Elazığ Yöresinde Pnömonili Sığır Akciğerlerinde Respiratorik Koronavirüs Viral Antijenlerinin İmmunohistokimya ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile Belirlenmesi

Bu çalışmada Elazığ bölgesindeki sığırlardan alınan pnömonili akciğer örneklerinde histopatolojik, immunohistokimyasal ve Reverz transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yöntemleriyle Sığır Koronavirüs (BCoV)’un varlığı ve yaygınlığının tespiti amaçlanmıştır. Makroskobik olarak pnömoni bulgusu gösteren 363 adet sığır akciğerlerinden alınan doku örnekleri histopatolojik olarak incelendi. Mikroskobik olarak intersitisyel pnömoni tespit edilen akciğerlerde; interalveoler septumlarda kalınlaşma, mononüklear hücre infiltrasyonu, bronş epitelinde deskuamasyon, bronşiyoalveolar lenfoid doku (BALT) hiperplazisi, bronşiolitis obliterans ve sinsityal hücre formasyonları kaydedildi. İntersitisyel pnömoni olarak değerlendirilen akciğerlere immunohistokimyasal ve PCR analizleri uygulandı. İmmunohistokimyasal olarak BCoV viral antijenlerine 24 akciğerde rastlandı. Viral antijenlere bağlı spesifik boyanma daha yoğun olarak bronş ve bronşiyol epitelinde, peribronşiyoalveolar lenfoid dokuda, daha az olmak üzere ise intersitisyel bölgedeki mononüklear hücrelerde, interalveolar boşluktaki makrofaj ve sinsityal hücrelerde ve bronşiyol lümenindeki hücresel eksudatta tespit edildi. Yine sadece intersitisyel pnömoni örneklerinde gerçekleştirilen PCR analizlerinde klinik örneklere ait amplikonlarda pozitiflik saptanmadı. Her reaksiyonda BCoV pozitif kontrollerine ait amplikonlarda beklenen büyüklükte DNA fragmentleri görüldü (406 bç uzunlukta).

In this study, it was aimed to determine the presence and prevalence of Bovine Corona Virus (BCoV) by histopathological, immunohistochemical and Reverse-transcription-polymerase chain reaction (PCR) methods in the lung samples with pneumonia taken from cattle in the Elazig region. Tissue samples taken from 363 cattle lungs showing signs of pneumonia macroscopically were examined histopathologically. In the lungs with microscopic interstitial pneumonia; Thickening of the interalveolar septum, mononuclear cell infiltration, desquamation of the bronchial epithelium, bronchioalveolar lymphoid tissue (BALT) hyperplasia, bronchiolitis obliterans and syncytial cell formations were recorded. Immunohistochemical and PCR analyzes were performed on the lungs that were evaluated as interstitial pneumonia. Immunohistochemically, BCoV viral antigens were detected in 24 lungs. Specific staining due to viral antigens was detected more intensely in the bronchi and bronchiolar epithelium, peribronchioalveolar lymphoid tissue, and to a lesser extent in mononuclear cells in the interstitial region, macrophage and syncytial cells in the interalveolar space, and cellular exudate in the bronchiolar lumen. No positivity was detected in the amplicons of clinical samples in PCR analyzes performed only on interstitial pneumonia samples. DNA fragments of the expected size (406 bp in length) were seen in the amplicons of the BCoV positive controls in each reaction.

Introduction

Sığır koronavirüsü (BCoV), Coronaviridae ailesinde yer alan bir lipid zarfa sahip, tek sarmallı, pozitif duyarlı ve en büyük RNA genomuna sahip bir patojendir[1]. BCoV’un fekal-oral ve solunum yoluyla bulaştığı, buzağılarda diyare, sığırlarda hemorajik ishal ile karakterize kış dizanterisi ve özellikle çeşitli yaş grubu besi sığırlarında solunum yolu enfeksiyonları şeklinde 3 farklı sendromdan sorumlu olduğu bildirilmiştir[2,3]. Son yıllarda insan ve hayvanlarda (yarasa, misk kedisi, rakun köpeği) enterik ve respiratorik enfeksiyonlarla ilişkili şiddetli akut solunum sendromu (SARS‐CoV‐2) ve Orta Doğu respiratorik sendromlarına (MERS) neden olan yeni korona virüs tipleri keşfedilmiştir[4-6].

