RİNDERPEST VİRÜSÜ (RPV) HEMAGLÜTİNİN (H) GENİNİN KLONLANMASI VE BAKTERİYEL AÇIKLANMASI*

Bu çalışmada, sığır vebası virüsünün (RPV) hemaglütinin (H) proteinini şifreleyen gen segmenti klonlanmış ve klonlanan gen segmentinden H proteinin Escherichia coli’de açıklanması gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla, Rinderpest Bovine O Kabete (RBOK) suşu ile infekte edilen Vero hücrelerinden toplam RNA izole edilmiş ve tersine transkripsiyon yöntemiyle viral RNA, cDNA haline getirilmiştir. Daha sonra, RPV gen segmentine özgül primerler kullanılarak gerçekleştirilen polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ile H genine karşılık gelen segment çoğaltılmıştır. Çoğaltılan gen segmentinin %1.5’luk agaroz jelde büyüklüğü tespit edilmiş ve yaklaşık 1830 baz ikilisi uzunluğunda olduğu gözlenmiştir. Çoğaltılan gen segmenti prokaryotik açıklama vektörü olan pEZZ18 içine yerleştirilmiştir. Ortaya çıkan rekombinant plazmid (pRPVH4) içinde RPV H geni nükleotid dizgisinin bulunduğu PCR amplifikasyon ve restriksiyon endonükleaz analizi ile doğrulanmıştır. Rekombinant plazmid, E. coli transformasyonunda kullanılmıştır. Transforme edilen E.coli’nin salgıladığı rekombinant H proteini affinitte kromatografisi ile saflaştırılmış ve sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi ile belirlenmiştir. Bu testlerde yaklaşık 65 kDa büyüklüğünde ve tek protein bandı halinde H proteini Coomassie Brillant mavisi boyama metoduyla tespit edilmiştir. Daha sonra gerçekleştirilen immünoblot yöntemiyle de rekombinant H proteininin immünolojik olarak kimliklendirilmesi yapılmış ve rekombinant H proteinin RPV’ye karşı hiperimmünize edilen tavşan serumuyla tepkime verdiği gösterilmiştir.

SUMMARY: In this study, cloning and prokaryotic expression of rinderpest virus (RPV) hemagglutinin gene was reported. For this purpose, Vero cells were infected with Bovine O Kabete (RBOK) strain of RPV and total RNA was isolated at the height of the infection. Reverse transcription was carried out with random primers and viral cDNA was obtained. Hemagglutinin specific primers were used in polymerase chain reaction (PCR). Later, PCR amplified H gene segment was electrophoresed on 1,5% agarose gel and was found to be approximately 1830 base pair long. Hemagglutinin gene segment was cloned into the prokaryotic expression vector pEZZ18 and the resulting plasmid pRPVH4 was used in transforming Escherichia coli. Cloned H gene segment was subjected to restriction endonuclease analysis in order to confirm the identity of H gene and it was noticed that the product contained the unique restriction endonuclease sites present in the published H sequences of RPV. Recombinant H protein synthesized and secreted by E.coli was purified over affinity chromatography and electrophoresed on sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Recombinant H protein was observed as a 65 kDa protein in Coomassie Brillant blue staining. Furthermore, in Western immunoblot experiments, recombinant H protein was identified with RPV hyperimmune rabbit serum.

* This work was supported by a grant from the Turkish State Planning Organisation (Devlet Planlama Teşkilatı, Proje No: 95K120370)