Tayleriyozisli Sığırlarda Antioksidan Parametrelerdeki Değişiklikler

Bu çalışma, tayleriyozisli sığırlarda oksidatif stres parametrelerindeki değişiklikleri belirlemek amacıyla yapılmıştır. Araştırmada materyal olarak hematokrit değerlerine göre iki eşit gruba ayrılmış 20 adet tropikal tayleriyozisli sığır ile 10 adet klinik olarak sağlıklı sığır kullanılmıştır. Çalışmadaki tüm sığırlarda eritrosit lipid peroksidasyonu, plazma katalaz, glutathiyon peroksidaz (GSHPx), vitamin E ve vitamin C düzeyleri belirlenmiştir. Çalışmada, kontrol grubuyla hasta gruplar arasında vitamin E (p<0.05), vitamin C (p<0.05), MDA (P<0.01), katalaz (P<0.01) ve glutatiyon peroksidaz (P<0.001) gibi oksidatif parametrelerde önemli derecede farklılıklar belirlenmiştir. Sonuç olarak, Theileria annulata ile enfekte sığırlarda CAT, GSHPx, vitamin E ve vitamin C’nin azalması ve MDA düzeylerindeki artışlar hastalıkta oksidatif stresin geliştiğinin göstergesi olarak belirlenmiştir.

The study was conducted to detect the changes of oxidative stress parameters in cattle with Theileriosis. In this study, 20 cattle with tropical theileriosis, divided into 2 equal groups in according to their heamatocrit values, and 10 healthy cattle were used. The erythrocyte lipid peroxidation, plasma catalase, glutathione peroxidase, vitamin E, and vitamin C levels were determined in all groups cattle. The significantly differences between control and sick cattle was determined in oxidative stres parameters such as vitamin E (p<0.05), vitamin C (p<0.05), MDA (P<0.01), catalase (P<0.01) and glutathione peroxidase (P<0.001). In conclusion, the decrease of CAT, GSHPx, vitamin E, and vitamin C, and the increase of MDA in the cattle of theileriosis was determined that the indicator of oxidative stres during disease.

Giriş

Theileria annulata’nın neden olduğu tropikal tayleriyozis, ülkemizde görülen en önemli sığır hastalıklarından birisidir[1]. Hastalığa karşı kültür ırkı hayvanlar yerli ırk hayvanlara göre daha duyarlı olup, hastalık özellikle yüksek verimli hayvanlarda verim kayıplarına ve ölümlere neden olmaktadır[2-4]. Hastalığın klinik semptomları konakçının duyarlılığına, yaşına ve etkenin patojenitesine göre değişiklik gösterir[2]. Klinik semptomlar genel olarak vücut ısısında artış, lenf yumrularında büyüme, mukozalarda solgunluk, peteşiyel kanamalar, anemi ve zayıflama şeklinde ortaya çıkar[3,5].

Serbest radikal terimi, yapısında en az bir tane eşleşmemiş elektron bulunduran atom veya molekülleri tanılamada kullanılan genel bir terimdir[6]. Aslında çoğu güçlü toksik etkili olan serbest radikaller normal metabolik faaliyetler sırasında üretilmekte ve bu radikallerin bazı fizyolojik olaylarda yararlı etkileri bulunmaktadır[7,8]. Organizma oksidanlara karşı etkili olan bazı savunma sistemlerine de sahiptir. Bu sitemde başlıca antioksidan enzimler ve zincir kıran antioksidanlar yer almaktadır. Katalaz, glutatiyon peroksidaz, yağda çözünen vitamin E ve suda çözünen vitamin C bu sistemin önemli elemanlarındandır[6,7,9]. Oksidatif stresin gelişip gelişmediğinin belirlenmesinde lipid peroksidasyonun (malondialdehid konsantrasyonunun, MDA) belirlenmesi en yaygın kullanılan metoddur[10]. Oksidatif stres terimi hücrelerdeki oksidant / antioksidan maddeler arasındaki güçlü dengenin oksidanlar lehine kayması durumunu ifade eder. Sonuçta hücresel yapılarda oksidan maddeler birikerek çeşitli fizyolojik olayların aksamasına neden olurlar[11,12].

Bu çalışma, tayleriyozisli sığırlarda antioksidan parametrelerde ne gibi değişikliklerin olduğunu belirlemek amacıyla yapılmıştır.