Solunum sisteminde BCoV ilk defa 1993 yılında izole edilmiş ve nakil sonrası ortaya çıktığı bildirilmiştir[3,7]. BCoV'lar, enfekte sürülerde taşıyıcı hayvanların varlığı nedeniyle dünya genelinde yüksek bir prevalansa sahiptir [8,9]. BCoV üst solunum sistemi, akciğer ve bağırsak epitelini enfekte ederek, enterik form fekal-oral yolla, respiratorik form solunum yolu ile bulaşmaktadır[10-14]. Ek olarak, BCoV besi sığırlarında düşük büyüme performansına, Sığırların respiratorik hastalık kompleksi (BRDC) ile buzağılarda ölüme bağlı önemli ekonomik kayıplara ve hayvan refahının azalmasına neden olur[2,3,8,15]. Koronovirüs enfeksiyonlarında klinik olarak; ateş, ishal, rinitis, dispne, anoreksi, öksürük ve süt veriminde azalma bildirilmiştir[12,13,16,17]. BCoV ile enfekte sığırlarda makroskobik olarak kranial akciğer loblarında konsolidasyon, fibrinli plöritis ile trakea mukozasında peteşiyal kanama ve mukopurulent eksudat meydana geldiği saptanmıştır[18]. Mikroskobik olarak BCoV’ün solunum yollarında; trake epitelinde nekroz ve deskuamasyon, akciğerde bronşioler mononükleer hücre infiltrasyonu, BALT hiperplazisi, bronş ve bronşiol epitelinde nekroz ile karakterize intersitisyel veya fibrinonekrotizan pnömoni oluşumuna öncülük ettiği ortaya konmuştur [3,18-21].

Elazığ yöresindeki sığırlarda pnömoniye neden olan BCoV’e yönelik daha önceden yapılmış serolojik, immunohistokimyasal (IHC) ve PCR temelli bir çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışma ile Elazığ yöresindeki sığır pnömonilerinde BCoV’lerin tespiti, yaygınlığı ve bu etkenin rol oynadığı pnömonilerde histopatolojik, immunmohistokimyasal ve PCR bulguların ortaya konulması amaçlanmıştır.

Material and Method

Araştırma ve Yayın Etiği: Fırat Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu Başkanlığı tarafından 04/01/2017 tarih ve Karar No:01 ile çalışmanın mezbaha materyali ve ölü hayvan dokusu ile çalışıldığı için Etik Kurul Onayı almasına gerek olmadığı bildirilmiştir.

Elazığ bölgesinde yerel bir mezbahadan toplanılan 2054 sığır akciğeri incelendi. Makroskobik incelemede pnömoni bulgusu gösteren 363 adet sığır akciğerinden alınan doku örnekleri 2 parçaya ayrılarak bir kısmı histopatolojik ve immünohistokimyasal inceleme için tespit solüsyonuna alındı; diğer kısmı ise PCR analizleri için -80⁰C dondurucuda depolandı. Yüzde 10’luk tamponlu formaldehitte tespit edilen dokulardan parafin bloklar hazırlanarak, 5 mikron kalınlığında alınan kesitler Hematoksilen-Eosin yöntemi ile boyandı. Kesitler ışık mikroskobunda incelenerek histopatolojik bulgulara göre; intersitisyel, fibrinli, kataral-purulent ve granulomatöz olarak sınıflandırıldı. Sınıflandırma sonunda sadece intersitisyel pnömoni olarak değerlendirilen akciğerlere viral antijenlerin tespiti amacıyla RT-PCR deneyleri ve immunohistokimyasal boyama yapıldı.

