staphylococcus aureus in food products marketed in Italy. J Food Microbiol, 2005; 98: 73-79.
19. Lindqvist R, Sylven S, Vagsholm I. Quantitative microbial risk assessement exemplified by Staphylococcus aureus in unripened cheese made from raw milk. Int J Food Microbiol 2002; 78: 155-170.
20. Cremonesi P, Vimercati C, Pisoni G, et al. Identification of enterotoxin genes in Staphylococcus aureus isolates from bovine and caprine milk. Vet Res Commun 2006; 30(1): 241-243.
21. Tkacikova L, Tesfaye A, Mikula I. Detection of genes for Staphylococcus aureus enterotoxin by PCR. Acta Vet 2003; 72: 627-630.
22. Gilligan K, Shipley M, Stiles B, Hadfield TL, Sofi IM. Identification of Staphylococcus aureus enterotoxins A and B genes by PCR-ELISA. Molecular and cellular probes 2000; 14: 71-78.
23. Anon. Gıda maddelerinde belirli bulaşanların maksimum seviyelerinin belirlenmesi hakkında tebliğ. Tebliğ No: 2008/26.
24. Vargun F, Vatansever L. Isolation of Staphylococci from milk and cream sold at the Kars market and detection of their enterotoxigenicity. Medycyna Wet 2007; 63(5): 538-540.
25. Anon. Ridascreen SET A,B,C,D,E Enzym Immunoassay for the detection of Staphylococcus enterotoxins. R-biopharm, 2008; Art No: R4101.
26. da Silva ER, Boechat JUD, da Silva N. Coagulase gene polymorphism of Staphylococcus aures isolated from goat mastitis in Brazilian dairy herds. Let Appl Microbiol 2005; 42: 30-34.
27. Küplülü Ö, Sarımehmetoğlu B, Kaymaz Ş. Pastörize sütlerde ELISA tekniği ile Stafilokokal enterotoksin varlığının belirlenmesi. Türk Vet Anim Sci 2002; 26: 631-637.
28. Boynukara B, Gulhan T, Alişarlı M, Gurturk K, Solmaz H. Classical enterotoxigenic characteristic of Staphylococcus aures strain isolated from bovine subclinical mastitis in Van, Turkey. Int J Food Microbiol 2008; 125: 209-211.
29. Umoh VJ, Adesiyun AA, Comwalk NE. Enterotoxigenity of Staphylococci isolated from raw milk obtained from settled and nomadic herds around Zaria, Nigeria, Revue Med Vet 1990;43(1):43-47.