Gereç ve Yöntem

Araştırmanın materyalini F.Ü. Veteriner Fakültesi Hayvan Hastanesi İç Hastalıkları Kliniğine muayene ve tedavi için getirilen 20 adet tayleriyozisli sığır ile 10 adet klinik olarak sağlıklı sığır (Kontrol) oluşturmuştur. Tayleriyozisli sığırlar hematokrit değerlerine göre 2 ayrı gruba ayrılmış ve 1. grubu hematokrit değeri %15-20 arasında (G1), 2. grubu ise hematokrit değeri %10-15 arasında (G2) olan 10’ar adet sığır oluşturmuştur. Çalışmada kullanılan hiçbir hayvan Theileria annulata’ya karşı aşılanmamıştır. Detaylı klinik muayeneleri yapılan tüm hayvanlardan tekniğine uygun olarak kulak uçlarından alınan kan ile yayma preparatlar hazırlanmış,Giemsa ile boyanmış ve ışık mikroskobunda immersiyon objektifi ile incelenen frotilerde Theileria annulata’nın piroplazm formlarının görülmesi ile hastalık teşhis edilmiştir.

Tayleriyozis saptanan hayvanlar ile kontrol hayvanlarının v. jugularis’lerinden 10’ar ml EDTA’lı kan örneği alınmış, 3000 rpm’de 5 dk santrifüj edilerek plazmaları çıkarılmış ve analizlerde kullanılmak üzere -20oC’de saklanmıştır. Ayrıca plazmalar alındıktan sonra geriye kalan eritrosit kısmı 3 kez %0.9’luk NaCl solüsyonuyla yıkanmış, daha sonra 1 kısım eritrosit süspansiyonu 9 kısım distile su ile karıştırılarak %10’luk eritrosit hemolizatı elde edilmiştir. Bu hemolizat lipid peroksidasyonun tayininde kullanılmıştır. Lipid peroksidasyonu Placer ve ark.’nın[13]; plazma katalaz (CAT) tayini Goth[14] ve plasma glutathiyon peroksidaz (GSHPx) tayini Lawrance’ın[15] kullandığı metoda göre tayin edilmiştir. Antioksidan vitaminlerden olan vitamin E düzeyleri Martinek[16] ve vitamin C düzeyleri Kyaw[17] tarafından tayin edilen fosfotungustik asit metodu kullanılarak spektrofotometrik olarak belirlenmiştir.

İstatistiksel analizler SPSS Ms Windows Release 10.0 programı yardımıyla, bağımsız t-testi kullanılarak yapılmıştır.

Bulgular

Tayleriyozisli sığırlar ile kontrol grubu hayvanlarda saptanan oksidatif stres parametreleri ile bulguların gruplar arasındaki istatistiksel önem dereceleri Tablo 1’de gösterilmiştir.

Çalışmada, vitamin E bakımından kontrol grubuyla hasta gruplar arasında önemli derecede (p<0.05) fark belirlenmiştir. Vitamin C bakımından ise hem kontrol grubu ile hasta gruplar arasında, hem de grup 1 ile grup 2 arasında önemli derecede (p<0.05) fark saptanmıştır (p<0.01, p<0.001). Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında hasta gruplarda MDA düzeylerinin önemli derecede (P<0.01) artış gösterdiği, buna rağmen katalaz (P<0.01) ve glutatiyon peroksidaz (P<0.001) aktivitelerinin önemli derecede azaldığı belirlenmiştir.

Tartışma

Oksidatif stres, birçok hastalıkta sekunder olarak hastalığın şiddetini artıran bir özelliğe sahiptir. Şayet oksidatif strese karşı organizmanın sahip olduğu savunma mekanizmaları yetersiz kalırsa, hücrelerde oksidatif hasar gelişerek birçok önemli fonksiyonun aksamasına neden olacaktır[18,19].

Lipid peroksidasyonu, başlıca doymamış yağ asitlerinin oksidasyonunu ifade eden ve enzimatik olmayan bir zincir reaksiyonudur[20]. Organizmada oksidatif stresin varlığı başlıca lipid peroksidasyonu olarak bilinen süreçte son ürün olarak oluşan malondialdehid (MDA) düzeylerinin belirlenmesiyle ortaya konmaktadır. Artmış MDA düzeyleri oksidatif stresin önemli belirtisidir[10,20].