İmmunohistokimyasal (IHC) Yöntem: IHC boyamada Avidin-Biotin Peroksidaz Kompleks (ABC) metodu, ilgili firmanın yöntemine göre uygulandı (Ultravision Detection System, Antipolyvalent, HRP/DAB, Thermo Sciencific, Cat No: TP-015-HD) . Parafin kesitler polylisinli lamlara alındıktan sonra 1 gece oda ısısında kurutan kesitler ksilol ve alkol serilerinden geçirilerek deparafinize ve dehidre edildi. Antijenik reseptörlerin açığa çıkarılması için 0.01 M sodyum sitrat içerisinde 20 dk inkube edilerek daha sonra PBS ile yıkanıp endojen peroksidaz aktivitesini engellemek için metil alkol ile hazırlanan %3 hidrojen peroksit içerisinde 10 dk inkübasyona bırakıldı. Nonspesifik bağlanmaları engellemek amacıyla %1 normal keçi serumunda 1 saat bekletildi. Ardından kesitler; üretici firma prosedürüne göre PBS ile anılan primer antikor (Monoklonal Mouse Bovine Korona virüs antikoru, Katalog No: BC6-4A, RTI Reagents) ile 1 gece süre ile 4⁰C’de inkübe edildi. Tekrar PBS’de yıkanan kesitler Biotinlenmiş sekonder antikor (Thermo Sciencific, Cat No: TP-015-BN) damlatılarak 10 dk sürede bekletildi. Ardından dokular PBS ile yıkanarak ve Streptavidin peroksidaz (Thermo Sciencific, Cat No: TS-015-HR) ile 10 dk süre ile muamele edildi. Renk ortaya çıkarıcı substrat olarak DAB (3,3'-Diaminobenzidine) (Thermo Sciencific, Cat No: TA-001-HCX) kullanıldı. Bu solüsyon kesitler üstüne uygulandıktan sonra renk değişikliği oluşmaya başladığı anda reaksiyon durdurularak, Mayer Hematoksilen ile 2 dk boyandıktan sonra alkol ve ksilol serilerinden geçirilerek entellan ile lamel kapatılarak ışık mikroskobunda incelendi.

RT-PCR Bulgularının Değerlendirilmesi: Örnekler: Histopatolojik olarak interstisyel pnömoni olarak değerlendirilen akciğer doku örneklerinde BCoV nükleik asitleri reverz transkriptaz-PCR yöntemi ile araştırıldı

RNA Ekstraksiyonu: Dokularından RNA ekstraksiyonu yapmak için Invitrogen doku RNA Ekstraksiyon kiti TRIzol (Katalog no: 15596026, Thermo Fisher, MA, ABD) kullanıldı ve kitin talimatı doğrultusunda RNA izolasyonları gerçekleştirildi.

Viral RNA’lardan komplementer DNA (cDNA) elde etmek amacıyla RevertAid First Strand cDNA kiti (Thermo Scientific, Almanya) kullanıldı ve üretici firmanın önerdiği şekilde yapıldı.

RT-PCR: BCoV için Cho ve ark.[2]’nın bildirdiği primerler ve yöntem, kullanılarak gerçekleştirildi (Tablo 1). PCR sonrası elde edilen ürünler agaroz jel elektroforez işlemine tabi tutulup UV ışık altında 406 bp büyüklüğündeki bantlar BCoV pozitif olarak değerlendirildi.

Tablo 1: BCoV PCR amplifikasyon ürünleri, primer dizileri ve uzunlukları[2]

Results

Makroskobik olarak pnömoni bulgusu gösteren 363 adet sığır akciğerinden alınan doku örnekleri ışık mikroskobunda incelenerek histopatolojik bulgulara göre; 159 intersitisyel (%43.80), 96 fibrinli (%26.45), 87 kataral-purulent (%23.97) ve 21’i granülomatöz (%5.78) olmak üzere sınıflandırıldı. İntersitisyel pnömonilerde interalveoler septumlarda kalınlaşma (Şekil 1A), mononüklear hücre infiltrasyonu, bronş epitelinde deskuamasyon, bronşiyoalveolar lenfoid doku (BALT) hiperplazisi, bronşiolitis obliterans genel histopatolojik değişimler olarak kaydedildi (Şekil 1B). Plöritisin eşlik ettiği pnömonilerde; alveol lümenlerinin yulaf hücreleri ve fibrinli eksudat ile dolu olduğu dikkati çekti. Kronik intersitisyel pnömoni olgularında ise alveol lümenlerinde nötrofil, alveoler makrofaj ve mononüklear hücre infiltrasyonu mevcuttu. Birkaç olguda ise bronşiyol ve alveolar boşluklarda sinsityal hücre formasyonları dikkati çekti (Şekil 1C).

IHC ile intersitisyel pnömoni olarak değerlendirilen 159 akciğer dokusundan; BCoV viral antijenlerine 24 (%15) akciğerde rastlandı. Viral antijenlerin genellikle lezyonlu alanlarda bulunduğu dikkati çekti. Viral antijenlere bağlı spesifik boyanma daha yoğun olarak bronş ve bronşiyol epiteli ile peribronşiyoler lenfoid dokuda dikkati çekti (Şekil 2A). Daha az olarak ise intersitisyel bölgedeki mononüklear hücrelerde, alveolar makrofaj ve bronşiyol lümenindeki hücresel eksudatta tespit edildi (Şekil 2B). Perivasküler mononüklear hücre infiltrasyonları ile bronşiyal bez epitelinde immunopozitivite mevcuttu. Ayrıca bronşiyol ve alveol lümenlerindeki sinsityal hücrelerde de pozitif boyanmalara rastlandı (Şekil 2C). Hafif şiddette BCoV pozitifliğine ise bronşa ait kıkırdak dokuda dikkati çekti.

İntersitisyel pnömoni örneklerinde gerçekleştirilen PCR analizlerinde doku kesitlerinden antijenik deteksiyon testlerinin yapılması sonrasında, BCoV antijeni taşıyan dokulardan TRIzol (Thermo Fisher, MA, ABD) reagent ile kitin talimatı doğrultusunda RNA izolasyonları gerçekleştirildi. Elde edilen RNA spektrofotometrede miktarlanarak BCov spesifik primerleri ile One Step RT-PCR master miksi (Qiagen, Hilden, Almanya) içeren RT-PCR karışımında templeyt olarak kullanıldı. Deney için ısı protokolleri referansta belirtildiği gibiydi. Fırat Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Anabilim Dalındaki pozitif kontroller ve negatif kontroller (templeytsiz PCR miks) RT-PCR aşamasında çalışmaya dahil edildi. Agaroz jel elektroforez aşamasında 100 bp DNA merdiveni (NEB, MA, ABD) ile eş zamanlı koşturulan klinik örneklere ait amplikonlarda pozitiflik saptanmadı. Her reaksiyonda BCoV pozitif kontrollerine ait amplikonlarda beklenen büyüklükte DNA fragmentleri görüldü (406 bç uzunlukta).