Eritrosit membranı çok zincirli doymamış yağ asitleri bakımından zengin olduğundan lipid peroksidasyona çok duyarlıdır[21,22]. Bu çalışmada eritrosit MDA düzeylerinde hasta gruplarda saptanan artmış düzeyler, hastalık esnasında oksidatif stresin geliştiğinin göstergesidir. Katalaz ve glutatiyon peroksidaz düzeylerindeki azalmalar ise hastalık esnasında gelişen radikal artışını nötralize etmek için bu enzimlerin yoğun kullanıldıklarının göstergesidir. Aneminin daha şiddetli olduğu 2. grupta MDA düzeyindeki artış ile CAT ve GSHPx düzeylerindeki azalmanın 1. gruba nazaran daha şiddetli olması, hastalığın dönemi gözetilmeksizin, oksidatif stresin bu grupta daha şiddetli geliştiğinin göstergesidir. Bu bağlamda artan oksitaif stres sonucu oluşan radikallerin eritrosit membranında neden olabileceği yapısal değişikliklerin, aneminin gelişimine sekunder olarak katkıda bulunabileceğini söylemek mümkündür. Çünkü yapısal olarak değişikliğe uğramış eritrositler eritrofagositoz olarak bilinen işlemle makrofajlar tarafından vücuttan uzaklaştırılırlar ve bu durum şiddetli olursa anemiye neden olur[22,23]. Friedman[24] oksidatif stresin eritrositlerde hasara neden olduğunu bildirmiştir. Çalışmada tayleriyozisli sığırların MDA düzeylerinde saptanan önemli artışlar, benzer çalışmaların[23,25] sonuçlarıyla uyumlu bulunmuştur.

Vitamin E (alfa tokoferol formunda) biyolojik membranlardaki lipoproteinleri oksidasyondan koruyan en önemli yağda çözünen antioksidandır[7,26,27]. Bunun yanı sıra vitamin C (askorbik asit) ise biyolojik sıvılardaki en güçlü suda eriyen zincir reaksiyonlarını kıran antioksidandır[28]. Lipid peroksidasyonu önlemede vitamin E ile vitamin C arasındaki sinerjizm iyi bilinmektedir. Vitamin C, vitamin E’nin antioksidan etkisini artırırken organizmada düzeylerinin azalmasını da önlemektedir[26,29]. Her ne kadar ruminantlar kendi ihtiyaçları olan düzeyde vitamin C sentezleyebilseler de, ruminal mikroflora tarafından vitamin C’nin yıkımlanması nedeniyle zaman zaman yetersizlikler oluşabilmektedir[30]. Bu çalışmada zincir kıran antioksidanlardan olan vitamin E ve C’nin hasta gruplardaki düzeyleri kontrollere nazaran önemli derecede düşük saptanmıştır. Bu azalmaların nedeninin, yine bozulmuş olan oksidan dengeyi dengelemek adına bu vitaminlerin yoğun kullanımıyla alakalı olduğu düşünülmektedir.

Sonuç olarak, Theileria annulata ile enfekte sığırlarda plazmadaki antioksidanların (CAT, GSHPx, vitamin E ve vitamin C) azalması ve eritrosit MDA düzeylerindeki artışlar hastalıkta oksidatif stresin geliştiğinin önemli göstergeleridir. Ayrıca oksidatif stres, direk olarak olmasa da, birçok olayda hastalığın şiddetini artıran sekunder faktör olarak etkidiğinden bu tip hastalıklarla mücadele planlanırken oksidatif stresin göz ardı edilmemesinin gerektiği düşünülmektedir.

References

1. Sayın F, Dinçer S, Karaer Z, ve ark. Studies of the epidemiology of Tropical theileriosis (Theileria annulata infection) in cattle in central Anatolia, Turkey. Tropical Anim Health Product 2003; 35: 521-539.
2. Gill BS, Bhattacharyulu Y, Kaur D. Symptoms and pathology of experimental bovine tropical theileriosis (Theileria annulata infection). Annal Parasitol 1977; 52: 597-608.
3. Omer OH, El-Malik KH, Mahmoud OM, et al. Haematological profiles in pure breed cattle naturally infected with Theileria annulata in Saudi Arabia. Vet Parasitol 2002; 107: 161-168.
4. Girewall A, Ahuja JS, Singha SPS, Chaudhary KC. Status of lipid peroxidation, some antioxidant enzymes and erythrocytic fragility of crossbred cattle naturally infected with Theileria annulata. Vet Res Commun 2005; 29: 387-394.
5. Forsyth LMG, Minns FC, Kirvar E, et al. Tissue damage in cattle infected with Theileria annulata accompanied by methastasis of cytokine-producing schizont-infected mononuclear phagocytes. J Comp Pathol 1999; 120: 39-57.
6. Machlin LJ, Bendich A. Free radical tissue damage: Protective role of antioxidant nutrients. Faseb J 1987; 1: 441-446.
7. Gutteridge JMC, Hallivell B. The measurement and mechanism of lipid peroxidation in biological systems. Trends Biochem Sci 1990; 15(4): 129-135.
8. Kohen R, Nyska A. Oxidation of biological systems: Oxidative stres phenomena, antioxidants, redox reactions, and methods for their quantification. Toxicol Pathol 2002; 30: 620-650.
9. Osada H, Watanabe Y, Nishimura Y, et al. Profile of trace element concentrations in the feto-placental unit in relation to fetal growth. Acta Obstet Gynecol Scan 2002; 81: 931-937.
10. Moore K, Roberts LC. Measurement of lipid peroxidation. Free Radic Res 1998; 28: 659-671.
11. Evans PH. Free radicals in brain methabolism and pathology. Br Med Bull 1995; 49: 577-587.
12. Lightbody JH, Stevenson LM. Jackson F, Donaldson K, Jones DG. Comparative aspects of plasma antioxidant status in sheep and goats, and the influence of experimental abomasal nematoda infection. J Comp Pathol 2001; 124 (2-3): 192-199.
13. Placer AZ, Linda LC, Johnson B. Estamination of product of lipid peroxidation (Malonlydialdehyde) in biochemical systems. Anal Biochem 1966; 16: 359-364.
14. Goth L. A simple method for determination of serum catalase activity and revision of reference range. Clin Chim Acta 1991; 196: 143-152.
15. Lawrence RA, Burk RF. Glutathione peroxidase activity in selenium-deficient rat liver. Biochem Biophys Res Commun 1976; 71: 952-958.
16. Martinek RG. Method for determination of vitamin E (total tocopherols) in serum. Clin Chem 1964; 10: 1078-1086.
17. Kyaw A. A simple colorimetric method for ascorbic acid determination in blood plasma. Clin Chim Acta 1978; 16: 151-157.
18. Gutteridge JMC. Free radicals in disease processes: A compilation of cause and consequence. Free Radic Res Commun 1993; 19(3): 141-158.
19. Kızıl O, Özdemir H, Karahan M, Kızıl M. Oxidative stres and alterations of antioxidant status in goats naturally infected with mycoplasma agalactia. Rev Med Vet 2007; 158 (6): 326-330.
20. Castillo C, Hernandez J, Lopez-Alonso M, Miranda M, Benedito JL. Values of plasma lipid hydroperoxides and total antioxidant status in healthy dairy cows: Preliminary observations. Arch Anim Breed 2003; 46: 227-233.
21. Devasena T, Lalitha S, Padma K. Lipid peroxidation, osmotic fragility and antioxidant status in children with acute post-streptococcal glomerulonephritis. Clin Chim Acta 2001; 308(1-2): 155-161.
22. Grewal A, Ahuja CS, Singha SPS, Chaudhary KJ. Status of lipid peroxidation, some antioxidant enzymes and erythrocytic fragility of crossbred cattle naturally infected with Theileria annulata. Vet Res Commun 2005; 29: 387-394.
23. Saluja PS, Gupta SL, Malhotra DV, Ambawat HT. Status of plasma malondialdehyde in experimental T. annulata infection in cross bred bovine calves. Indian Vet J 1999; 76: 379-381.
24. Friedman MJ. Oxygen damage mediates variant red cell resistance to malaria. Nature 1979; 280; 245-247.
25. Naziroğlu M, Saki CE, Sevgili M. The effect of buparvaquone treatment on the levels of some antioxidant vitamins, lipid peroxidation and glutathione peroxidase in cattle with Theileriosis. J Vet Med 1999; 46: 233-239.
26. Leung HW, Vang MJ, Mavis RD. The cooperative interaction between vitamin E and vitamin C in suppression of peroxidation of membrane phospholipids. Biochim Biophys Acta 1981; 664: 266-272.
27. Vannucchi H, Jordoa-Junior AA, Iglessias AC, Morandi MV, Chiarello PG. Effects of different diatery concentrations of vitamin E on lipid peroxidation in rats. Arch Latinoam Nutr 1997; 47: 34-37.
28. Doba T, Burton GW, Ingold KU. Antioxidant and co-antioxidant activity of vitamin C. The effect of vitamin C, either alone or in the presence of vitamin E or a water soluble vitamin E analogue, upon the peroxidation of aqueous multilamellar phospholipids liposomes. Biochim Biophys Acta 1985; 835: 298-303.
29. Niki E, Saito T, Kawakami A, Kamiya Y. Inhibition of oxidation of methyl linoleate in solution by vitamin E and vitamin C. J Biol Chem 1984; 259: 4177-4182.
30. Madanat A, Zendulkova D, Pospisil Z. Contagious agalactia af sheep and goats: A review. Acta Vet 2001; 70: 403-412.