Discussion

Bu çalışma ile Elazığ ilindeki sığır pnömonilerinde BCoV’un varlığı ve yaygınlığı IHC ve RT-PCR yöntemleri kullanılarak araştırılmıştır. BCoV enfeksiyonları enfekte hayvan dokularında, sekresyonlarında veya dışkılarında enfektif virüs, viral antijen veya viral RNA saptanarak teşhis edildiği vurgulanmıştır[12]. BCoV ile ilişkili sindirim sistemi enfeksiyonlarında dışkı numunelerinde teşhis amacıyla en duyarlı test yöntemi RT-PCR olarak bildirilmiştir[7]. Solunum ve bağırsak dokularında viral antijenlerin tespiti amacıyla BCoV hiperimmün serumu ya da monoklonal antikorlar kullanılarak immünoflöresan veya IHC boyama yapılmaktadır[19]. Koronavirüslerin sindirim sistemine olan etkilerinin incelendiği birçok çalışma bulunmakla birlikte, IHC[19,20] ve immünofloresan[9,19,22] yöntemlerle virüsun solunum sisteminde yerleşimi gösteren çalışmalar sınırlıdır. BCoV’un sığır popülasyonlarında yüksek seropozitiflik düzeyleriyle (%82-90) seyrettiği bilinmektedir[23,24]. Ülkemizde sığırlarda BCoV enfeksiyonlarının varlığı farklı analizlerle daha önceden birçok çalışma ile ortaya konmuştur [12,25-29]. Sığırlarda BCoV seroprevalansı %4.4-100 arasında saptanırken[12,25-29], Diyarbakır ilinde 433 sığır üzerinde gerçekleştirilen bir çalışmada BCoV seropozitifliği %75.5 olarak tespit edilmiştir[24]. Sunulan çalışmada 159 intersitisyel pnömonili akciğer dokusunda %15 oranında IHC olarak BCoV antijenleri tespit edilmiştir. Diğer taraftan sığır akciğer örneklerinde RT-PCR ile yapılan virolojik analizlerde pozitif sonuç bulunamamıştır. Bu durum örneklenen hayvanlar arasında BCoV ilişkin viremi safhasında akut bir enfeksiyonun bulunmadığına yorumlanmıştır. Akut geçici doğal BCoV enfeksiyonlarında örneklerin hastalığın başlangıcında veya hemen sonrasında alınması gerektiği vurgulanmıştır[2,3]. Ek olarak Erzurum bölgesinde pnömonili sığırlardan alınan akciğer doku örneklerinde RT-PCR ile pozitiflik tespit edilmezken, nazal swab örneklerinde ise %20.4 oranında pozitiflik tespit edilmiştir[27].

Histopatolojik olarak BCoV’ün; akciğerde bronşioler mononükleer hücre infiltrasyonu, bronş ve bronşiol epitelinde nekroz, sinsityal hücre formasyonları ile karakterize intersitisyel pnömoni oluşumuna öncülük ettiği, daha önce yapılan doğal ve deneysel çalışmalarda ortaya konmuştur[3,18,22,30]. Sunulan çalışmada da akciğerde benzer histolojik lezyonlara rastlanılmıştır. BRDC’nin meydana gelmesinde solunum yolunu etkileyen birden fazla virüs ve bakteriyel patojenin katkıda bulunduğu; bu sendrom için ayırıcı tanının gerekli olduğu vurgulanmıştır[7]. Sığırlarda solunum yolunu etkileyen parainfluenza tip 3, respiratorik sinsityal virüs, herpes virüs tip 1, adeno virüs gibi viral enfeksiyonlarda[31] ve insanlarda SARS‐CoV‐2 ilişkili pnömonilerde akciğerde inklüzyon cisimcikleri tespit edilmiş[5], ancak sığırlarda BCoV etiyolojili pnömoni olgularında[32] ve sunulan çalışmada inklüzyon cisimciklerine rastlanmamıştır. Bu durum solunum yolunu etkileyen diğer viral ajanlarla BCoV kaynaklı pnömonilerin ayırıcı teşhisinde kullanılabilecek bir kriter olarak değerlendirilebilir.

Daha önceki çalışmalarda; BCoV ilişkili pnömonilerde IHC olarak viral antijenlere trake, bronş, bronşiyol ve alveol epitelinde, nazal, trake ve akciğer lümenine dökülmüş dejeneratif ve nekrotik epitelde rastlanmıştır [13,19,20,32,33]. Sunulan çalışmada da IHC ile akciğer dokusunda viral antijenlere önceki çalışmalara benzer dağılım gözlenmiş; ek olarak ise peribronşiyoler lenfoid doku, bronş bez epiteli, peribroşiyal kıkırdak doku ve sinsityal hücrelerde pozitiflik tespit edilmiştir.

Sonuç olarak, Elazığ yöresindeki sığırlarda pnömoni oluşumunda BCoV antijeni varlığının göz ardı edilemeyecek kadar yüksek oranda olduğu belirlenmiş ve özellikle besi sığırlarında BRDC’e göre alınacak koruma ve tedavi tedbirleri içerisinde bu viral ajana da yer verilmesinin gerekli olduğu düşünülmüştür. Özellikle sığırlarda çok etkenli BRDC durumlarında RT-PCR yöntemi ile RNA virüs antijenlerinin ortaya konulmasındaki güçlükler göz önüne alındığında, immunohistokimyasal yöntemin BCoV ilişkili pnömonilerin teşhisinde geçerli bir metot olarak kullanılabileceği kanaatine varılmıştır.

Tables

References

1. Saif LJ. A review of evidence implicating bovine coronavirus in the etiology of winter dysentery in cows: An enigma resolved? Cornell Vet 1990; 80: 303-311.
2. Cho KO, Hasöksüz M, Nielsen PR, et al. Cross-protection studies between respiratory and calf diarrhea and winter dysentery strains in calves and RT-PCR and nested PCR for their detection. Arch Virology 2001;146: 2401-2419.
3. Hasoksuz M, Hoet AE, Loerch SC, et al. Detection of respiratory and enteric shedding of bovine coronaviruses in cattle in an Ohio feedlot. J Vet Diagn Invest 2002;14: 308-313
4. Saif LJ, Jung K. Comparative pathogenesis of bovine and porcine respiratory coronaviruses in the animal host species and SARS-CoV-2 in humans. J Clin Microbiol 2020; 58: 3291-3298.
5. Zeng Z, Xu L, Xie XY, et al. Pulmonary pathology of early-phase COVID-19 pneumonia in a patient with a benign lung lesion. Histopathology 2020; 77: 823-831.
6. Vlasova NA and Saif LJ. Bovine coronavirus and the associated diseases. Frontiers in Veterinary Sciences 2021; 8: 643220
7. Saif, LJ. Bovine respiratory coronavirus. Vet Clin N Am Food Anim Pract 2010; 26: 349-364.
8. Clark MA. Bovine coronavirus. Br Vet J 1993; 149: 51-70.
9. Saif, LJ, Redman DR, Morehead PD, et al. Experimental coronavirus infections in calves: Viral replication in the respiratory and intestinal tracts. Am J Vet Res 1986; 47: 1426-1432.
10. Alkan F, Özkul A, Karaoğlu T, ve ark. Sığırlarda viral nedenli solunum sistemi enfeksiyonlarının seroepidemiyolojisi. Ankara Üniv Vet Fak Derg 1997; 44: 1-8.
11. Alkan F. Buzağı ishallerinde rotavirus ve coronavirusların rolü. Ankara Üniv Vet Fak Derg 1998; 45: 29-37.
12. Hasöksüz M. Kayar A. Dodurka T, et al. Detection of respiratory and enteric shedding of bovine coronaviruses in cattle in Northwestern Turkey. Acta Veterinaria Hungarica 2005; 53: 137-146.
13. Park SJ, Kim GY, Choy HE, et al. Printed in The Netherlands Dual enteric and respiratory tropisms of winter dysentery bovine coronavirus in calves. Arch Virol 2007; 152: 1885-1900.
14. Nicola D, Campolo M, Desario C, et al. Respiratory disease associated with bovine coronavirus infection in cattle herds in Southern Italy. Vet Diagn Invest 2008; 20: 28-32.
15. Zhu Q, Li B, Sun D. Advances in bovine coronavirus epidemiology. Viruses 2022; 14: 1109.
16. Storz J, Purdy CW, Lin X, et al. Isolation of respiratory bovine coronavirus, other cytocidal viruses, and Pasteurella spp from cattle involved in two natural outbreaks of shipping fever. J Am Vet Med Assoc 2000; 216: 1599-1604.
17. Alkan F, Bilge DS, Can ŞK, ve ark. Sığırlarda coronavirus enfeksiyonunun epidemiyolojisi. Ankara Üniv Vet Fak Derg 2003; 50: 59-64.
18. Hick PM, AJ Read, I Lugton, et al. Coronavirus infection in intensively managed cattle with respiratory disease. Australian Veterinary Journal 2012; 90: 381-386.
19. Heckert RA, Saif LJ. Hoblet KA, et al. A longitudinal study of bovine coronavirus enteric and respiratory ınfections in dairy calves in two herds in Ohio. Vet Microbiol 1990; 22: 187-201.
20. Soules KR, Rahe MC, Purtle L, et al. Bovine coronavirus infects the respiratory tract of cattle challenged intranasally. Front Vet Sci 2022; 9: 878240.
21. Storz J, Stine L, Liem A, et al. Coronavirus isolation from nasal swabs samples in cattle with signs of respiratory tract disease after shipping. J Am Vet Med Assoc 1996; 208: 1452-1454.
22. Hansa A, Rai RB, Wani MY, et al. Patholology and diagnosis of corona virus infection in bovine. Indian J Vet Pathol 2012; 36: 129-135.
23. Suzuki T, Otake Y, Uchimoto S, et al. Genomic characterization and phylogenetic classification of bovine coronaviruses through whole genome sequence analysis. Viruses 2020; 12: 183.
24. Kadiroğlu B, Aytoğu G, Yeşilbağ K. Diyarbakır ilinde yetiştirilen ruminantlarda solunum sistemi viruslarının seroprevalansı ve pestivirus varlığının araştırılması. J Res Vet Med 2020; 39: 26-33.
25. Okur GS, Yazıcı Z, Albayrak H, et al. Rotavirus and coronavirus prevalence in healthy calves and calves with diarrhea. Medycyna Wet 2007; 63: 62-64.
26. Alkan F, Ozkul A, Dagalp BS et al. The detection and genetic characterization based on the S1 gene region of BCOVs from respiratory and enteric infections in Turkey. Transboundary and Emerging Diseases 2011; 58: 179-185.
27. Timurkan MA, Aydın H, Belen S. Erzurum bölgesinde sığırlarda respiratorik coronavirus enfeksiyonunun RT-PCR ile tespiti ve moleküler karakterizasyonu. Atatürk Üniv Vet Bil Derg 2015; 10: 186-192.
28. Yavru S, Yapıcı O, Kale M, et al. Bovine coronavirus (BoCV) infection in calves with diarrhoea and their dams. Acta Sci Vet 2016; 44: 1-7.
29. Yıldırım Y, Dağalp SB, Tan M, et al. Seroprevalence of the rotavirus and corona virus infections in cattle. J Anim Vet Adv 2008; 7: 1320-1323.
30. Amoroso MG, Lucifora G, Degli UB, et al. Fatal interstitial pneumonia associated with bovine coronavirus in cows from Southern Italy. Viruses 2020; 12: 1331.
31. Çeribaşı AO, Özkaraca M, Çeribaşı S, et al. Histopathologic, immunoperoxidase and immunofluorescent examinations on natural cattle pneumonia originated from Parainfluenza type 3, Respiratory Syncytial virus, Adenovirus type 3 and Herpesvirus type 1. Rev Med Vet 2014; 165: 201-212.
32. Kalkanov I, Dinev I, Todorova K, et al. Ultrastructural and immunohistochemical investigations in calves with Coronavirus pneumoenteritis syndrome. Kafkas Univ Vet Fak Derg 2018; 24: 791-797.
33. Rahe MC, Drew RM, Thrush GJ, et al. Bovine coronavirus in the lower respiratory tract of cattle with respiratory disease. J Vet Diag Invest 2022; 34: 482-488.